張堯，馮偉，張曉曉，應旗康，劉梓諭，吳興安，王芳

1.第四軍醫(yī)大學 學員旅，陜西 西安 710032；2.第四軍醫(yī)大學 微生物學教研室，陜西 西安 710032

漢灘病毒感染小鼠腹腔巨噬細胞模型的建立

張堯1，馮偉1，張曉曉2，應旗康2，劉梓諭2，吳興安2，王芳2

1.第四軍醫(yī)大學 學員旅，陜西 西安 710032；2.第四軍醫(yī)大學 微生物學教研室，陜西 西安 710032

目的：建立漢灘病毒感染的小鼠腹腔巨噬細胞模型。方法：PBS灌洗6～8周齡C57BL/6小鼠腹腔，分離獲取小鼠腹腔巨噬細胞后，以100 TCID50漢灘病毒76-118株感染小鼠腹腔巨噬細胞，通過間接免疫熒光、ELISA和Realtime PCR檢測病毒感染情況。結(jié)果：病毒感染3d后，間接免疫熒光和ELISA檢測到病毒核衣殼蛋白的表達，Realtime PCR檢測到病毒核酸的表達。結(jié)論：建立了漢灘病毒感染小鼠腹腔巨噬細胞的模型，為進一步闡明漢灘病毒的發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)。

漢灘病毒；小鼠腹腔巨噬細胞；感染

漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，由其引起的腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是一類以發(fā)熱、出血和腎功能損傷為特征的急性傳染病[1]，全球每年發(fā)病人數(shù)達10萬例,其中90％的病例發(fā)生于中國,病死率高達0.3％～10％[2]。

漢灘病毒不僅可以直接引起全身小血管和毛細血管損傷、血管通透性增加和微循環(huán)障礙，還可引起免疫應答異常，進而引發(fā)高熱、出血及腎損害等臨床癥狀[3]。我國是HFRS疫情最為嚴重的國家，流行區(qū)域廣，發(fā)病人數(shù)居全球之首，且病死率較高[4]，主要型別為漢灘病毒和漢城病毒（Seoul virus，SEOV）。針對漢灘病毒目前尚無特異有效的治療藥物。

巨噬細胞是機體發(fā)揮抗病毒作用的重要免疫細胞，可通過分泌多種細胞因子而參與免疫調(diào)節(jié)[5]。探討漢灘病毒和巨噬細胞之間的關(guān)系，有助于了解病毒在體內(nèi)擴散過程及巨噬細胞在發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級6～8周齡C57BL/6雌性小鼠，體重18～20g，由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心飼養(yǎng)；漢灘病毒76-118株由本室保存；SYBR實時定量PCR試劑盒、PrimeScript RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司；Cy3標記的羊抗鼠IgG購自康為世紀公司；抗?jié)h灘病毒單克隆抗體1A8及HRP-1A8由本室制備并保存，可識別漢灘病毒核衣殼蛋白（nucleo?protein，NP）上特異性抗原位點，具有較高的特異性結(jié)合活性。

1.2 小鼠腹腔巨噬細胞的分離、培養(yǎng)

采用椎骨脫臼法處死小鼠，立即放在超凈工作臺上，用75％乙醇消毒皮膚，剪開腹部皮膚暴露腹腔，用無菌注射器吸取磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗腹腔，吸取腹腔灌洗液，制成腹腔巨噬細胞懸液，以PBS液洗細胞2次，離心（1500r/min，10min），用完全DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至1×106/mL鋪至24孔板的細胞玻片上，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中靜置2h，棄去上層懸浮細胞，PBS洗滌2次后加入完全DMEM培養(yǎng)基，24h后進行病毒感染。

1.3 間接免疫熒光（IFA）檢測NP在感染細胞中的表達

用100 TCID50的漢灘病毒于37℃、CO2孵箱感染腹腔巨噬細胞2h后，添加含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)72h，按常規(guī)方法進行IFA實驗，一抗為抗?jié)h灘病毒NP抗體1A8（1∶1000稀釋），二抗為Cy3標記的羊抗鼠IgG（1∶2000稀釋），熒光顯微鏡觀察、照相。

1.4 病毒感染細胞中病毒核酸的檢測

設(shè)計編碼HTNV NP的S基因及小鼠GAPDH引物，由北京奧科生物公司合成。引物分別為HTNV S Forward（5′-GATCAGTCACAGTCTAGTC A-3′）、HTNV S Reverse（5′-TGATTCTTCCACCA TTTTGT-3′）、Mouse GAPDH Forward（5′-AGGCC GGTGCTGAGTATGTC-3′）和 Mouse GAPDH Re?verse（5′-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′）。

用TRIzol法提取感染細胞的RNA，以其為模板用RT-PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，分別以 HTNV S Forward/Reverse及 Mouse GAPDH For?ward/Reverse為引物，用實時定量PCR試劑盒檢測樣本中的HTNV特異性核酸。

1.5 感染細胞中病毒抗原的檢測

收取病毒感染的巨噬細胞，于-80℃冰箱中快速冷凍20min，反復凍融3次后，4℃、12 000r/min離心30min，收集上清，采用夾心ELISA法檢測上清中的HTNV抗原。具體方法如下：取1∶2000稀釋的抗NP單克隆抗體于4℃包被過夜，用洗滌緩沖液洗滌3次后，將細胞裂解液上清按1∶10稀釋，每孔加入100μL，設(shè)置負孔和陰性對照，37℃孵育1h，洗滌3次后加入1∶2000稀釋的HRP-1A8抗體，37℃孵育1h，洗滌3次后加入TMB顯色，室溫靜置15min后加入2 mol/L H2SO4終止反應，測定各孔的D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 間接免疫熒光檢測漢灘病毒NP在漢灘病毒感染后的腹腔巨噬細胞中的表達

經(jīng)間接免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)漢灘病毒感染后，小鼠腹腔巨噬細胞能表達漢灘病毒核衣殼蛋白（圖1）。

2.2 漢灘病毒感染腹腔巨噬細胞中病毒抗原的檢測結(jié)果

漢灘病毒感染小鼠腹腔巨噬細胞后，以夾心ELISA法檢測病毒感染細胞中HTNV特異性抗原，結(jié)果顯示病毒感染巨噬細胞的D450nm值與病毒感染Vero-E6細胞的D450nm值相當，表明病毒感染后的巨噬細胞中有病毒抗原的表達（圖2）。

2.3 漢灘病毒感染腹腔巨噬細胞中病毒核酸的檢測結(jié)果

漢灘病毒感染腹腔巨噬細胞后，以qRT-PCR法檢測感染細胞中的病毒核酸，結(jié)果顯示感染組細胞中的病毒核酸拷貝數(shù)明顯高于對照組，表明病毒感染后巨噬細胞中有病毒核酸復制（圖3）。

圖1 漢灘病毒感染C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞中病毒抗原的間接免疫熒光結(jié)果

圖2 漢灘病毒感染C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞中病毒特異性抗原的ELISA檢測結(jié)果

圖3 漢灘病毒感染C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞中病毒核酸的qRT-PCR結(jié)果

3 討論

機體主要通過復雜的免疫系統(tǒng)抵御外來病原體，包括2種主要方式：非特異性和特異性的。病毒感染后，非特異性免疫提供首道防線且影響隨后的特異性免疫。巨噬細胞是機體免疫系統(tǒng)中具有多種功能的免疫細胞，參與機體非特異性免疫反應，具有很強的吞噬功能。巨噬細胞在產(chǎn)生特異性細胞免疫和體液免疫之前發(fā)揮了重要的防御作用，同時能分泌多種細胞因子和趨化因子。細胞因子一方面可作為宿主介導控制病毒復制的重要組分，另一方面也可作為病毒破壞宿主免疫系統(tǒng)的重要因素。漢灘病毒的致病機理是病毒感染誘導宿主免疫病理[6]。因此，有必要進一步研究漢灘病毒感染與巨噬細胞、細胞因子之間的關(guān)系，這對深入闡明漢灘病毒的致病機理尤為重要。

本實驗主要以體外方式感染單核-巨噬細胞，檢測HTNV感染小鼠腹腔巨噬細胞的情況，通過間接免疫、ELISA和qRT-PCR法檢測，結(jié)果顯示HTNV能感染小鼠腹腔巨噬細胞并在其中增殖，為下一步研究巨噬細胞在漢灘病毒感染過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[1] Lee H W,Lee P W,Johnson K M.Isolation of the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever[J].J In?fect Dis,1978,137:298-308.

[2] Krautkramer E,Zeier M,Plyusnin A.Hantavirus infec?tion:an emerging infectious disease causing acute re?nal failure[J].Kidney Int,2013,83:23-27.

[3] Hepojoki J,Vaheri A,Strandin T.The fundamental role of endothelial cells in Hantavirus pathogenesis[J].Front Microbiol,2014,5:727.

[4] Ruo S L,Li Y L,Tong Z,et al.Retrospective and prospective studiesofhemorrhagic feverwith renal syndrome in rural China[J].J Infect Dis,1994,170:527-534.

[5] DiNapoli S R,Hirsch V M,Brenchley J M.Macro?phages in progressive human immunodeficiency virus/simian immunodeficiency virus infections[J].J Virol,2016,90（17）:7596-7606.

[6] Mackow E R,Gavrilovskaya I N.Hantavirus regula?tion of endothelial cell functions[J].Thromb Haemost,2009,102:1030-1041.

Establishment of Hantaan Virus Infected Mouse Peritoneal Elicit Macrophage

ZHANG Yao1,FENG Wei1,ZHANG Xiao-Xiao2,YING Qi-Kang2,LIU Zi-Yu2,WU Xing-An2,WANG Fang2*
1.Cadet,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032;2.Department of Microbiology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032;China
*Corresponding author,E-mail:wangf07@fmmu.edu.cn

Objective:To establish a macrophage model for Hantaan virus（HTNV） infection by using the cul?ture of mouse peritoneal elicit macrophage.Methods:Inject 5mL of ice cold PBS（with 3％FCS） into the perito?neal cavity.After injection,gently massage the peritoneum to dislodge any attached cells into the PBS solution and then collect as much as possible,and deposit the collected cell suspension in tubes on ice.The mouse perito?neal macrophages were cultured and infected with 100 TCID50HTNV 76-118 strain.Indirect immunofluorescent as?say（IFA）,ELISA and real-time PCR were used to detect the protein or nucleic acid of Hantaan virus.Results:3 days after infection,the nucleoprotein was detected out by IFA and ELISA,the nucleic acid of nucleoprotein was confirmed by real-time PCR.Conclusion:Direct infection of HTNV on the cultured mouse peritoneal macro?phages were identified,to explore the pathogenic mechanism for HTNV infection.

Hantaan virus;mouse peritoneal elicit macrophage;infection

R373;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0503-03

2017-01-06

國家自然科學基金（31470890，31270978）；軍隊重點課題（BWS13G）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃（2013KTCL03-06）

張堯（1994- ），男，本科在讀，（E-mail）516091724@qq.com

王芳，（E-mail）wangf07@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.019