袁龍，鄭幽，范杰，梁劍青，牛祖彪，高麗華，黃紅艷，陳昭烈，管靜芝，孫強

1.山西醫(yī)科大學 第二臨床醫(yī)學院，山西 太原 030001；2.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100071；3.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，腫瘤治療性疫苗北京市重點實驗室，北京 100038；4.解放軍第309醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100091

低穩(wěn)定性綠色熒光蛋白EGFP-PEST的載體構(gòu)建及表達驗證

袁龍1,2，鄭幽2，范杰2，梁劍青2，牛祖彪2，高麗華2，黃紅艷3，陳昭烈2，管靜芝4，孫強2

1.山西醫(yī)科大學 第二臨床醫(yī)學院，山西 太原 030001；2.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100071；3.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，腫瘤治療性疫苗北京市重點實驗室，北京 100038；4.解放軍第309醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100091

目的：構(gòu)建含有蛋白降解基序PEST序列的增強型綠色熒光蛋白（EGFP）融合基因表達載體pQCXIP-EGFPPEST-N1，并檢測其對蛋白穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。方法：以NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES為模板，PCR擴增EGFP-PEST序列，克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-EGFP-N1構(gòu)建pQCXIP-EGFP-PEST-N1，病毒包裝后感染293FT細胞獲得穩(wěn)定細胞系；用蛋白酶體抑制劑MG-132處理細胞，Western印跡檢測EGFP的表達變化。結(jié)果：構(gòu)建獲得逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-EGFP-PEST-N1，感染293FT細胞后，與對照組相比，EGFP表達顯著降低，并且該降低可被MG-132處理逆轉(zhuǎn)。結(jié)論：構(gòu)建了EGFP-PEST蛋白的表達載體，PEST可以介導EGFP蛋白發(fā)生蛋白酶體依賴的降解。為實現(xiàn)基因編輯效果的可視化篩選奠定了基礎(chǔ)。

PEST序列；基因編輯；蛋白酶體；綠色熒光蛋白

PEST序列是許多短周期蛋白中相對保守的一段區(qū)域，它富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）、天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q），兩側(cè)一般由精氨酸和賴氨酸構(gòu)成。早在1986年，Rogers等通過對PEST穩(wěn)定性及序列的研究，推測PEST可能能夠調(diào)控細胞內(nèi)的蛋白表達水平[1]。隨后越來越多的研究證明PEST序列可通過泛素蛋白酶體途徑引起蛋白降解，其主要過程是：泛素被泛素激活酶（E1）激活后，可轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶（E2）并與之結(jié)合，隨后E2與泛素連接酶（E3）共同識別PEST序列并使其泛素化，最后含泛素化PEST序列的蛋白被26S蛋白酶體降解[2-3]。去除或突變PEST序列均會增強蛋白的穩(wěn)定性，減少蛋白的降解[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，當含PEST序列的蛋白與其他蛋白在物理結(jié)構(gòu)上發(fā)生緊密結(jié)合時，也會增加其結(jié)合蛋白的降解[6]。但并非所有含PEST序列的蛋白都會直接通過泛素蛋白酶體途徑降解，一些PEST序列只有在被激酶磷酸化后才會通過泛素蛋白酶體途徑引起蛋白降解；并且PEST序列中磷酸化位置的不同也會產(chǎn)生不同的結(jié)果，如血管內(nèi)皮生長因子PEST序列中的酪氨酸位點被磷酸化后使蛋白更加穩(wěn)定，而它的絲氨酸位點被磷酸化后會引起蛋白降解[7]。因此，可以通過融合PEST序列來調(diào)節(jié)特定蛋白的表達水平。

在進行基因編輯時，我們常使用增強型綠色熒光蛋白（EGFP）作為報告分子。但由于EGFP蛋白相對穩(wěn)定，降低了其對微弱基因編輯效果的報告敏感性。為此，我們嘗試構(gòu)建EGFP-PEST融合蛋白表達載體，利用PEST序列可通過泛素蛋白酶體途徑降解蛋白的功能，加快EGFP的降解，從而使得EGFP能夠更為靈敏地指示基因編輯效果，為實現(xiàn)基因編輯的可視化篩選奠定基礎(chǔ)。

為了獲得穩(wěn)定表達EGFP-PEST的細胞系，我們構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-EGFP-PESTN1，用所產(chǎn)生的病毒感染293FT細胞建立穩(wěn)定表達細胞株，以此為基礎(chǔ)檢測PEST序列對EGFP表達水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎細胞293FT來自美國ATCC細胞庫（采用Hyclones公司的DMEM-High Glucose培養(yǎng)基培養(yǎng)）；pQCXIP-EGFP-N1和NFATx6-mPro-EGFPPEST-YES載體均由本實驗室構(gòu)建；蛋白酶體抑制劑MG-132、EGFP抗體購自Sigma公司；胎牛血清購自德國PAN公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自田根生化科技有限公司；Q5高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶均購自NEB公司；pGEM-T載體購自Promega公司；脂質(zhì)體LipofectAMINE 2000購自Invitrogen Technolo?gy公司；引物由北京博邁德生物技術(shù)有限公司合成；測序由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 EGFP-PEST序列的擴增及pQCXIP-EGFPPEST載體的構(gòu)建

以NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES載體為模板，設(shè)計上游引物（5'-ACCGGTCGCCACCATGGT GAGCAAGG-3'）和下游引物（5'-CAATTGTTAGA CGTTGATCCTGGCGCTG-3'），利用PCR擴增獲得EGFP-PEST的編碼序列（擴增條件：98℃預變性30s；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；72℃終延伸120s），PCR反應(yīng)采用Q5高保真DNA聚合酶進行。用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，Taq酶加A后連入pEGM-T載體，雙酶切及測序結(jié)果鑒定正確后分別用AgeⅠ/MfeⅠ雙酶切，回收目的片段連入pQCXIP-EGFP-N1載體的AgeⅠ/MfeⅠ位點，獲得逆轉(zhuǎn)錄表達載體pQCXIP-EGFP-PEST-N1（圖1）。

1.3 病毒包裝、感染

將1×106/孔293FT細胞接種于六孔板，12h后進行病毒包裝。將400ng目的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（pQCXIP-EGFP-N1和pQCXIP-EGFP-PESTN1）與200ng Gag/Pol、250ng VSV-G加入100μL Opti-MEM中 ，再將2.5μL LipofectAMINE 2000加入100μL Opti-MEM中，靜置5min；將上述2種液體輕輕混勻，室溫放置25min，向混合液中補加800μL Opti-MEM，最后將混合液加入已接種細胞的六孔板中。6h后更換成有血清的DMEM培養(yǎng)基，24、48h后分別收取病毒上清，用4.5μm濾器過濾備用。靶細胞293FT按2×105/孔接種六孔板，12h后取上述病毒上清1mL+1mL全培養(yǎng)基+2μL Polybrene混合后感染293FT細胞，6h后換2mL新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，感染后24h用1μg/mL嘌呤霉素篩選3d，獲得穩(wěn)定細胞系。

1.4 Western印跡檢測

獲得穩(wěn)定細胞系后，將細胞按照5×105/孔接種于六孔板中，12h給予MG-132（終濃度為4μmol/L）處理，24h后收集細胞蛋白（每孔加入100μL含蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解30min后于4℃、12 000r/min離心15min，取上清進行蛋白定量，各樣品按照上樣量10μg進行蛋白電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，經(jīng)封閉、一抗過夜孵育（1∶1000稀釋）、二抗孵育等步驟后進行ECL顯色）。

2 結(jié)果

2.1 pQCXIP-EGFP-PEST表達載體的構(gòu)建

以NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES為模板，PCR擴增EGFP-PEST的編碼序列，獲得約850bp片段（圖2A），與預期大?。?43bp）相符，提示擴增成功。將目的片段連入pGEM-T載體，挑取2個克隆測序，結(jié)果均正確（測序結(jié)果未示）。將鑒定正確的克隆連入逆轉(zhuǎn)錄載體pQCXIP-EGFP-N1，挑取8個克隆進行菌液PCR鑒定，得到與預期相符合的條帶（圖2B），隨后將鑒定正確的克隆送測序并進行雙酶切鑒定，結(jié)果與預期相符（圖2C），序列正確（圖2D），提示pQCXIP-EGFPPEST-N1表達載體構(gòu)建成功。

圖1 pQCXIP-EGFP-PEST-N1表達載體構(gòu)建示意圖

2.2 PEST序列功能的檢測

為了檢測EGFP-PEST融合蛋白中PEST序列的功能，將載體pQCXIP-EGFP-N1和pQCXIPEGFP-PEST-N1進行病毒包裝進而感染293FT細胞，獲得穩(wěn)定細胞系。熒光顯微鏡下觀察2種細胞的GFP熒光強度，顯示EGFP-PEST的熒光強度明顯低于EGFP（圖3）。提示PEST的融合表達能夠降低細胞中EGFP的表達水平。

2.3 PEST序列作用機制檢測

為了檢測PEST對EGFP表達的影響是否通過泛素蛋白酶體途徑實現(xiàn)，我們用MG-132處理細胞，收集蛋白后用Western印跡檢測EGFP的表達變化，結(jié)果（圖4）顯示，MG-132處理后EGFPPEST的表達明顯上調(diào)，而EGFP的表達水平?jīng)]有明顯改變。說明PEST序列對EGFP蛋白表達水平的調(diào)節(jié)依賴于蛋白酶體降解途徑。

3 討論

圖2 EGFP-PEST的PCR擴增和表達載體構(gòu)建

圖3 EGFP-PEST熒光減弱（熒光顯微鏡20×）

圖4 EGFP-PEST的降解依賴于蛋白酶體通路

蛋白質(zhì)的降解在生物學過程中起重要作用，尤其是信號通路中的一些調(diào)節(jié)蛋白的水解會激活或失活下游信號分子，引發(fā)一系列生物反應(yīng)。PEST序列廣泛存在于細胞內(nèi)多種蛋白中，它作為泛素蛋白酶體途徑的降解信號，參與細胞的運動、應(yīng)激、代謝、增殖分化等過程[2,4-5,8]。

在以EGFP作為基因編輯效果報告分子時，由于EGFP表達穩(wěn)定，使得微弱的基因編輯效果難以被有效捕捉。為此，我們構(gòu)建了EGFP-PEST融合蛋白，PEST序列能夠被蛋白酶體識別，進而降解融合表達的EGFP，使細胞內(nèi)的EGFP熒光強度顯著減弱甚至消失。較短的半衰期使得EGFP-PEST的水平能夠及時靈敏地反映新合成蛋白的表達水平，為基因編輯的可視化篩選奠定了基礎(chǔ)。

PEST在疾病的發(fā)生和治療中也有著關(guān)鍵作用。已有研究報道，將亨廷頓蛋白抗體編碼序列與PEST融合表達，可長時間而高效地降解亨廷頓蛋白，達到治療小鼠模型舞蹈病的效果[9]；淋巴細胞白血病基因1（lymphoblastic leukemia1，LYL1）編碼的蛋白是一種與白血病發(fā)展密切相關(guān)的促腫瘤轉(zhuǎn)錄因子，其蛋白序列中包含PEST序列，并且可通過泛素蛋白酶體途徑降解，提示PEST序列與白血病的發(fā)生密切相關(guān)[10]；真核翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白會引起糖尿病誘導的視力障礙，通過對這種蛋白序列進行分析發(fā)現(xiàn)其中存在PEST區(qū)域，而當PEST上蘇氨酸糖基化時可阻斷該蛋白通過泛素蛋白酶體途徑降解，這一結(jié)果提示PEST序列可能與糖尿病誘導的視力障礙發(fā)生有關(guān)[11]。因此，本研究有望為探究疾病機理提供新的工具。

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Constructing Vector for the Expression of EGFP-PEST,a Modified Enhanced Green FluorescentProtein with Low Stability

YUAN Long1,2,ZHENG You2,FAN Jie2,LIANG Jian-Qing2,NIU Zu-Biao2,GAO Li-Hua2,HUANG Hong-Yan3,CHEN Zhao-Lie2,GUAN Jing-Zhi4*,SUN Qiang2*
1.Second Medical College,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001;2.Beijing Institute of Biotechnology,Bei?jing 100071;3.Department of Medical Oncology,Beijing Shijitan Hospital,Capital Medical University,Beijing Key Laboratory of Cancer Therapeutic Vaccine,Beijing 100038;4.Department of Medical Oncology,PLA 309 Hos?pital,Beijing 100091;China
*Co-corresponding authors,GUAN Jing-Zhi,E-mail:jzjz1970@hotmail.com;SUN Qiang,E-mail:sunq@bmi.ac.cn

Objective:To construct retroviral vector pQCXIP-EGFP-PEST-N1 for the expression of EGFP-PEST protein,and examine the effects of PEST motif on EGFP stability.Methods:DNA fragment containing EGFPPEST was amplified by PCR from NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES as template,and then cloned into the retrovi?ral expression vector pQCXIP-EGFP-N1 to generate pQCXIP-EGFP-PEST-N1,which was packaged into retrovirus to infect 293FT cells.Western blot was employed to examine changes at protein level upon treatment of protea?some inhibitor（MG-132）.Results:Compared with pQCXIP-EGFP-N1 virus,retroviral vector of pQCXIP-EGFPPEST-N1 produced significantly lower EGFP in 293FT cells,and MG-132 treatment reverted the expression of EGFP-PEST but not EGFP,suggesting effective PEST-mediated degradation via proteasome.Conclusion:A vector has been constructed to express EGFP-PEST,and PEST motif has been proved to effectively mediate EGFP degra?dation in a proteasome-dependent manner.This work set a basis for visualing target screen in gene edition.

PEST motif;gene edition;proteasome;EGFP

Q78

A

1009-0002（2017）04-0405-05

2017-01-12

國家自然科學基金（81572799，31671432）；國家重點研發(fā)計劃（2016YFC1303303）

袁龍（1989- ），男，碩士研究生，（E-mail）1020264077@qq.com；鄭幽（1989- ），女，助理研究員，（E-mail）zhengyousic@163.com

管靜芝，（E-mail）jzjz1970@hotmail.com；孫強，（E-mail）sunq@bmi.ac.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.001