胡信 潘君芬 吳國(guó)民

CIP2A在鼻咽癌中的表達(dá)及其與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系研究

胡信 潘君芬 吳國(guó)民

目的分析蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（CIP2A）在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，并探討其與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系。方法 選取鼻咽癌病理標(biāo)本70例，另?yè)裾１茄什拷M織30例作為對(duì)照。采用免疫組化法檢測(cè)CIP2A蛋白表達(dá)情況，采用RT-PCR法檢測(cè)CIP2A mRNA表達(dá)情況。觀察并比較CIP2A蛋白、mRNA在鼻咽癌及鼻咽部正常組織中的表達(dá)情況；分析CIP2A mRNA表達(dá)水平與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 鼻咽癌組織中CIP2A蛋白、mRNA陽(yáng)性表達(dá)率均高于鼻咽部正常組織（65.71%vs 26.67%、81.43%vs 16.67%，均P＜0.05）。CIP2A mRNA表達(dá)水平與鼻咽癌患者性別、年齡、病理類型無(wú)關(guān)（均P＞0.05），而與表示腫瘤范圍的T分期、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移的N分期及綜合的臨床分期有關(guān)（均P＜0.05）。結(jié)論 CIP2A與鼻咽癌的發(fā)生和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為判斷鼻咽癌惡性程度的一個(gè)重要生物學(xué)指標(biāo)。

鼻咽癌 CIP2A 免疫組化 RT-PCR

鼻咽癌是我國(guó)，尤其是長(zhǎng)江以南地區(qū)的一種高發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病率居于耳鼻咽喉科惡性腫瘤首位。鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，以往的研究表明其發(fā)生是EB病毒感染、遺傳易感性、環(huán)境致癌物等多種因素共同作用的結(jié)果。蛋白磷酸酶2A（PP2A）的癌性抑制因子（CIP2A）是一種內(nèi)源性蛋白，可通過(guò)與癌轉(zhuǎn)錄因子c-Myc直接結(jié)合，在分子水平對(duì)PP2A起到抑制作用，進(jìn)一步抑制c-Myc蛋白水解，可能在促進(jìn)細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化、維持細(xì)胞的惡性表型方面起重要作用[1]。研究表明，CIP2A在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，如結(jié)腸癌[2]、胃癌[3]、非小細(xì)胞肺癌[4]、乳腺癌[5]等，但其在鼻咽癌中的表達(dá)情況報(bào)道少見(jiàn)。本研究采用RT-PCR、免疫組化法分析CIP2A在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，并探討其與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2010年7月至2013年7月在本院門(mén)診行鼻咽部活檢，后確診為鼻咽癌的70例患者的病理標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療。其中男64例，女6例；年齡28～72歲，中位年齡57.5歲；未分化型鼻咽癌29例，低分化型鼻咽癌41例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期各35例。TNM分期T1期25例，T2期26例，T3期13例，T4期 6例；N1期 15例，N2期 22例，N3期 6例，N0期27例；無(wú)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。所有標(biāo)本均為活檢時(shí)即刻獲取的新鮮組織，組織標(biāo)本在獲取后立即一分為二，其中一份立即轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱中冷凍保存以供RT-PCR檢測(cè)時(shí)使用，而準(zhǔn)備用于免疫組化檢測(cè)的另一份標(biāo)本放入10%甲醛溶液中固定。另?yè)褚虮茄什烤植柯∑鸲斜茄什炕顧z、并病理證實(shí)為鼻咽部黏膜慢性炎的30例基本正常鼻咽部組織作為對(duì)照。

1.2 主要試劑及RT-PCR引物 CIP2A多克隆抗體（Santa Crus公司）；生物素標(biāo)記的羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；S-P免疫組化試劑盒以及DAB溶液PBS（pH=7.4）（福州邁新生物科技有限公司）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI1640干粉（Gibco公司）；RNA Fast200總RNA極速提取試劑盒（上海飛捷生物公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及 2×Taq PCR Mastermix（TaKaRa公司）。根據(jù)人類CIP2A的cDNA序列，應(yīng)用Primer軟件設(shè)計(jì) PCR引物，上游引物 5′-TACGAATTCATGCGACGGCTGCTGATC-3′，下游引物 5′-TACCTCGAGGGAGAAGGCGAACTGTCCAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物共307bp。以β-actin基因表達(dá)產(chǎn)物作內(nèi)參照設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游引物 5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物共197 bp，由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 CIP2A蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化SP法。所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，用SP法進(jìn)行免疫組化染色，CIP2A多克隆抗體濃度1∶200，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，顯微鏡下觀察，成像系統(tǒng)拍照并對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行分析。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為Santa Cruz公司提供的陽(yáng)性片。由2位病理科醫(yī)師讀片，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比綜合結(jié)果評(píng)估。染色強(qiáng)度評(píng)分：（1）陰性：與背景色一致，得 0 分；（2）弱陽(yáng)性：淡黃色，得 1 分；（3）陽(yáng)性：黃色，得2分；（4）強(qiáng)陽(yáng)性：棕黃色，得3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：（1）＜10%，得 0分；（2）11%～25%，得 1分；（3）26%～50%，得 2分；（4）＞50%，得 3分。采用染色強(qiáng)度評(píng)分乘以陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分的積作判定：＜2分為陰性（-），2～4分為弱陽(yáng)性（±），5～7分為陽(yáng)性（+），＞7分為強(qiáng)陽(yáng)性（++）；除去陰性結(jié)果的所有弱陽(yáng)性、陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性視為CIP2A蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.2 CIP2A mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法進(jìn)行基因擴(kuò)增，以2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。鼻咽癌和正常鼻咽部組織中總RNA按Fast200總RNA極速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行提取，溶于無(wú)RNase酶水中，-80℃保存?zhèn)溆?。?yīng)用PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，取1μg總RNA，在10μl體系中以O(shè)ligo dT Primer為引物，應(yīng)用PrimeScriptTMRT Enzyme Mix逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。按照2×Taq PCR Mastermix試劑說(shuō)明配置PCR反應(yīng)體系，合成所得PCR產(chǎn)物在4℃下保存，然后取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl點(diǎn)樣于20g/L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。應(yīng)用Gene Snap軟件系統(tǒng)分析擴(kuò)增條帶，未顯示CIP2A基因擴(kuò)增條帶表示CIP2A mRNA陰性表達(dá)，顯示CIP2A基因擴(kuò)增條帶表示CIP2A mRNA陽(yáng)性表達(dá)；將CIP2A基因與β-actin基因擴(kuò)增條帶吸光度值的比值（CIP2A/β-actin）計(jì)為CIP2A mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察并比較CIP2A蛋白、mRNA在鼻咽癌及鼻咽部正常組織中的表達(dá)情況；分析CIP2A mRNA表達(dá)水平與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIP2A蛋白在鼻咽癌及鼻咽部正常組織中的表達(dá)情況比較 見(jiàn)圖1。

圖1 CIP2A蛋白在鼻咽癌及鼻咽部正常組織中的表達(dá)情況（a：鼻咽癌組織；b：鼻咽部正常組織；SP法，×400）

由圖1可見(jiàn)，CIP2A蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色細(xì)小顆粒，也可以呈彌漫分布。鼻咽癌組織中CIP2A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為65.71%（46/70），而鼻咽部正常組織中CIP2A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為26.67%（8/30），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 CIP2A mRNA在鼻咽癌及鼻咽部正常組織中的表達(dá)情況比較 見(jiàn)圖2。

圖2 CIP2A mRNA在鼻咽癌及鼻咽部正常組織中的表達(dá)電泳圖（C：鼻咽癌組織；N：正常鼻咽部組織）

由圖2可見(jiàn)，鼻咽癌組織中CIP2A mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為81.43%（57/70），鼻咽部正常組織中CIP2A mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為16.67%（5/30），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。鼻咽癌組織中CIP2A mRNA的平均表達(dá)水平為0.57，鼻咽部正常組織CIP2A mRNA的平均表達(dá)水平為0.11，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2.3 CIP2A mRNA表達(dá)水平與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系 以70例鼻咽癌組織中CIP2A mRNA的平均表達(dá)水平（0.57）為界，將其分為高表達(dá)組（≥0.57，共46例）及低表達(dá)組（＜0.57，共24例）。CIP2A mRNA表達(dá)水平與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，CIP2A mRNA表達(dá)水平與鼻咽癌患者性別、年齡、病理類型無(wú)關(guān)（均P＞0.05），而與表示腫瘤范圍的T分期、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移的N分期及綜合的臨床分期有關(guān)（均P＜0.05）。

表1 CIP2AmRNA表達(dá)水平與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

3 討論

CIP2A是一種能夠抑制PP2A活性的蛋白，可以通過(guò)抑制PP2A對(duì)癌蛋白c-Mycr的脫磷酸化作用，穩(wěn)定c-Myc蛋白二元磷酸化結(jié)構(gòu)，減少c-Myc蛋白被泛素化水解；同時(shí)，作為核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的c-Myc又能促進(jìn)CIP2A mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而形成一個(gè)正反饋環(huán)路[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在良性組織中，除在骨髓、腦和前列腺等組織中CIP2A mRNA呈中高度表達(dá)外，其余組織中表達(dá)均較低或無(wú)表達(dá)[7]。但在許多惡性腫瘤中，如結(jié)腸癌[2]、胃癌[3]、非小細(xì)胞肺癌[4]以及乳腺癌[5]中CIP2A都高表達(dá)，且與腫瘤惡性程度，特別是與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，影響患者預(yù)后。CIP2A在維持細(xì)胞表形轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞增殖和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)方面起關(guān)鍵作用[1]。CIP2A的過(guò)度表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖，阻止細(xì)胞衰老[7]。許多研究已經(jīng)表明癌蛋白c-Myc在許多惡性腫瘤的癌性增生與發(fā)展階段起重要作用，并且在癌變后仍持續(xù)呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，是惡性腫瘤浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)及預(yù)后等生物學(xué)行為的影響因素[8-12]。而CIP2A通過(guò)抑制PP2A而促進(jìn)c-Myc的表達(dá)，因此，推測(cè)CIP2A可能和腫瘤的浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)及預(yù)后有關(guān)。

本研究應(yīng)用免疫組化和RT-PCR的方法檢測(cè)了CIP2A在鼻咽癌及正常鼻咽部組織中的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果顯示，在65.71%的鼻咽癌組織中檢測(cè)到CIP2A蛋白陽(yáng)性表達(dá)，要明顯高于正常鼻咽部組織中CIP2A蛋白陽(yáng)性表達(dá)（26.67%），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同樣，RT-PCR結(jié)果也顯示CIP2A mRNA在鼻咽癌組織中的表達(dá)明高于正常鼻咽部組織，以上結(jié)果提示CIP2A可能與鼻咽癌的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步分析CIP2A的表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在腫瘤原發(fā)灶周邊的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中，根據(jù)TNM分期中的T分期，級(jí)別越高的腫瘤組織中CIP2A表達(dá)要高于級(jí)別低的；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CIP2A的表達(dá)要明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的，而且N分期越高，CIP2A表達(dá)也越高；綜合起來(lái)按臨床分期比較，Ⅲ～Ⅳ期的鼻咽癌組織CIP2A表達(dá)水平也顯著高于Ⅰ～Ⅱ期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但在不同年齡段、不同性別以及不同病理類型中，CIP2A表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示CIP2A可能與鼻咽癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程有關(guān)，是造成鼻咽癌預(yù)后不良的因素之一。但CIP2A在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚不明確，尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，CIP2A與鼻咽癌的發(fā)生和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為判斷鼻咽癌惡性程度的一個(gè)重要生物學(xué)指標(biāo)，有望成為腫瘤綜合治療的作用靶點(diǎn)。

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Expression of CIP2A in nasopharyngeal carcinoma and its clinicopathological significance

HU Xin,PAN Junfen,WU Guomin.Department of Otorhinolaryngology,Zhejiang Taizhou Hospital,Taizhou 317000,China

ObjectiveTo investigate the expression of cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A (CIP2A)in nasopharyngeal carcinoma(NPC)and its clinicopathological significance.Methods The expression of CIP2A protein and mRNA in 70 specimens of NPC and 30 specimens of normal nasopharyngeal tissue was detected by immunohistochemistry and RT-PCR,respectively.The correlation between CIP2A expression and clinicopathological features of NPC was analyzed. Results The expression of CIP2A protein and mRNA was higher in NPC than that in normal nasopharyngeal tissue(65.71%vs 26.67%,81.43%vs 16.67%,respectively,both P＜0.05).The expression of CIP2A mRNA was correlated with tumor size,lymph node metastasis and clinic stages of NPC (all P＜0.05),not with the gender,age of the patients and pathological type(P＞0.05).Conclusion CIP2A may be associated with the occurrence,invasion and metastasis of NPC,suggesting that it can be used as an indicator for malignant degree ofnasopharyngealcarcinoma.

Nasopharyngealcarcinoma(NPC) Cancerous inhibitor ofprotein phosphatase 2A(CIP2A) Immunohistochemistry RT-PCR

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.19.2017-1670

317000 浙江省臺(tái)州醫(yī)院耳鼻咽喉科（胡信、吳國(guó)民），病案統(tǒng)計(jì)室（潘君芬）

胡信，E-mail：hu0428@126.com

2017-07-13）

（本文編輯：李媚）