溫中華，李建民，陳薇

軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100071

蜱傳腦炎病毒E抗原蛋白的原核表達及鑒定

溫中華，李建民，陳薇

軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100071

目的：構(gòu)建蜱傳腦炎病毒（TBEV）結(jié)構(gòu)蛋白E的原核表達載體，表達重組蛋白。方法：PCR擴增E蛋白全長基因片段，插入原核表達載體pET-32a并轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行誘導表達，鎳柱純化、復性。結(jié)果：E蛋白在大腸桿菌中獲得表達，表達量達60 mg/L；重組E蛋白能與人抗TBEV多克隆抗體產(chǎn)生特異反應；用重組E抗原免疫家兔后，能檢測到較高的抗體水平。結(jié)論：原核表達的E抗原蛋白具有抗體結(jié)合活性，可用于制備ELISA診斷試劑。

蜱傳腦炎病毒；E蛋白；原核表達

蜱傳腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）在分類學上屬黃病毒科（Flavivirade）黃病毒屬（Flavivirus），有3個亞型，即歐洲亞型、西伯利亞亞型和遠東亞型[1-2]，能夠引起人體急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病——蜱傳腦炎。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計該病每年發(fā)病10 000～12 000例，在我國多發(fā)于東北、西南及西北林區(qū)[3]，已被列為5大職業(yè)性傳染病之一。TBEV為單正鏈RNA包膜病毒，包含3個結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白C、前膜蛋白M（prM）、包膜蛋白E，以及7個非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5[4]，其中結(jié)構(gòu)蛋白E是病毒的主要抗原成分，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，決定著病毒的細胞嗜性與毒力。制備并純化E抗原蛋白，既可作為TBE的診斷制劑，又可作為新的免疫原蛋白，亦可用于中和抗體的篩選和中和表位的鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10、BL21購自天根生化有限公司；質(zhì)粒pET-32a為本實驗室留存；TBEV結(jié)構(gòu)蛋白E基因（含結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）由博邁德公司合成；引物由Invitrogen公司合成；Ex Taq酶、核酸及蛋白marker購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、pMD18-T載體購自NEB公司；凝膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；HisTrap鎳柱購自GE公司；HRP羊抗兔及羊抗人IgG二抗購自Sigma公司；化學發(fā)光顯色液購自Millipore公司。

1.2 原核表達質(zhì)粒構(gòu)建

利用上游引物（5'-CATATGTCGCGTTGCACA CACTTGGAAAAC-3'）和下游引物（5'-GCGGCCG CCGCCCCCACTCCAAGGGTCATGGCCAAG-3'）（分別引入NdeⅠ和NotⅠ酶切位點）擴增E基因，回收PCR擴增產(chǎn)物，連T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Top10細胞，挑單克隆培養(yǎng)過夜，PCR鑒定陽性克隆。將鑒定正確的基因與pET-32a質(zhì)粒用NdeⅠ和NotⅠ雙酶切、連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)Top10細胞，挑單克隆培養(yǎng)過夜，PCR鑒定陽性克隆，抽提陽性克隆質(zhì)粒進行雙酶切鑒定并測序。

1.3 重組蛋白誘導表達

將鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21細胞，經(jīng)氨芐西林選擇培養(yǎng)后，挑單克隆到5mL含100μg/mL氨芐西林的 LB培養(yǎng)基，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)，D600nm值達0.6～0.8時加入IPTG至終濃度為1mmol/L誘導表達4h，誘導結(jié)束后，3000r/min離心10min收取菌體沉淀，加入1mL PBS重懸后超聲波裂解10min，12 000r/min離心10min，分別取超聲波后的全菌液、上清、沉淀（用等體積PBS重懸），加入4×SDS上樣緩沖液，100℃加熱5min，SDS-PAGE分析表達結(jié)果。

1.4 重組蛋白大量表達及純化

將陽性克隆菌株接種到100mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)基，37℃、220r/min振搖過夜，將其全部接種到1 L含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當 D600nm值達 0.6～0.8時，加入1mmol/L IPTG誘導4h，8000r/min離心10min收菌體；用100mL緩 沖 液 A（含 50mmol/LTris，0.5mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl及5％甘油）重懸菌體，超聲波破碎30min，4℃、12 000r/min離心20min，棄上清；PBS洗滌沉淀2次；在沉淀中加入100mL緩沖液 A、100μL DTT（0.5 mol/L）及 1.5mL 十二烷基肌氨酸鈉（20％）重懸，4℃靜置過夜；4℃、12 000r/min離心20min，取上清，加入1050μL PEG4000（濃度 0.2％）、2100μL氧化型谷胱甘肽（50mmol/L）和還原型谷胱甘肽（100mmol/L），室溫靜置2h；用TE緩沖液（含10mmol/L Tris-HCl和 1mmol/L EDTA，pH8.0）透析 72h。將透析后的E蛋白用結(jié)合緩沖液（含10mmol/L磷酸二氫鈉、300mmol/L NaCl、5mmol/L咪唑，pH7.4）稀釋至1/10，上鎳柱，用洗脫緩沖液（含10mmol/L 磷 酸 二 氫 鈉 、300mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑，pH7.4）進行線性梯度洗脫，收集峰用10mmol/L磷酸氫鈉緩沖液（pH7.4）超濾換液，Bradford法測蛋白濃度。取10μg加入SDS上樣緩沖液，加β巰基乙醇，100℃加熱5min，SDSPAGE分析結(jié)果。

1.5 Western印跡

取10μg純化的E蛋白進行 SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜，用5％脫脂牛奶封閉過夜；加入商品化疫苗免疫過的志愿者陽性血清（用封閉液1∶50稀釋），室溫孵育 1h；TBST洗滌4次，7min/次；加入HRP羊抗人二抗，室溫孵育1h；TBST洗滌4次，7min/次；淋加顯色液，觀察結(jié)果。

1.6 ELISA實驗

取2μg/mL的E蛋白包被酶標板，4℃包被過夜，PBST洗滌3次，5min/次；用5％脫脂牛奶于37℃封閉1h；洗滌，加入一抗（人和猴抗TBEV多抗，濃度 10μg/mL），37℃孵育 1h；洗滌，加入HRP羊抗人二抗（1∶1000），37℃孵育1h；洗滌，加顯色液，37℃顯色15min，加終止液終止反應，測定D450nm值。同時，用Abcam公司商品化TBEV ELISA試劑盒進行檢測，比較結(jié)果。

1.7 兔多克隆抗體制備及檢測

將純化的E抗原蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合后免疫新西蘭大白兔（免疫前取血清），采用背部皮下注射免疫，每7d免疫1次，共計3次，劑量1 mg/（次·只）。第28d天耳緣靜脈取血，分離血清，用間接ELISA法檢測血清抗體效價。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

TBEV結(jié)構(gòu)蛋白E基因PCR擴增后，獲得約1500bp的片段（圖1）；構(gòu)建的pET-32a/E質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，得到目的條帶（圖2），基因測序與原序列一致，無堿基突變。

2.2 E蛋白誘導表達及純化

將表達質(zhì)粒pET-32a/E轉(zhuǎn)化BL21細胞誘導表達，菌體超聲波破碎后進行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果在全菌液和沉淀中均出現(xiàn)目的蛋白大小條帶（相對分子質(zhì)量約55 000），而上清中則無（圖3），說明E抗原蛋白以包涵體形式表達。包涵體經(jīng)十二烷基肌氨酸鈉變性，在含氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽的氧化還原體系中透析復性，用Ni柱純化獲得純度較高的蛋白（圖4）；測定濃度后計算，1 L菌液誘導后能獲得約60 mg蛋白。

2.3 Western印跡

圖1 TBEV E基因的PCR擴增

圖2 pET-32a/E重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

用人TBEV陽性血清對純化的E抗原蛋白進行Western印跡檢測，在相對分子質(zhì)量約55 000處出現(xiàn)惟一目的條帶（圖5）。

2.4 ELISA結(jié)果

用純化的E抗原包被酶聯(lián)板，對商品化疫苗免疫后的人和猴的陽性、陰性血清純化多抗進行ELISA檢測，結(jié)果表明我們純化的E抗原蛋白能與陽性多抗發(fā)生特異性反應（圖6）。同時，我們將三免第7d的兔血清1∶300稀釋后與E抗原進行間接ELISA反應，結(jié)果如圖6，說明E蛋白具有免疫原性。

圖3 TBEV E蛋白原核誘導表達的SDS-PAGE

圖4 TBEV E蛋白的Ni柱純化

圖5 TBEV E蛋白的Western印跡

圖6 重組E抗原蛋白的ELISA檢測

3 討論

目前商品化的蜱傳腦炎ELISA診斷試劑大多用的是滅活TBEV，昂貴且存在一定的安全隱患，同時與其他黃病毒屬病毒還有交叉結(jié)合[5]。E抗原蛋白是TBEV的主要抗原成分，決定著病毒的細胞嗜性與毒力，利用重組E蛋白作為診斷抗原是一種經(jīng)濟安全的選擇。

王丹[6]、朱曉磊[7]等原核表達了E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ，并以之作為TBEV特異性診斷抗原。與之相比，我們表達的E抗原全蛋白分子覆蓋了全部抗原表位，在作為診斷試劑時可能會有更高的檢測準確率，但這還需要進一步的血清學驗證。邵賓等[8]亦通過原核表達了蜱傳腦炎病毒E蛋白，但獲得的包涵體未能復性，可能影響其蛋白活性。在本研究中，我們利用pET-32a載體在原核細胞中表達了TBEV抗原E蛋白，該蛋白以包涵體的形式存在。我們首先試圖用尿素作為變性劑，將包涵體變性后通過減少尿素濃度逐步透析復性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在復性過程中E蛋白總是會析出。于是又使用了比較溫和的變性劑十二烷基肌氨酸鈉，并在復性過程中加入氧化還原體系（還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽），最終得到了復性后的E抗原蛋白。

綜上所述，本研究獲得了重組E抗原蛋白，該蛋白既可作為TBEV特異性診斷抗原之一，又可作為新的TBEV疫苗成分，亦可用于中和抗體的篩選和中和表位的鑒定。

[1] Ecker M,Allison S L,Meixner T,et al.Sequence analysis and genetic classification of tick-borne en?cephalitis viruses from Europe and Asia[J].J Gen Vi?rol,1999,80（1）:179-185.

[2] Gould E A,De Lamballerie X,Zanotto P M,et al.Evolution,epidemiology,and dispersal of flaviviruses re?vealed by molecularphylogenies[J].AdvVirusRes,2001,57:71-103.

[3] 楊藍萍,張?zhí)靿?袁曉平,等.從云南蝙蝠及牛蜱中分離出兩株森林腦炎病毒[J].中國人獸共患病學雜志,1993,1:22-23.

[4] McMinn P C.The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses[J].J Gen Virol,1997,78:2711-2721.

[5] Niedrig M,Vaisviliene D,Teichmann A,et al.Compar?ison of six different commercial IgG-ELISA kits for the detection ofTBEV-antibodies[J].JClin Virol,2001,20:79-182.

[6] 王丹,康曉平,郝淮杰,等.蜱傳腦炎病毒TBE-E-D3抗原的原核表達純化及ELISA方法鑒定[J].生物技術(shù)通訊,2011,22（5）:636-639.

[7] 朱曉磊,林方,康曉平,等.森林腦炎病毒E基因Do?mainⅢ段的克隆表達及鑒定[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報,2012,34（6）:667-671.

[8] 邵賓,陳斌,謝菲,等.蜱傳腦炎病毒E基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建及其在原核細胞的表達[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報,2010,33（3）:87-91.

Expression and Identification of Recombinant Tick-Borne Encephalitis Virus Envelope Protein in Escherichia coli

WEN Zhong-Hua,LI Jian-Min,CHEN Wei*
Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071,China
*Corresponding author,E-mail:cw0226@foxmail.com

Objective:To construct prokaryotic expression vectors for tick-borne encephalitis virus（TBEV） enve?lope（E） protein,and express recombinant TBEV E protein in Escherichia coli.Methods:The coding sequence of full length E protein was amplified by PCR and cloned into the pET-32a vector.The protein of interest was ex?pressed in E.coli with IPTG induction and purified by Ni-NATB bead.Results:We obtained recombinant E pro?tein in E.coli with the yields of ～60 mg/L,and it was identified by specific human anti-TBEV polyclonal antibod?ies.After being immunized with E antigen in rabbits,specific high-level antibodies could be detected in serum.Conclusion:The prokaryotically expressed recombinant E protein with the antibody binding activity can be devel?oped as a ELISA diagnostic reagents.

tick-borne encephalitis virus;envelope protein;prokaryotic expression

Q78;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0495-04

2017-02-13

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2013ZX09304103）

溫中華（1989- ），男，碩士研究生，（E-mail）zhonghuawen2014@163.com

陳薇，（E-mail）cw0226@foxmail.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.017