吳峰，劉建彬，胡澤斌

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采用細胞質(zhì)特異性定位的熒光探針觀察細胞多核化現(xiàn)象

吳峰，劉建彬，胡澤斌

100142 北京，空軍航空醫(yī)學研究所（吳峰）；100142 北京，空軍總醫(yī)院臨床檢驗中心（劉建彬）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所（胡澤斌）

細胞多核化是指一個細胞的細胞質(zhì)中同時存在兩個或多個細胞核[1-5]。細胞多核化現(xiàn)象的產(chǎn)生通常是由于處于基因組復制中的細胞，其染色體運動發(fā)生異常，形成了不同大小的細胞核。這些大小不一的細胞核均被核膜包裹，對于比較小的細胞核，通常稱為微核或核片段。細胞多核化現(xiàn)象既存在于病理狀態(tài)的細胞，也可以存在于生理狀態(tài)的細胞中。研究發(fā)現(xiàn)：細胞多核化現(xiàn)象與多種疾病相關(guān)。病理檢驗中發(fā)現(xiàn)多核化的巨型細胞的存在與慢性炎癥有關(guān)[6-7]。另外，細胞多核化提示細胞染色體的不穩(wěn)定，所以細胞多核化現(xiàn)象也頻繁出現(xiàn)在腫瘤細胞中[8-9]。

目前細胞多核化現(xiàn)象的評估主要是采用細胞核染色的方法[1-2, 5]。對于固定好的細胞，細胞核染料，如吉姆薩、蘇木精，可以將細胞核染色，細胞質(zhì)基本沒有著色，從而可以觀察到細胞質(zhì)中是否存在多個細胞核的現(xiàn)象。但是，這種方法觀察到的細胞邊緣往往模糊不清，難以判斷幾個細胞核是位于同一個細胞還是相鄰細胞中。對于活細胞中多核化現(xiàn)象的觀察，則通常采用細胞核熒光染料，如 DAPI、Hoechst，將活細胞細胞核染色。通過細胞核熒光染色的圖片與明場中的細胞圖像進行疊加，可以確定多個細胞核是否位于一個細胞內(nèi)。缺點同樣是明場中細胞的邊界不是很清楚，邊緣難以判斷[9]。

細胞質(zhì)特異性定位的熒光探針（cytoplasm localized fluorescent probe，CLFP）是指一類能夠特異性聚積在活細胞細胞質(zhì)中的熒光染料[1, 10-15]。將活細胞與 CLFP 探針進行孵育，在熒光顯微鏡下能夠清晰地觀察到細胞質(zhì)的熒光形態(tài)以及細胞質(zhì)的邊緣形態(tài)。近年來，CLFP 探針已經(jīng)被逐步地應(yīng)用于各種細胞成像研究中。本研究中，我們根據(jù)文獻設(shè)計合成新的 CLFP 探針，并且建立了通過熒光影像方法區(qū)分細胞多核化現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

色譜用層析硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品，其余化學試劑和溶劑購自北京偶合科技有限公司和北京伊諾凱科技有限公司，均為市售分析純產(chǎn)品。核磁共振儀為 Bruker AVANCEIII 400，中壓純化色譜儀為 Biotage Isolera One，高分辨質(zhì)譜儀為 Thermo Exactive Orbitrap plus。細胞培養(yǎng)箱購自昆山一恒儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CLFP 探針的化學合成 根據(jù)文獻報道，我們采用常用的熒光母核 Boron-dipyrromethene（BODIPY）設(shè)計了一系列細胞質(zhì)特異性定位的熒光探針，其合成路線如圖 1 所示[1, 16-18]。

1.2.1.1 中間體 3 的合成 2,4-二甲基吡咯 1（200 mg，2.1 mmol）被 30 ml 無水二氯甲烷溶解后，加入 4-氯甲基苯甲酰氯 2（200 mg，1.05 mmol），在氬氣保護下室溫攪拌10 min，之后加熱至 50 ℃攪拌 2 h。冷卻后真空蒸餾出大部分溶劑，向母液中加入 30 ml 無水甲苯和 5 ml 無水二氯甲烷，室溫攪拌 10 min 后，加入三乙胺（505 mg，5 mmol）和三氟化硼乙醚溶液（760 mg，5 mmol），之后加熱至 50 ℃攪拌 2 h。反應(yīng)結(jié)束后，真空蒸餾出大部分溶劑，加入乙酸乙酯 300 ml，再用飽和 NaCl 溶液洗至中性，有機相用無水 Na2SO4進行干燥。之后通過中壓純化色譜儀分離出70 mg 中間體 3，收率 18%。

1 2 3 4 5

1.2.1.2 CLFP-1 的合成 將中間體 3（50 mg，0.13 mmol），Cs2CO3（87 mg，0.26 mmol）和 KI（45 mg，0.26 mmol）溶解于 30 ml 無水乙腈中，再加入正丁胺（95 mg，1.3 mmol），氬氣保護下室溫攪拌 10 min，再升溫至 80 ℃攪拌 2 h。反應(yīng)結(jié)束后，真空蒸餾出大部分溶劑，加入乙酸乙酯 200 ml，再用飽和 NaCl 溶液洗至中性，有機相用無水 Na2SO4進行干燥，之后通過中壓純化色譜儀分離出目標化合物。最后將產(chǎn)物經(jīng)過氯化氫的二氯甲烷溶液制備成鹽酸鹽，得到 30 mg CLFP-1，收率 57%。

1.2.1.3 CLFP-2 的合成 將中間體 3（50 mg，0.13 mmol），Cs2CO3（87 mg，0.26 mmol）和 KI（45 mg，0.26 mmol）溶解于 30 ml 無水乙腈中，再加入戊胺（113 mg，1.3 mmol），氬氣保護下室溫攪拌 10 min，再升溫至 80 ℃攪拌 2 h。反應(yīng)結(jié)束后，真空蒸餾出大部分溶劑，加入乙酸乙酯 200 ml，再用飽和 NaCl 溶液洗至中性，有機相用無水 Na2SO4進行干燥，之后通過中壓純化色譜儀分離出目標化合物。最后將產(chǎn)物經(jīng)過氯化氫的二氯甲烷溶液制備成鹽酸鹽，得到 48 mg CLFP-2，收率 80%。

1.2.2 CLFP 探針的細胞定位研究 將 HepG2 細胞接種于 24 孔細胞培養(yǎng)板中，當細胞覆蓋了培養(yǎng)板的 50%。將上述合成的探針加入到培養(yǎng)基中至終濃度為 1.0 μmol/L。在 37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育大約 20 min 后，用 PBS 緩沖液清洗沒有吸收的熒光探針。在熒光顯微鏡下，采用藍光激發(fā)，觀察細胞中的綠色熒光。

1.2.3 多核化細胞模型的構(gòu)建 將HepG2 細胞接種于 24 孔細胞培養(yǎng)板中，當細胞覆蓋了培養(yǎng)板的 70%，在細胞培養(yǎng)基中加入 0.5 μmol/L 的紫杉醇，孵育過夜之后，即可以得到細胞多核化或細胞核片段化模型。

1.2.4 CLFP 探針觀察多核化細胞模型的方法 將 CLFP 熒光探針加入含有多核化細胞的細胞培養(yǎng)基中至終濃度為 1 μmol/L，孵育 20 min。采用 PBS 緩沖液清洗培養(yǎng)基中沒有吸收的染料，熒光顯微鏡下觀察細胞多核化現(xiàn)象。

2 結(jié)果

2.1 CLFP 熒光探針的化學結(jié)構(gòu)鑒定

基于熒光母核 BODIPY，我們設(shè)計合成了兩個 CLFP 熒光探針，分別為CLFP-1（圖 2）和CLFP-2（圖 3）并且對其進行核磁共振（NMR）鑒定和高分辨質(zhì)譜（HRMS）分析。

圖 2 熒光探針CLFP-1

圖 3 熒光探針CLFP-2

2.1.1 CLFP-1 的圖譜信息1H-NMR（400MHz，CDCl3）：= 0.91（t，3H），1.21（m，2H），1.41（s，6H），1.71（m，2H），2.45（s，6H），3.05（t，2H），4.30（s，2H），6.05（s，2H），7.42（d，= 8.0Hz，2H）7.68（d，= 8.0Hz，2H）。

13C-NMR（101MHz，CDCl3）：= 12.40，13.12（2C），13.15（2C），19.44，27.63，50.34，60.08，120.99（2C），128.90（2C），130.78（2C），130.80，132.40（2C），136.23（2C），140.85，142.88，155.62（2C）。

HRMS（ESI）：m/z [M + H] 計算所得 C25H31N3BF2：410.25806；檢測得到：410.25736。

2.1.2 CLFP-2 的圖譜信息1H-NMR（400 MHz，CDCl3）：= 0.87（t，3H），1.29（br，10H），1.90（br，2H），2.55（br，6H），2.76（br，2H），4.29（br，2H），5.98（s，2H），7.39（d，= 8.0Hz，2H），7.82（d，= 8.0Hz，2H），10.10（br，NH-HCl，2H）。

13C-NMR（101 MHz，CDCl3）：= 13.82，14.48，14.62，21.95，25.53，28.80，45.44（2C），49.87（2C），121.50（2C），129.21（2C），130.95（2C），131.06，131.16，136.56（2C），140.20，142.66（2C），155.95（2C）。

HRMS（ESI）：m/z [M + H] 計算所得C25H33N3BF2：424.27301；檢測得到：424.27234。

2.2 CLFP 熒光探針在 HepG2 細胞中的定位

將兩個 CLFP 熒光探針（CLFP-1，CLFP-2）與培養(yǎng)的 HepG2 細胞進行共同孵育。熒光顯微鏡下觀察到兩個熒光探針均為細胞質(zhì)特異性定位的探針，圖像邊緣清晰，對比度高，熒光強度適中（圖 4）。我們在 BODIPY 熒光母核上增加脂溶性的基團所生成的 CLFP 探針更加有利于進入活細胞，并且成功地定位于細胞質(zhì)中，而不進入細胞核中。由于兩個探針在結(jié)構(gòu)上非常相似（僅側(cè)鏈有 1 個 CH2的差別），所以在細胞影像圖像的清晰度和對比度上沒有明顯的差別。

圖 4 熒光探針 CLFP-1（A）和CLFP-2（B）在 HepG2 細胞中的定位（兩個熒光探針均為細胞質(zhì)特異性定位熒光探針，且能夠提供清晰的熒光圖像）

圖 5 CLFP-1（A）和 CLFP-2（B）熒光探針顯示紫杉醇處理的具有細胞多核化及細胞核片段化特征的 HepG2 細胞

圖 6 Hoechst 染色紫杉醇處理的具有細胞多核化及細胞核片段化特征的 HepG2 細胞（A：Hoechst 染色；B：可見光區(qū)域；C：圖像疊加；圖中箭頭標示了一個多核化的細胞，但是這個細胞與其相鄰細胞的邊緣在明場照片中不是很清楚，合理評價細胞多核化受到影響）

2.3 CLFP 熒光探針呈現(xiàn)細胞多核化及細胞核片段化

CLFP-1，CLFP-2 均為較好的細胞質(zhì)特異性定位熒光染料，能夠特異性地定位于活細胞的細胞質(zhì)中。接下來，我們采用 0.5 μmol/L 紫杉醇過夜處理了 HepG2 細胞，細胞的染色質(zhì)在遷移的過程中受到了紫杉醇的抑制，抑制了 HepG2 細胞核的正常分裂，從而制備了經(jīng)典的細胞多核化及細胞片段化的模型。經(jīng)過熒光染料 CLFP 的染色，由于細胞核部分不發(fā)生熒光染色，顯示為黑色的孔洞（圖 5），所以，我們可以清楚地看到細胞質(zhì)中細胞核數(shù)目。

同樣，我們采用傳統(tǒng)的細胞核染料 Hoechst 對經(jīng)0.5 μmol/L 紫杉醇處理的多核化 HepG2 細胞進行染色。我們同時進行可見光的圖像拍攝以及細胞核圖像的拍攝，將兩者進行疊加，可以觀察到細胞多核化的現(xiàn)象（圖 6）。但是，傳統(tǒng)的方法，由于各個小細胞核片段具有熒光強度，在進行圖像記錄時，會互相影響小細胞核的邊緣。另外，明場圖像無法清晰地區(qū)分細胞核的邊緣，對于細胞核片段的計數(shù)存在一定的缺陷。

3 討論

異常的細胞分裂或融合會產(chǎn)生多核細胞，以及任何阻斷細胞分裂進程的相關(guān)因素都可誘導細胞多核化，細胞多核化現(xiàn)象廣泛地存在于生物醫(yī)學研究中。然而，對于這一現(xiàn)象呈現(xiàn)與評估目前不是非常的方便，傳統(tǒng)的評估方法是通過進行細胞核染色來確定細胞核是否存在于一個細胞中。不僅操作不方便，而且由于多核化細胞通常表現(xiàn)出細胞肥大的現(xiàn)象，且細胞邊緣不易界定。這些都局限了傳統(tǒng)細胞核染色來觀察細胞多核化。發(fā)展新的實驗技術(shù)來有效地評估細胞多核化非常有意義。

另外一方面，熒光探針已經(jīng)可以特異性地染色活細胞中特定細胞器。CLFP 是一種特異性染色細胞質(zhì)的熒光探針。CLFP 在各種細胞中的分布情況以及其光物理學的特性也已經(jīng)有所報道了。運用 CLFP 進行細胞質(zhì)染色，從而襯托細胞核的形狀，用來研究細胞的多核化。這一方法的特點如下：

⑴ CLFP 方法操作簡單，只需要進行探針與觀察細胞共同孵育 20 min 左右，在熒光顯微鏡下即可觀察。

⑵ CLFP 方法能夠清晰顯示各個細胞核的形狀，尤其可以顯現(xiàn)出細胞的輪廓。這就使得對于評估多個細胞核是否位于一個細胞內(nèi)非常簡便。

因此，CLFP 方法評估細胞多核化現(xiàn)象簡便易行，圖像分辨清晰，是生物醫(yī)學研究細胞多核化現(xiàn)象的一個有價值的實驗技術(shù)方法。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.013

國家自然科學基金（81472396）

胡澤斌，Email：huzbcmba@163.com

2017-06-06