李秀芳 林麗紅 黃相艷

流式細胞術下ARH對比LRH對早期宮頸癌患者外周血及腹腔液中Th1/Th2細胞因子的影響

李秀芳 林麗紅 黃相艷

目的探討腹腔鏡宮頸癌根治術(laparoscopic radical hysterectomy，LRH)以及開腹宮頸癌根治術(abdominal radical hysterectomy，ARH)對早期宮頸癌患者機體的局部以及免疫系統(tǒng)的影響。方法選取早期(Ⅰa2～Ⅱa1)宮頸癌患者210例，分LRH組(行腔鏡手術)118例，ARH組(行腹式手術)92例。分別在術前1天、術后1天、術后3天抽取觀察組和對照組患者肘部靜脈血10 ml，在術中(在開腹后或者腹腔鏡進入腹部后立刻抽取腹腔沖洗液)、術后1天、術后3天抽取患者腹腔液5 ml，利用流式細胞術檢測腹腔液中和外周血TH1/TH2細胞因子，比較LRH組和ARH組術前術后免疫狀態(tài)的變化。結果術后第1天ARH組TNF-α水平上升，然而LRH組變化不明顯；術后第3天ARH組表達水平繼續(xù)上升，LRH組變化不大，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。術后1天2組的TH1/TH2比值均下降，與術前1天相比相對降低，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術后1月，2組患者TH1/TH2比值恢復術前水平。ARH組術后1天至術后3天IL-6水平比術中升高(P<0.05)，而LRH組升高程度較小(P<0.05)。結論腔鏡下宮頸癌根治術與開腹宮頸癌根治術相比對于全身的免疫系統(tǒng)干擾更小，并且創(chuàng)傷更小，恢復更迅速，可以廣泛應用于宮頸癌的臨床治療。

腹膜免疫；子宮頸癌；腹腔鏡宮頸癌根治術；TH1/TH2細胞因子

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1527～1530)

隨著醫(yī)療技術的快速發(fā)展，腹腔鏡手術在癌癥的治療領域得到了廣泛應用。比起開腹手術，腔鏡手術對患者的免疫系統(tǒng)影響更小，術后并發(fā)癥少，住院時間短，并且其具有創(chuàng)傷小、術口更加美觀等優(yōu)勢，因此備受廣大患者及醫(yī)務者的青睞[1-3]。流式細胞術是在細胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細胞或其他生物粒子進行多參數(shù)、快速的定量分析。它可以高速分析上萬個細胞，并能同時測得一個細胞的多個參數(shù)，具有準確性好、精度高、速度快的優(yōu)點[4-5]。本研究通過流式細胞術來檢測腹腔宮頸癌根治術及開腹宮頸癌根治術的術前術后血液中和腹腔液中Th1/Th2細胞因子含量，探究腹腔鏡與開腹宮頸癌根治術對患者免疫系統(tǒng)和術后恢復的影響，為早期宮頸癌患者術式的選擇和預后判斷提供可靠的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在我院2011年7月至2016年2月間治療的早期(Ⅰa2～Ⅱa1)宮頸癌患者210例。根據(jù)手術方式分為LRH組(腔鏡手術)118例，ARH組(腹式手術)92例。2組實驗對象手術時均全身麻醉，手術過程中都補充充分血容量，術中、術后未輸血。ARH組患者平均年齡(42.7±8.1)歲，體重指數(shù)(24.1±3.1)kg/m2；鱗癌80例，腺癌12例；Ⅰa2期0例，Ⅰb1期84例，Ⅰb2期4例，Ⅰa1期4例。LRH組患者平均年齡(41.3±6.4)歲，體重指數(shù)(23.5±2.5)kg/m2；鱗癌102例，腺癌16例；Ⅰa2期6例，Ⅰb1期108例，Ⅰb2期4例。本研究獲我院倫理委員會批準，患者或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 實驗病例選擇標準

納入標準：都為原發(fā)性腫瘤且確診為宮頸癌；全部患者手術前均經(jīng)過胸片和全身的淋巴結、盆、腹腔的B超檢查；手術前排除其他的內外科合并癥；術后不接受免疫增強的治療；后續(xù)的系統(tǒng)治療都在我院進行。排除標準：除宮頸癌外患有其他癌癥；患者具有自身免疫病或重大免疫缺陷；患者不同意參與此次研究。

1.3 試劑和主要儀器

試劑：Cytometric Bead Array(CBA)(美國BD公司生產(chǎn))；儀器：流式細胞儀FACSCalibur(美國BD公司)、超凈工作臺(Forma)、超低溫冰箱(Forma)、低溫高速離心機(Hemeus)及Lml吸頭(Asygen)。

1.4 方法

1.4.1 檢測方法 試劑：①BD Cytometric Bead Array Huaman Th1/Th2 Cytokine Kit Ⅱ，以此鑒別細胞因子的免疫表形。②PBS.PH保持在7.2～7.4。外周血和腹腔液的收集 ：主要是收集實驗組與對照組患者術后1天、3天的空腹外周血5 ml，收集后加0.8 ml ACD抗凝劑，充分混合，保存在冰盒中送至實驗室。在腹腔中取腹腔積液2 ml，整個過程迅速流暢，術后1天及3天從引流管取液2 ml，收取后送至實驗室分離，取上清液，于-30 ℃的冰箱中冷藏。

1.4.2 實驗步驟 檢測血液中Th1/Th2：取2 ml血液，1∶1的比例與PBS混合稀釋，取3 ml復溫后的人淋巴細胞分離液，放入離心管中，稀釋后的血液4 ml鋪在分離液之上，將1 500 rpm離心半小時，取中間白色層，加入PBS 2 ml后，離心10 min，取上清液，加入300 μl DMEM培養(yǎng)基，取100 μl放入離心管中，使用DMEM培養(yǎng)基稀釋；37 ℃下，5%CO2在培養(yǎng)箱中孵育5 h左右，將100 μl液體放入離心管中，加入2.5 μl CD8-TC和10 μl CD-3APC，避光室溫條件下孵育15 min，加入3 ml PBS，1 500 rpn離心5 min，除去上清液，用移液器混勻少許剩余液體；混合均勻的液體避光15 min，加入3 ml PBS，1 500 rpn離心5 min，除去上清液，用0.5 ml PBS重懸后，上機。

1.4.3 檢測腹腔液中Th1/Th2細胞因子 Th1和Th2細胞對機體的特異性免疫和非特異性免疫都有重要的調節(jié)作用，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，促進B細胞產(chǎn)生抗體，Th1細胞在機體抗胞內病毒感染中具有重要作用。當機體受到異己抗原攻擊時，會出現(xiàn)Th1或Th2細胞群功能升高，該現(xiàn)象即為Th1/Th2漂移。從冰箱中取出之前收集的標本，在37 ℃環(huán)境下解凍，準備潔凈的流式管，標準品和腹腔液樣本，分別加入50 μl混合捕獲微球，向標準品中加入50 μl的人炎癥因子稀釋液，樣本管中加入50 μl腹腔液標本，在室溫、避光條件下孵育1.5 h，加入1 ml洗滌緩沖劑，然后離心5 min，除去上清液，留下100 μl左右液體進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對實驗所得的數(shù)據(jù)進行處理和分析，組間數(shù)據(jù)對比采用t檢驗和卡方檢驗，P<0.05視為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ARH和LHR術中和術后情況比較

ARH組手術用時與LRH組比較，差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；ARH組術中出血量比較多，并且通氣時間比較長，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組術后情況比較

2.2 ARH組和LRH組術中、術后1天腹腔液中TNF-α表達水平的變化和比較

術后第1天ARH組TNF-α水平上升(P<0.05)，然而LRH組變化不明顯；術后第3天ARH組表達水平繼續(xù)上升，LRH組變化不大，見表2。

表2 2組術后TNF-α表達水平比較

2.3 2組腹腔液里TH1/TH2比值水平變化

術后1天2組的TH1/TH2比值均下降，與術前1天相比相對降低，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術后1月，2組患者TH1/TH2比值恢復到術前水平，見表3。

表3 2組腹腔液TH1/TH2比值水平變化

2.4 ARH組和LRH組術中、術后1天、術后3天腹腔液IL-6表達水平的變化情況

ARH組術后1天至術后3天IL-6水平比術中顯著升高(P<0.05)，而LRH組升高程度較小(P<0.05)，見表4。

表4 ARH組和LRH組術中、術后1天、術后3天IL-6表達水平的變化情況

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率有上升趨勢。隨著宮頸細胞學篩查的普遍應用，宮頸癌能夠在早期被發(fā)現(xiàn)并進行治療[6-8]。腹腔鏡手術技術的出現(xiàn)，對患者機體免疫系統(tǒng)的影響將進一步大幅度降低，在今后必將成為主流手術方式。流式細胞術在國內外宮頸癌患者的治療中發(fā)揮著重要作用，目前已被廣泛應用于宮頸癌的臨床治療，治療療效得到了眾多患者的認可[9-11]。

本次研究通過觀察2種不同手術方式對腹腔液中TH1/TH2細胞因子影響情況，在術中不同時間段的研究表明，術后第1天ARH組TNF-α水平上升，然而LRH組變化不明顯；術后第3天ARH組表達水平繼續(xù)上升，LRH組變化不大，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義。術后1天2組的TH1/TH2比值均下降，與術前1天相比相對降低，ARH組降低程度更大，提示行ARH手術方案的患者創(chuàng)傷更大，組間差異具有統(tǒng)計學意義，術后1月，兩組患者TH1/TH2比值恢復術前水平。ARH組術后1天至術后3天IL-6水平比術中升高(P<0.05)，而LRH組升高程度較小。Th1和Th2細胞對機體的特異性免疫和非特異性免疫都有重要的調節(jié)作用，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，促進B細胞產(chǎn)生抗體，Th1細胞在機體抗胞內病毒感染中具有重要作用。當機體受到異己抗原攻擊時，會出現(xiàn)Th1或Th2細胞群功能升高，該現(xiàn)象即為Th1/Th2漂移。出現(xiàn)上述結果的主要原因是腔鏡式手術創(chuàng)傷程度更小，而創(chuàng)傷程度恰恰是外科類手術對細胞免疫的影響因素。手術損傷會造成Th1、Th2平衡進一步破環(huán)，手術創(chuàng)傷口越大，平衡越向Th2偏移，由此說明開腹比腔鏡對細胞免疫的抑制更嚴重。

綜上所述，腔鏡下宮頸癌根治術與開腹宮頸癌根治術相比對于全身的免疫系統(tǒng)干擾更小，并且創(chuàng)傷更小，恢復更迅速，可以廣泛應用于宮頸癌的臨床治療。

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(編輯：甘艷)

FlowCytometryunderARHContrastLRHEarlyCervicalCancerinPeripheralBloodandPeritonealLiquidTh1/Th2CellFactor

LIXiufang，LINLihong，HUANGXiangyan.

AnyangTumorHospital，Anyang，455000

ObjectiveTo study the effect of laparoscopic radical hysterectomy(LRH) and abdominal radical hysterectomy (ARH) on patients’ immune system.Methods210 cases of (Ⅰa2～Ⅱa1) patients with early cervical cancer were divided into the observation group and the control group， the experimental group

LRH (118 cases) and the control group received ARH(92 cases ).Respectively 1 day before surgery，1 day，3 days after extraction of the 2 groups elbow venous blood 10 ml，during surgery (laparotomy or laparoscopy after extraction into the abdomen immediately peritoneal fluid)，after 1 day，3 days after extracting 5ml peritoneal fluid of patients using flow cytometry before change in peritoneal fluid and peripheral blood of TH1/TH2 cytokines，the experimental group and control group postoperative immune status.ResultsAfter first days,the level of TNF-α in ARH group increased, but the change of LRH group was not obvious. The expression level of ARH Group continued to rise third days after operation, and the change of LRH group was not big. The difference between two groups was statistically significant (P<0.05). 1 days after operation, the ratio of TH1/TH2 in the 2 groups decreased, compared with the 1 day before operation, the difference was statistically significant (P<0.05), and in January, the ratio of TH1/TH2 in the two groups was restored to the preoperative level. In the ARH group, the IL-6 level increased 1 days after operation and 3 days after operation (P<0.05), while the LRH group was less elevated (P<0.05).ConclusionCompared with open radical cervical surgery,laparoscopic radical surgery for cervical cancer has less interference to the systemic immune system,less trauma and quicker recovery.It can be widely used in the clinical treatment of cervical cancer.

Immunized intraperitoneally；Cervical cancer；Laparoscopic radical hysterectomy(LRH)；TH1/TH2 cytokines

455000 河南省安陽市腫瘤醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.039

R737.33

A

1001-5930(2017)09-1527-04

2016-09-23

2017-03-09)