龐玉紅，劉玉斌，于愛(ài)平，呂英濤

1.青島科技大學(xué)，山東 青島 266042；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

EH-L-Fc在CHO細(xì)胞中的表達(dá)、純化及活性分析

龐玉紅1，劉玉斌2，于愛(ài)平2，呂英濤1

1.青島科技大學(xué)，山東 青島 266042；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

目的：為延長(zhǎng)重組新蛭素（EH）的半衰期，制備通過(guò)連接肽連接的重組新蛭素與IgG1 Fc的融合蛋白EH-LFc，并對(duì)其進(jìn)行功能分析。方法：采用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建Eh-L-Fc融合基因，克隆至表達(dá)載體pcDNA3.1，用脂質(zhì)體將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）中，G418抗性篩選穩(wěn)定克隆株；Western印跡檢測(cè)培養(yǎng)上清中EH-LFc蛋白的表達(dá)，用有限稀釋法對(duì)G418抗性篩選出的混合克隆單克隆化，通過(guò)Protein A親和層析柱純化融合蛋白，Lowry法檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE、HPLC法檢測(cè)目的蛋白純度，質(zhì)譜法分析相對(duì)分子質(zhì)量，凝血因子Ⅹa裂解融合蛋白后采用纖維蛋白凝塊法測(cè)定其抗凝活性。結(jié)果：構(gòu)建了重組表達(dá)載體pcDNA3.1-Eh-L-Fc，并獲得穩(wěn)定表達(dá)EHL-Fc的細(xì)胞株。表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量為72 168，HPLC檢測(cè)親和層析獲得的EH-L-Fc純度達(dá)93.9％。完整的EH-L-Fc無(wú)抗凝活性，經(jīng)凝血因子Ⅹa裂解后其抗凝比活性為96.6 ATU/mg。結(jié)論：獲得穩(wěn)定表達(dá)EH-L-Fc的CHO細(xì)胞株和較高純度的重組融合蛋白，且該重組融合蛋白經(jīng)凝血因子Ⅹa裂解后可釋放抗凝活性。EH-L-Fc融合蛋白的獲得為研究新蛭素的長(zhǎng)效劑型奠定了重要基礎(chǔ)。

新蛭素；抗凝；Fc融合蛋白

水蛭素（hirudin，HV）是水蛭唾液腺分泌的一種酸性多肽，是目前已知的最強(qiáng)有力的凝血酶天然抑制劑[1-2]，有良好的抗凝血和抗血栓作用[3]。雖然水蛭素不會(huì)引起血小板減少癥，且不依賴抗凝血酶Ⅲ，但其同樣存在出血副作用[4]，這極大地限制了它的廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建表達(dá)了能靶向血栓釋放抗凝活性的水蛭素衍生物——新蛭素（neorudin，EH）[5]，它是在水蛭素N端連接能夠被凝血因子Ⅹa（FⅩa）和Ⅺa（FⅪa）識(shí)別并切割的短肽谷氨酸-脯氨酸-精氨酸（EPR），該短肽可以封閉水蛭素的抗凝活性。當(dāng)體內(nèi)發(fā)生血栓或凝血系統(tǒng)被激活時(shí)，該短肽可被富集于血栓局部的FⅩa和FⅪa識(shí)別并切割，釋放出有活性的水蛭素，從而發(fā)揮抗栓作用。通過(guò)這種作用機(jī)制，使EH能夠靶向作用于血栓局部，從而降低全身的出血副作用。然而，EH是一條短肽，其相對(duì)分子質(zhì)量只有7300，很容易被腎小球過(guò)濾，經(jīng)尿液排出，這就使得EH在體內(nèi)的血漿半衰期較短，只有1～2h，臨床上需要多次滴注給藥。因此，如何延長(zhǎng)EH半衰期，減少給藥次數(shù)，提高患者的生活質(zhì)量，成為一個(gè)有價(jià)值的課題。

將蛋白藥物與免疫球蛋白Fc段融合構(gòu)建融合蛋白，是延長(zhǎng)蛋白藥物半衰期的一種重要方法。Fc融合蛋白主要通過(guò)2種方式延長(zhǎng)目的蛋白的半衰期：通過(guò)提高相對(duì)分子質(zhì)量，減少腎小球過(guò)濾；Fc融合蛋白與Fc新生受體（neonatal Fc re?ceptor，F(xiàn)cRn）結(jié)合，通過(guò)FcRn介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)模型延緩融合蛋白被蛋白酶降解[6-8]。在本研究中，我們將EH與人IgG1的Fc融合，用剛性連接肽（linker）將EH蛋白和Fc結(jié)構(gòu)域連接，通過(guò)增加2個(gè)蛋白間的空間距離[9]而減少蛋白間的相互影響，以期在不影響EH抗凝功能的前提下，延長(zhǎng)其血漿半衰期。

1 材料與方法

1.1 材料

CHO細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；攜帶Eh（204bp）片段的pUCK-Eh由上海生工公司合成；攜帶Fc（669bp）片段的pET-22a-V、pcDNA3.1由本實(shí)驗(yàn)室保存；山羊抗人IgG-Fc（HRP）購(gòu)自Abcam公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；FⅩa、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ為NEB公司產(chǎn)品；KOD-Plus-Neo購(gòu)自Toyobo公司；LipofectAMINE 3000 Reagent Proto?col購(gòu)自Invitrogen公司；Opti-MEM、DMEM-F12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；酵母粉和蛋白胨購(gòu)自默克公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；Protein A親和層析預(yù)裝柱購(gòu)自Thermo公司；牛纖維蛋白原、人凝血酶購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 重組表達(dá)載體pcDNA3.1-Eh-L-Fc的構(gòu)建

為確保EH-L-Fc融合蛋白分泌到培養(yǎng)基中，在Eh-L-Fc融合基因的5'端融合一段分泌信號(hào)肽（SP）序列，5'引物為 SP-FP。分別以 EH-FP、Fc-FP為正向引物，EH-RP、Fc-RP為反向引物，原核表達(dá)載體pUCK-Eh、pET-22a-Fc為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增Eh、Fc（反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，98℃變性 10s，68℃退火/延伸 30s，30個(gè)循環(huán)，延伸 7min）；以SP-FP為正向引物、EH-RP為反向引物、Eh為模板，PCR擴(kuò)增Eh（反應(yīng)條件：68℃退火30s，68℃延伸30s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)）；以SP-FP為正向引物，linker-RP為反向引物，Eh、Linker為模板，連接擴(kuò)增Eh-Linker（反應(yīng)條件：68℃退火/延伸30s，30個(gè)循環(huán)）；最后以SP-FP為正向引物，F(xiàn)c-RP為反向引物，Eh-Linker、Fc為模板，連接擴(kuò)增Eh-L-Fc（反應(yīng)條件：68℃退火/延伸 30s，30個(gè)循環(huán)）。重疊PCR流程見(jiàn)圖1，引物信息見(jiàn)表1。

PCR產(chǎn)物Eh-L-Fc與質(zhì)粒pcDNA3.1分別經(jīng)HindⅢ、XhoⅠ雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，42℃熱激，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取陽(yáng)性單克隆于LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)后離心取菌體，提取質(zhì)粒，用HindⅢ、XhoⅠ雙酶切鑒定重組載體后，測(cè)序鑒定。

1.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染驗(yàn)證重組質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中的表達(dá)

1.3.1 前期細(xì)胞預(yù)處理 轉(zhuǎn)染前一天，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化，離心重懸后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，于37℃、5％CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM/F12+10％胎牛血清，當(dāng)貼壁細(xì)胞匯合度達(dá)70％～90％時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基。

1.3.2 轉(zhuǎn)染 取3.75μL LipfectAMINE 3000加入125μL Opti-MEM 培養(yǎng)基中；取 5μg重組質(zhì)粒加入250μL Opti-MEM培養(yǎng)基中，再加入10μL P3000 Reagent混勻；按1∶1的比例混合上述2種溶液，室溫靜置5min，將質(zhì)?；旌弦悍謩e按標(biāo)記加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染6h后，更換含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平驗(yàn)證蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染24h后，用0.25％胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，提取RNA，RT-PCR獲得cDNA；以SP-FP為正向引物、Fc-RP為反向引物、RT-PCR獲得的cDNA為模板，68℃退火/延伸30s，30個(gè)循環(huán)；轉(zhuǎn)染48h后，收集培養(yǎng)基，用0.25％胰酶消化收集細(xì)胞，提取胞內(nèi)蛋白。將收集到的培養(yǎng)基與提取的胞內(nèi)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5％脫脂牛奶封閉，孵育二抗（1∶5000）后，發(fā)光試劑顯影。

圖1 重疊PCR擴(kuò)增Eh-L-Fc融合基因流程圖

1.4 穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株的篩選

將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染得到的培養(yǎng)24h的細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)至100mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為DMEM/F12+10％胎牛血清，加入終濃度為800μg/mL的G418進(jìn)行抗性篩選，以轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染組為對(duì)照。14d后挑取細(xì)胞克隆于24孔板中擴(kuò)增，有限稀釋法將細(xì)胞稀釋至100/mL后再依次梯度稀釋鋪入96孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后依次轉(zhuǎn)入24孔板、6孔板、100mm培養(yǎng)皿擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.5 融合蛋白的表達(dá)與純化

將篩選到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)2d后收集培養(yǎng)上清，用0.22μm濾膜過(guò)濾，Protein A-Agarose親和層析柱純化，用pH7.2、0.15 mol/L NaCl、100mmol/L的磷酸鹽緩沖液平衡柱子，pH3.0、0.1 mol/L的甘氨酸緩沖液洗脫蛋白，pH8.5的1 mol/L Tris-HCl中和洗脫蛋白液至pH7.4。

1.6 純化蛋白的濃度與純度檢測(cè)

采用Lowry法檢測(cè)純化后融合蛋白的濃度[10]；采用SDS-PAGE灰度分析法與反向高效液相色譜法（RP-HPLC）檢測(cè)純化后融合蛋白的純度（HPLC條件：C18柱子，A相為水，B相為乙腈，A、B相中分別加入1‰三氟乙酸，5％～70％濃度乙腈線性洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，流速1mL/min，上樣量1μg）。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物和連接肽的序列

1.7 融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用還原SDS-PAGE法與基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS）檢測(cè)融合蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.8 體外活性檢測(cè)

牛源FⅩa（1 mg/mL）37℃裂解融合蛋白6h，取 10μL 裂解產(chǎn)物，加入20μL 8 IU/mL 的凝血酶，輕輕混勻后再加入20μL 5 mg/mL的纖維蛋白原，輕彈混勻，室溫靜置15min，輕彈管壁，觀察凝塊形成情況。以同體積去離子水代替裂解的EH-L-Fc溶液和凝血酶溶液，其他條件不變作為空白對(duì)照；以同體積去離子水代替裂解的EHL-Fc溶液，其他條件不變作為陽(yáng)性對(duì)照；以未經(jīng)裂解的EH-L-Fc溶液代替裂解的EH-L-Fc溶液，其他條件不變作為裂解前對(duì)照。用下式計(jì)算抗凝比活性：

其中，8 IU/mL為凝血酶活性單位，V凝血酶為凝血酶體積，CEH-L-Fc為 EH-L-Fc濃度，VEH-L-Fc為 EH-LFc溶液體積。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

采用瑞士模型工作區(qū)（Swiss-Model Work?space）對(duì)設(shè)計(jì)的融合蛋白空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)如圖2A，顯示剛性連接肽通過(guò)形成3個(gè)α螺旋連接EH和Fc，使得2個(gè)結(jié)構(gòu)域不存在空間位阻，提示Fc不會(huì)影響EH功能，即可以按照?qǐng)D2B所繪的重組表達(dá)質(zhì)粒圖譜進(jìn)行后續(xù)重組質(zhì)粒構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。

利用前述方法和引物，經(jīng)SOE-PCR擴(kuò)增融合目的基因Eh-L-Fc（990bp），將獲得的產(chǎn)物片段進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶約1000bp，與理論值相符（圖3A）。將獲得的重組融合基因Eh-L-Fc克隆至表達(dá)載體pcDNA3.1并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，提取質(zhì)粒進(jìn)行HindⅢ、XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示酶切獲得1000bp左右的條帶，與重組融合基因Eh-L-Fc理論大小相符（圖3B）。核苷酸測(cè)序結(jié)果也顯示，重組融合基因未發(fā)生堿基或核苷酸序列突變，說(shuō)明我們獲得了正確的重組表達(dá)載體pcDNA3.1-Eh-L-Fc。

2.2 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)融合基因的表達(dá)

將轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體pcDNA3.1-Eh-L-Fc獲得的瞬轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染空載體的CHO細(xì)胞系提取RNA，經(jīng)試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以獲得的cDNA為模板，SP-FP和Fc-RP為引物進(jìn)行PCR，將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示pcDNA3.1-Eh-L-Fc瞬轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞系在1000bp左右有目的核苷酸片段存在，而轉(zhuǎn)染空載體的CHO系在相同位置未見(jiàn)任何條帶（圖4），說(shuō)明重組表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞。

圖2 EH-L-Fc融合蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖譜及質(zhì)粒構(gòu)建圖譜

2.3 翻譯水平檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況

為檢測(cè)重組蛋白在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Eh-L-Fc的CHO細(xì)胞和經(jīng)過(guò)抗性篩選、克隆化的CHO細(xì)胞中的表達(dá)，采用山羊抗人IgG-Fc（HRP）抗體對(duì)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的目的蛋白和CHO胞內(nèi)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，圖5A顯示轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞表達(dá)EH-L-Fc融合蛋白，且為分泌表達(dá)（圖5B），圖5C顯示不同陽(yáng)性細(xì)胞克隆表達(dá)量不同。

2.4 EH-L-Fc蛋白的純化及檢測(cè)

用ProteinA-Agarose親和層析柱純化pcDNA3.1-Eh-L-Fc高表達(dá)的CHO細(xì)胞系培養(yǎng)上清中的EH-L-Fc蛋白，親和層析圖譜見(jiàn)圖6，層析洗脫峰的SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖7，電泳結(jié)果均顯示只有1條蛋白帶。經(jīng)Lowry法測(cè)得純化后蛋白濃度為0.66 mg/mL，經(jīng)掃描灰度分析，層析產(chǎn)物純度為90.96％，HPLC結(jié)果顯示層析產(chǎn)物純度為93.9％（圖8），質(zhì)譜顯示EH-L-Fc的相對(duì)分子質(zhì)量為72 168（圖9）。綜上可知，獲得了較高純度的重組融合蛋白EH-L-Fc。

圖3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Eh-L-Fc的構(gòu)建過(guò)程核酸電泳圖

圖4 瞬染CHO細(xì)胞系中RT-PCR檢測(cè)pcDNA3.1-Eh-L-Fc的表達(dá)

圖5 Western印跡檢測(cè)EH-L-Fc融合蛋白的表達(dá)

2.5 EH-L-Fc生物活性檢測(cè)

用纖維蛋白凝塊法測(cè)定EH-L-Fc蛋白活性，結(jié)果見(jiàn)表2。未裂解的EH-L-Fc融合蛋白和陽(yáng)性對(duì)照均有凝塊形成，即無(wú)抗凝活性，表明EH-LFc融合蛋白本身無(wú)抗凝活性，只有經(jīng)FⅩa裂解后才具有抗凝活性。按照前述體外活性檢測(cè)中提及的抗凝比活性計(jì)算公式，計(jì)算得抗凝活性為96.6 ATU/mg。

圖6 pcDNA3.1-Eh-L-Fc高表達(dá)的CHO細(xì)胞系培養(yǎng)基的Protein A親和層析圖譜

圖7 親和層析產(chǎn)物的SDS-PAGE

圖8 親和層析產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)

圖9 EH-L-Fc的質(zhì)譜檢測(cè)

表2 EH-L-Fc的抗凝比活性

3 討論

血栓形成和血栓栓塞2種病理過(guò)程所引起的疾病，臨床上稱為血栓性疾病，目前是人類死亡的最主要原因之一，病死率居高不下。血栓一旦形成往往造成不可逆的后果，因此血栓性疾病的治療以預(yù)防為主。目前，不管是臨床上常用的肝素類、華法令類抗凝藥，還是新上市的凝血酶抑制劑、FⅩa抑制劑等抗栓藥物，都存在出血副作用[11]，因此降低出血副作用成為抗凝藥物研發(fā)的重要方向。

水蛭素能與游離的或與纖維蛋白原結(jié)合的凝血酶以1∶1結(jié)合，形成緊密的非共價(jià)可逆性化合物，進(jìn)而抑制凝血酶的活性。自1986年水蛭素cDNA被克隆后[12]，經(jīng)過(guò)30年的研究和應(yīng)用，重組水蛭素取得巨大成就，并在真核、原核多種載體中獲得表達(dá)[13]。為解決水蛭素的出血副作用問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建表達(dá)了新蛭素，在體內(nèi)外證明[14]完整的新蛭素沒(méi)有抗凝血酶活性，經(jīng)FⅩa切割后可以釋放水蛭素的抗凝活性[14]，大鼠頸動(dòng)脈血栓模型和大鼠后腔靜脈血栓模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，動(dòng)物給予EH后血栓形成時(shí)間明顯延長(zhǎng)，血栓質(zhì)量顯著減小，同時(shí)對(duì)凝血參數(shù)影響較弱，動(dòng)物出血時(shí)間、凝血酶原時(shí)間和凝血酶時(shí)間明顯低于陽(yáng)性對(duì)照藥水蛭素[15]。因而，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，EH能夠在發(fā)揮抗凝活性的前提下，降低出血副作用。

EH相對(duì)分子質(zhì)量為7300，遠(yuǎn)小于腎小球過(guò)濾攔截的70 000的分子大小，因而易被腎小球過(guò)濾，經(jīng)尿液排出，從而導(dǎo)致其體內(nèi)半衰期較短。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，EH在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)主要以原型形式經(jīng)尿液排泄，消除半衰期只有1個(gè)多小時(shí)。因而，EH在臨床上須一天2次靜脈滴注給藥，靜滴時(shí)間較長(zhǎng)，影響患者的生活質(zhì)量，這就使得延長(zhǎng)EH的半衰期勢(shì)在必行。

以往，延長(zhǎng)半衰期主要通過(guò)結(jié)合線性或支鏈的聚乙二醇（PEG）[16-17]來(lái)增加相對(duì)分子質(zhì)量和流體半徑。雖然PEG已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全分子（general recognized as safe，GRAS），但依然存在一些問(wèn)題，如在腎外皮管上皮細(xì)胞形成空泡、在體內(nèi)不被降解、價(jià)格昂貴、與蛋白間化學(xué)結(jié)合后需要再純化結(jié)合物等，因此許多研究者也在努力尋求更安全價(jià)優(yōu)的取代物。另一種提高藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法為糖基化，以此降低降解，延長(zhǎng)半衰期[18]。利用融合蛋白提高多肽和小分子蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)被廣泛應(yīng)用，最常用的融合活性蛋白或多肽為白蛋白、人免疫球蛋白IgG的Fc片段和沒(méi)有結(jié)構(gòu)的多聚肽鏈，如XTEN，目前有43種融合蛋白處于Ⅱ、Ⅲ期臨床階段，其中20種被確認(rèn)可以延長(zhǎng)目的蛋白的半衰期[18]。

Fc融合蛋白的理念在1980年代首次提出，1998年，第一個(gè)Fc融合蛋白依那西普（etanercept）獲準(zhǔn)上市。至2015年5月，11種不同類型的Fc融合蛋白被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。其中，2014年上市的 Eloctate、Alprolix、Trulicity的半衰期分別從 12h、18h、1～2min提高到 19h、83h、3.75d[17]。因此，利用Fc與目的蛋白融合來(lái)延長(zhǎng)半衰期不僅具有研究?jī)r(jià)值，更有市場(chǎng)價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)將EH與Fc進(jìn)行融合，把Fc設(shè)計(jì)在EH的下游，保證EH的N端EPR充分暴露，可以被FⅩa和FⅪa識(shí)別并裂解，從而保留其抗凝活性的靶向性釋放。EH與Fc之間采用一段剛性α螺旋連接肽（AEAAAKEAAAKEAAAKA），以此降低EH和Fc分子間的相互影響。

我們通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，初步確定了重組蛋白能在CHO細(xì)胞里表達(dá)，篩選了穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞株，培養(yǎng)上清經(jīng)親和層析獲得了純度較高的融合蛋白。單鏈融合蛋白EH-L-Fc理論相對(duì)分子質(zhì)量為33 880，我們獲得的融合蛋白經(jīng)質(zhì)譜分析，其相對(duì)分子質(zhì)量為72 168，說(shuō)明EH-L-Fc以二聚體形式存在，但表達(dá)產(chǎn)物的分子比二聚體理論分子量大，其原因可能是融合蛋白發(fā)生了糖基化，這有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示完整的EH-L-Fc蛋白的確無(wú)抗凝活性，但經(jīng)FⅩa酶切后可釋放其抗凝活性，其抗凝比活性為96.6 ATU/mg，EH抗凝活性為512 ATU/mg，該抗凝比活性換算成摩爾分子抗凝活性時(shí)，與EH的摩爾分子抗凝活性（數(shù)據(jù)）相當(dāng)，說(shuō)明與Fc融合后，EH的生物特性基本沒(méi)有受到影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)CHO表達(dá)系統(tǒng)可以獲得保留EH生物特性的EH-L-Fc融合蛋白，初步顯示了EH-L-Fc融合蛋白的成藥可能性。后續(xù)工作將繼續(xù)改進(jìn)完善純化工藝，并驗(yàn)證融合蛋白在體內(nèi)延長(zhǎng)半衰期的效果。

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Expression,Purification and Function Analysis of EH-L-Fc Fusion Protein

PANG Yu-Hong1,LIU Yu-Bin2,YU Ai-Ping2*,LYU Ying-Tao1*
1.Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042;2.Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850;China
*Co-corresponding authors,LYU Ying-Tao,E-mail:ytlv@sina.com;YU Ai-Ping,E-mail:yuap117@163.com

Objective:To prolong the half-life of recombinant neorudin（EH）,a new form of recombinant neoru?din（EH-L-Fc） was constructed by fusion of the neorudin gene and the coding sequence for fragment of human IgG1 with a rigid linker peptide,and the function of EH-L-Fc was analyzed.Methods:The fusion gene was ob?tained by SOE-PCR,and constructed into expression vector pcDNA3.1.The recombinant pcDNA3.1-Eh-L-Fc was transfected into CHO cells by liposomes.Stable gene expression cell lines were selected by geneticin（G418） resis?tance screening.The expression of EH-L-Fc protein in the cell culture supernatant was measured by Western blot?ting.The monoclone was selected from the resistance screening polyclone by limiting dilution analysis.The fusion protein was purified by Protein A affinity chromatography,and then the purity of the EH-L-Fc protein was ana?lyzed by SDS-PAGE and RP-HPLC.The fusion protein was cleaved by coagulation factorⅩa and the anticoagu?lant activity was determined in vitro by fibrin clot method.Results:The results showed that the recombinant ex?pression vector pcDNA3.1-Eh-L-Fc was successfully constructed,and the stable cell clone CHO-pcDNA3.1-Eh-LFc was obtained.The expression product is a dimer with a molecular weight of 72 168 Da.The purity of the re?combinant protein was 93.9％with a 96.9 ATU/mg anticoagulant specific activity after cleaved by factorⅩa.The complete recombinant EH-L-Fc has no anticoagulant activity.Conclusion:The stable CHO cell line harboring the recombinant Eh-L-Fc was successfully obtained.The EH-L-Fc fusion protein with a high purity and bioactivity af?ter cleavage by factorⅩa provides an important foundation for the further research of long acting EH-L-Fc.

neorudin;anticoagulant;Fc-fusion protein

Q78

A

1009-0002（2017）04-0422-07

2017-02-10

國(guó)家科技重大專項(xiàng)“重大新藥創(chuàng)制”（2012ZX09102301-008）

龐玉紅（1991- ），女，碩士研究生，（E-mail）15201048952@163.com

于愛(ài)平，（E-mail）yuap117@163.com；呂英濤，（E-mail）ytlv@sina.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.004