毛曉潔 王新民 趙英 周義清 孫建光

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2. 國家環(huán)境保護(hù)創(chuàng)面生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)中心 路域生態(tài)工程有限公司，北京 100082）

多功能固氮菌篩選及其在土壤生態(tài)修復(fù)中的應(yīng)用

毛曉潔1王新民2趙英2周義清1孫建光1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2. 國家環(huán)境保護(hù)創(chuàng)面生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)中心 路域生態(tài)工程有限公司，北京 100082）

以固氮酶和ACC（1-aminocyclopropane-1- carboxylate，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）脫氨酶活性為指標(biāo)篩選功能菌株，研制菌劑，用于修復(fù)生荒地土壤生態(tài)。采用乙炔還原法測定菌株固氮酶活性；比色法定量測定ACC脫氨酶活性；PCR擴(kuò)增得到菌株16S rRNA，通過序列分析、比對研究菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位；通過形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列比對鑒定菌種。結(jié)果顯示，篩選到固氮酶活性大于9 nmol/（h·mg）的菌株共計(jì)47株，其中43株的固氮酶活性大于陽性對照固氮菌劑生產(chǎn)菌株圓褐固氮菌ACCC11103。篩選到產(chǎn)生ACC脫氨酶的菌株20株，ACC脫氨酶活性為0.326-21.980 μmol/（h·mg）。將篩選到的功能菌株接種小白菜測試促生效應(yīng)，其中47株使普通白菜（Brassica campestris）鮮重增加。16S rRNA測序鑒定顯示篩選到的51株功能菌株系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于農(nóng)桿菌、節(jié)桿菌、芽孢桿菌、伯克氏菌、鞘氨醇桿菌、屈撓桿菌、劍菌、腸桿菌、溶桿菌、微球菌、類芽孢桿菌、葉桿菌、假單胞菌、根瘤菌、中華根瘤菌、芽孢乳桿菌等16屬31種。選取高效菌株7012、7134、7144和7164作為核心菌株制備了固氮多功能菌劑，應(yīng)用于生荒地，試驗(yàn)地土壤微生物數(shù)量顯著提高，土壤蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶、纖維素酶、木聚糖酶活性極顯著高于未施用菌劑的對照處理。多功能固氮菌制劑對于提高生荒地土壤生物活性、改善土壤生態(tài)環(huán)境具有重要作用和應(yīng)用價(jià)值。

生物固氮；ACC脫氨酶；土壤酶；生態(tài)修復(fù)

土壤是自然生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)。近年來，礦山開墾、高速公路建設(shè)等工程對自然生態(tài)造成一定程度的破壞，形成大量的生荒地，表現(xiàn)為土壤腐熟度低、生物活性低、植被生長困難。隨著國家對生態(tài)環(huán)境建設(shè)的重視，如何提高生荒地土壤生物活性，快速培肥土壤、恢復(fù)土壤生態(tài)環(huán)境成為農(nóng)業(yè)科研工作者努力探索的課題。

在土壤生態(tài)修復(fù)領(lǐng)域，目前針對問題土壤的修復(fù)研究較多，比如對礦山土壤［1-2］、重金屬污染土壤［3］、石油污染土壤［4］的研究報(bào)道很多。生荒地土壤的生態(tài)修復(fù)在近些年才受到重視，針對性較強(qiáng)的研究報(bào)道相對較少。肖波等［5］采用種植禾本科牧草對水庫庫濱荒灘進(jìn)行了土壤生態(tài)修復(fù)試驗(yàn)，顯著改善了土壤理化性質(zhì)，取得了較好的配肥效果。黃華康等［6］采用引進(jìn)客土的方法改善了濱海圍墾荒地的理化性質(zhì)和土壤肥力。采用微生物制劑改善生荒地土壤生態(tài)的報(bào)道尚未見到。

固氮菌是一類能夠進(jìn)行生物固氮的微生物，由于它們能夠直接利用空氣中的分子態(tài)氮素，因此生命力很強(qiáng)，能夠在貧營養(yǎng)等惡劣環(huán)境中生存并且進(jìn)行生命活動，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境修復(fù)中具有廣泛的應(yīng)用。乙烯是高等植物的內(nèi)源激素，1-氨基環(huán)丙 烷 -1-羧 酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）是乙烯合成的前體，近年來發(fā)現(xiàn)，許多植物促 生 細(xì) 菌（Plant growth promoting bacteria，PGPB）具有ACC脫氨酶活性，因此人們采用檢測ACC脫氨酶的方法來篩選植物促生細(xì)菌［7］。

本研究針對生荒地土壤特點(diǎn)，以多年來收集的固氮微生物資源為基礎(chǔ)，篩選出具有較高固氮酶活性和ACC脫氨酶活性的菌株4株，研制了多功能菌劑，應(yīng)用于修建高速公路形成的生荒地，擬使試驗(yàn)地土壤酶活性提高，土壤生態(tài)環(huán)境得以改善。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實(shí)驗(yàn)菌株500余株，均為自生固氮和聯(lián)合固氮菌，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。菌株分離自生長期小麥、水稻、玉米、大豆、油菜、白菜、馬鈴薯等作物根際。圓褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）ACCC11103為生產(chǎn)固氮菌劑常用菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保藏，在本文中用作篩選高效固氮菌陽性對照菌株。實(shí)驗(yàn)所用試劑購自北京化學(xué)試劑公司和Sigma公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0-7.2（固體培養(yǎng)基加入瓊脂15-20 g）；（2）馬丁培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，氯霉素0.1 g，1%孟加拉紅水溶液3.3 mL，蒸餾水1 000 mL，自然pH（固體培養(yǎng)基加入瓊脂15-20 g）；（3）高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水 1 000mL，pH 7.2-7.4（固體培養(yǎng)基加入瓊脂15-20 g）；（4）DF 培 養(yǎng) 基：KH2PO44.0 g，Na2HPO46.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖2.0 g，葡萄糖酸鈉 2.0 g，檸檬酸2.0 g，（NH4）2SO42.0 g，組分一、組分二溶液各0.1 mL，H2O 1 000 mL，pH 7.2（組分一：H3BO310 mg，MnSO4·H2O 11.19 mg，ZnSO4·7H2O 124.6 mg，CuSO4·5H2O 78.22 mg，MoO310 mg，溶于100 mL滅菌蒸餾水中；組分二：FeSO4·7H2O 100 mg溶于10 mL滅菌蒸餾水中）；（5）ADF培養(yǎng)基：ACC溶于超純水，過濾滅菌，加到不含（NH4）2SO4的滅菌DF培養(yǎng)基中，終濃度為3.0 mmol/L；（6）Fahraeus無氮植物營養(yǎng)液：Na2HPO4·12H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，檸檬酸鐵 0.005 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KH2PO40.1 g，Gibson 微量元素液 1 mL，H2O 1 000 mL，pH 6.5-7.0（Gibson 微量元素液：H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO4·5H2O 0.08 g，MnSO4·4H2O 2.03 g，Na2MoO4·2H2O 1.26 g，H2O 1 000 mL）。

1.2 方法

1.2.1 高固氮潛能菌株篩選 以實(shí)驗(yàn)室保藏的500株固氮菌為出發(fā)菌株，采用乙炔還原法測定固氮菌的固氮酶活性［8］，固氮酶活性高者初步選定為高效固氮菌株。固氮酶活性定義為：反應(yīng)條件下，1 mg菌體蛋白1 h還原乙炔生成乙稀的nmol數(shù)。計(jì)算方法為：

固 氮 酶 活 性［nmol C2H4/（mg蛋 白·h）］=C2H4（nmol）/［菌體蛋白量（mg）× 反應(yīng)時(shí)間（h）］式中：C2H4（nmol）= 1 000×C2H4體積（μL）×273×P/［22.4×（273 +t）×760］

其中：P為酶反應(yīng)時(shí)氣壓（mm汞柱），t為酶反應(yīng)時(shí)溫度（℃）。測定結(jié)果為3次重復(fù)的平均值。

1.2.2 提高植物抗逆潛能的菌株篩選 （1）初步篩選ACC脫氨酶陽性菌株 以實(shí)驗(yàn)室保藏的500株固氮菌為出發(fā)菌株，將實(shí)驗(yàn)菌株接入5 mL液體無氮培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；吸取上述培養(yǎng)液0.1 mL接種至5 mL DF培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)24h；吸取上述培養(yǎng)液0.1 mL接種至5 mL ADF培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)24-48 h；將在ADF中生長的菌種重復(fù)轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)，并以ADF培養(yǎng)基作為陰性對照，能夠以ACC為唯一氮源生長的菌株為ACC脫氨酶陽性菌株。（2）菌株ACC脫氨酶活性測定 采用比色分析法測定菌株ACC脫氨酶活性［9］。ACC脫氨酶定義為：反應(yīng)條件下，1 mg菌體蛋白1 h催化ACC脫氨形成α-丁酮酸的μmol數(shù)，單位為：μmol α-丁酮酸/h·mg蛋白。測定結(jié)果為3次重復(fù)的平均值。

1.2.3 植物促生試驗(yàn) 采用盆栽試驗(yàn)，種植普通白菜（Brassica campestris）［9］。試驗(yàn)在溫室中進(jìn)行，采用直徑13 cm、高12 cm 的塑料盆，每盆裝土700g。實(shí)驗(yàn)土壤為菜園土，基礎(chǔ)營養(yǎng)檢測［10］結(jié)果為全氮0.9 g/kg，有效磷10.6 mg/kg，速效鉀111.5 mg/kg。實(shí)驗(yàn)設(shè)接種和不接種對照，出苗7 d后每盆定植普通白菜1株。分別培養(yǎng)收集實(shí)驗(yàn)菌株的菌體，用Fahraeus 無氮植物營養(yǎng)液洗滌菌體，稀釋到OD6001.5，菌數(shù)大約為 15×108CFU/mL，定植2 d后每盆澆50 mL。不接種對照每盆澆無氮植物營養(yǎng)液50 mL。30 d后收獲，測定植株鮮重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)的平均值。

1.2.4 菌株鑒定 采用16S rRNA基因測序、比對法鑒定篩選到的高效菌株［11］。DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar軟件完成，序列比對通過美國國家生物技術(shù) 信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫和EzTaxon在線完成。

1.2.5 菌劑制作 微生物制劑的功能中心就是所采用的功能菌株， 即核心菌群。核心菌群菌株的選取首先要考慮菌株的安全性，包括人畜安全、植物安全及環(huán)境生態(tài)安全等，主要判定方法是首先確定菌株的分類地位， 然后根據(jù)分類地位查閱文獻(xiàn)資料初步判定其安全性， 在此基礎(chǔ)上進(jìn)行生物安全試驗(yàn)。其次考慮菌株的功能，包括生物固氮潛能，培肥土壤能力，促進(jìn)植物生長，提高植物抗逆性等。本實(shí)驗(yàn)選取了7012、7134、7144 和7164 作為制備土壤生態(tài)修復(fù)菌劑的核心菌株，它們功能特點(diǎn)和分類地位如表1所示。

表1 菌劑核心菌株功能特點(diǎn)和分類地位

實(shí)驗(yàn)室條件下分別搖床培養(yǎng)篩選到的功能菌株7012、7134、7144 和7164。1 L 三角瓶裝量250 mL，28℃、200 r/m 振蕩培養(yǎng) 18 h-24 h 至 OD600達(dá)到 1.5-1.8， 活菌數(shù)達(dá)到 15×108-30×108CFU/mL。分別取4 菌株的培養(yǎng)液各2 L，無菌操作混合，罐裝，密封，即為多功能菌劑實(shí)驗(yàn)樣品。取名為NFMF（固氮多功能）菌劑，室溫保存，用于土壤培肥田間試驗(yàn)。

1.2.6 菌劑制作與田間試驗(yàn) 田間試驗(yàn)位于京新高速公路G7興和南互通口。新土層全部為貧瘠的生荒土，急需建植、培肥、恢復(fù)生態(tài)。試驗(yàn)地土壤基本性狀為：有機(jī)質(zhì)（%）0.435±0.2，全氮（%）0.027±0.006，堿解氮（mg/kg）0，全磷（%）0.089±0.006，有效磷（mg/kg）21.3±1.6。

2014年5月15日，進(jìn)行了試驗(yàn)地建植和菌劑施用。坡面約30°，首先打樁掛網(wǎng)，然后采用機(jī)器噴播培土，培土機(jī)質(zhì)為生荒土混入約1%的蘑菇渣，植物種子隨土噴播。播種植物為木本、草本植物混播，包括榆樹、檸條、紫穗槐、刺槐、胡枝子、苜蓿、冰草、披堿草、沙打旺及波斯菊等。NFMF菌劑（液體）含菌量為 30×108CFU/mL，在施工現(xiàn)場，將1 L 該菌劑加入到盛有1 000 L自來水的水箱中，攪拌均勻，采用大功率噴播機(jī)將稀釋后的菌劑隨土壤、種子一起噴施于試驗(yàn)地坡面，用量為每600 m2試驗(yàn)地用1L。試驗(yàn)處理設(shè)：（1）陽坡空白對照（CK0，施用等量滅菌處理過的菌劑）（2）陽坡施用菌劑（T1）（3）陰坡施用菌劑（T2）3個(gè)處理，每個(gè)試驗(yàn)處理面積約2 000 m2。

施用NFMF菌劑3個(gè)月后，2014年8月7日進(jìn)行了現(xiàn)場調(diào)查采樣。采集了施用功能菌劑陽坡（T1）、施用功能菌劑陰坡（T2）和未施功能菌劑（CK0）土壤樣品。采樣方法為，在每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)采用五點(diǎn)法選點(diǎn)，剝?nèi)ケ韺油寥?，采? cm-15 cm深度的土壤，每個(gè)樣點(diǎn)采集土壤約500 g，5個(gè)樣點(diǎn)的樣品混勻作為1個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析測定（3次重復(fù)）。

1.2.7 可培養(yǎng)土壤微生物數(shù)量測定 取新鮮土樣10g加入到帶玻璃珠的90 mL無菌水中，搖床振蕩20 min，然后無菌操作制成101-106系列稀釋梯度，取100 μL土壤懸液分別接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（細(xì)菌）、馬丁培養(yǎng)基（真菌）和高氏一號培養(yǎng)基（放線菌）固體平板上，均勻涂布，3次重復(fù)，28℃培養(yǎng)2-5 d，觀察計(jì)數(shù)。

1.2.8 土壤酶活性測定 按照文獻(xiàn)方法測定土壤活性［12］。酶活定義及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如下：（1）土壤蔗糖酶活性測定（比色法）按照標(biāo)準(zhǔn)曲線y=（x+0.0171）/16.08計(jì)算葡萄糖含量。土壤蔗糖酶活性定義為：37℃、pH5.5條件下5 g風(fēng)干土壤24 h水解蔗糖生成葡萄糖的毫克（mg）數(shù)。（2）土壤過氧化氫酶活性測定（容量法）按照高錳酸鉀溶液的標(biāo)定值計(jì)算出高錳酸鉀溶液的消耗量。土壤過氧化氫酶活性定義為：2 g風(fēng)干土壤30 min分解過氧化氫的數(shù)量折和氧化分解等量過氧化氫所需0.1 N高錳酸鉀的毫升（mL）數(shù)。（3）土壤脲酶活性測定（靛酚藍(lán)比色法）按照標(biāo)準(zhǔn)曲線y=（x＋0.000 6）/241.14計(jì)算出氨氮含量。土壤脲酶活性定義為：37℃、pH6.7條件下10 g風(fēng)干土壤3 h 分解尿素釋放NH3-N的毫克（mg）數(shù)。（4）土壤磷酸酶活性測定（磷酸苯二鈉比色法）按照標(biāo)準(zhǔn)曲線y=（x-0.001 4）/200.88計(jì)算出酚含量。土壤磷酸酶活性定義為：37℃、pH9.6條件下10 g風(fēng)干土壤24 h 分解釋放酚的毫克（mg）數(shù)。（5）土壤纖維素酶活性測定（硝基水楊酸比色法）按照標(biāo)準(zhǔn)曲線y=（x+0.000 9）/5.357 1計(jì)算葡萄糖含量。土壤纖維素酶活性定義為：37℃、pH5.5條件下10 g風(fēng)干土壤72 h 分解釋放葡萄糖的毫克（mg）數(shù)。（6）土壤木聚糖酶活性測定（硝基水楊酸比色法）按照標(biāo)準(zhǔn)曲線y=（x+0.005 7）/4.160 5計(jì)算還原糖含量。土壤木聚糖酶活性定義為：37℃、pH5.5條件下5 g風(fēng)干土壤120 h 分解釋放還原糖的毫克（mg）數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 高效固氮菌篩選結(jié)果

參考陽性對照菌株圓褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性9.741±2.004 nmol/（h·mg），經(jīng)過大量的測定和篩選，從500余株實(shí)驗(yàn)菌株中篩選到固氮酶活性大于9 nmol/（h·mg）的菌株共計(jì)47株，其中4株菌株的固氮酶活性顯著大于陽性對照菌株圓褐固氮菌ACCC11103（表2）。

2.2 提高植物抗逆潛能菌株篩選結(jié)果

經(jīng)過初篩和復(fù)篩，從500余株出發(fā)菌株中篩選

到ACC脫氨酶陽性菌株20株，其ACC脫氨酶活性為 0.326-21.980 μmol/（h·mg）（表 2）。

表2 篩選菌株的固氮酶活性、ACC脫氨酶活性及初步鑒定結(jié)果

2.3 促進(jìn)植物生長試驗(yàn)結(jié)果

對篩選到的51株功能菌株進(jìn)行了接種小白菜促生長實(shí)驗(yàn)。結(jié)果（表2）顯示，接種實(shí)驗(yàn)菌株后小白菜植株鮮重在 （0.81±0.19）g/盆-（4.99±1.49）g/盆，不接種對照處理為（1.76±0.18）g/盆。與對照相比，47株接菌處理使小白菜鮮重增加，占實(shí)驗(yàn)菌株總數(shù)92%；11株接菌處理使小白菜鮮重顯著增加，占實(shí)驗(yàn)菌株總數(shù)22%。

2.4 菌株鑒定結(jié)果

結(jié)果（表2）顯示，篩選到的51株功能菌株的16S rRNA基因序列與已知模式種的最大相似性為95.96%-100%，其中46株與已知模式種的最大相似性大于97%。按照國際細(xì)菌分類委員會的建議，16S rRNA基因序列相似性達(dá)到97%為分類學(xué)定種的標(biāo)準(zhǔn)，說明已知模式種能夠代表鑒定菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。篩選到的51株功能菌株系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于農(nóng)桿菌、節(jié)桿菌、芽孢桿菌、伯克氏菌、鞘氨醇桿菌、屈撓桿菌、劍菌、腸桿菌、溶桿菌、微球菌、類芽孢桿菌、葉桿菌、假單胞菌、根瘤菌、中華根瘤菌及芽孢乳桿菌等16屬31種。菌株7036、7038、7188、7213和7228的序列相似性低于標(biāo)準(zhǔn)約1%，分類地位歸屬可作參考。

2.5 接種菌劑對試驗(yàn)地土壤微生物數(shù)量的影響

結(jié)果（表3）顯示接種NFMF菌劑對土壤中3類微生物的數(shù)量產(chǎn)生了影響。統(tǒng)計(jì)分析表明，土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)，施用功能菌劑的處理極顯著高于未施用功能菌劑處理，同時(shí)陽坡處理極顯著高于陰坡處理；土壤中可培養(yǎng)真菌總數(shù)，同樣是施用功能菌劑的處理顯著高于未施用功能菌劑處理，不同的是陰坡處理顯著高于陽坡處理；土壤中可培養(yǎng)放線菌總數(shù)測定結(jié)果有所不同，施用功能菌劑陽坡處理與未施用功能菌劑處理無差異，但二者極顯著高于施用功能菌劑陰坡處理。

表3 試驗(yàn)地土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量

2.6 接種菌劑對試驗(yàn)地土壤酶活性的影響

結(jié)果（表4）顯示，接種菌劑的2個(gè)處理（陽坡和陰坡）基本上全部極顯著高于未施用菌劑的對照處理；只有纖維素酶表現(xiàn)出接種菌劑陽坡處理顯著高于對照處理，陰坡處理與對照無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，除纖維素酶之外的其他5種酶活性表現(xiàn)為菌劑陽坡處理極顯著高于菌劑陰坡處理。

3 討論

土壤生物活性的主要功能表現(xiàn)形式就是土壤酶活性，這也是土壤作為類生命體的一個(gè)重要特征。土壤酶活性的強(qiáng)弱與土壤供肥能力之間存在著密切關(guān)系，可以作為土壤肥力指標(biāo)［13］。對農(nóng)田土壤的研究表明，很多農(nóng)業(yè)措施如施用有機(jī)肥［14］、秸稈還田［15］、施用綠肥［16］、輪作［17］、灌溉［18］等能夠提高土壤酶活性，從而促進(jìn)土壤中的物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化，提高土壤供肥能力，甚至提高作物產(chǎn)量。

土壤微生物是土壤中物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化的推動者，是土壤酶的主要來源，因此施用菌劑會影響土壤酶活性。文獻(xiàn)報(bào)道，施用膠質(zhì)芽胞桿菌菌劑可以提高黑麥草根際土壤脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶活性［19］，施用EM菌肥能夠不同程度的提高黃瓜根際土壤脲酶、過氧化氫酶等土壤酶活性［20］，施用木霉菌劑降低黃瓜根際土壤酸性磷酸酶活性，提高過氧化氫酶活性［21］。這些結(jié)果說明了菌劑對于提高土壤生物活性具有普遍意義，與本文的研究結(jié)果具有一致性。

生荒地土壤是不同于農(nóng)田土壤的一類特殊土壤類型，基本組成為生土，土壤微生物數(shù)量少，生物活性很低。所以，針對這樣的土壤類型進(jìn)行生態(tài)修復(fù)時(shí)最有效的方法就是通過施用菌劑直接輸入活性微生物。不同于前人的研究工作，本文以菌株的固氮酶活性和ACC脫氨酶活性為指標(biāo)篩選功能菌株，這是因?yàn)楣痰芰?qiáng)的菌株通常在貧瘠土壤環(huán)境中生存能力較強(qiáng)，而ACC脫氨酶活性高的細(xì)菌通常能夠提高植物抗逆性，這是因?yàn)?-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC） 是 乙烯合成的前體物質(zhì)，某些細(xì)菌具有ACC脫氨酶活性，能夠把ACC分解成氨和α-丁酮酸減少乙烯合成，從而提高植物抗逆能力［22］，具有ACC脫氨酶活性的細(xì)菌在土壤生態(tài)修復(fù)中顯示了較好的效果［23］。本文的研究結(jié)果也證明了固氮多功能菌劑對提高生荒地土壤生物活性的積極作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還有一個(gè)有趣的現(xiàn)象，就是試驗(yàn)地的位置對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大的影響。從表3可以看到，施用功能菌劑后，陽坡土壤真菌數(shù)量低于陰坡，但土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量均極顯著高于陰坡；這些土壤微生物數(shù)量的差異及其作用在表4得到了充分體現(xiàn)，可以看到除纖維素酶之外，其他5種酶（蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶和木聚糖酶）均表現(xiàn)為陽坡土壤極顯著高于陰坡土壤。這個(gè)現(xiàn)象的本質(zhì)是日照對菌劑作用有影響巨大，其機(jī)理可能是日照提高了地溫，促進(jìn)了土壤微生物生長；當(dāng)然長日照也促進(jìn)了植物生長，促進(jìn)了根系分泌，進(jìn)一步促進(jìn)了土壤微生物的活性。

4 結(jié)論

篩選到固氮酶活性大于9 nmol/（h·mg）的固氮菌47株、產(chǎn)生ACC脫氨酶的菌株20株。篩選到的51株功能菌屬于農(nóng)桿菌、節(jié)桿菌、芽孢桿菌、類芽孢桿菌等16屬31種。采用高效菌株制備的功能菌劑應(yīng)用于生荒地后土壤生物活性得以顯著改善。固氮多功能菌劑對于提高生荒地土壤生物活性、修復(fù)生荒地土壤生態(tài)具有重要意義。

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Screening of Multi-functional Nitrogen Fixing Bacteria and Their Application in Soil Ecological Restoration

MAO Xiao-jie1WANG Xin-min2ZHAO Ying2ZHOU Yi-qing1SUN Jian-guang1
（1. Key Laboratory of Microbial Resources，Ministry of Agriculture/Institute of Agricultural Resources and Regional Planning，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；2. State Environmental Protection Engineering Center for Ecological Restoration on Destroyed Surface/Luyu Ecological Engineering Company Ltd.，Beijing 100082）

The objective of this study is to screen multi-functional nitrogen-fixing bacteria based on nitrogenase and ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylate）deaminase activity，to develop inoculant and test its effect in wasteland soil ecological restoration. First，nitrogenase activity was determined by acetylene reduction assay，and ACC deaminase activity was quantitatively measured by colorimetry.Then，the 16S rRNA of the strains was amplified by PCR，and the phylogenetic status of the strains was investigated by sequence analysis and alignment. The identification of strains was carried out based on the morphology，physiology，biochemical test results，and 16S rRNA analysis. As results，total 47 strains with nitrogenase activity higher than 9 nmol C2H4/（h · mg）protein were screened，and the nitrogenase activities of the 43 strains were higher than that of positive control Azotobacter ACCC11103. And 20 strains producing ACC deaminase of 0.326 μmol/（h·mg）to 21.980 μmol/（h·mg）were obtained. Plant growth promotion test showed that the 47 strains increased the fresh weights of Chinese cabbage（Brassica campestris）. Based on 16S rRNA sequence，the 51 selected strains were identified as Agrobacterium albertimagni，Arthrobacter pascens，Bacillus circulans，Burkholderia vietnamiensis，Chitinophaga ginsengisegetis，Dyadobacter fermentans，Ensifer adhaerens，Enterobacter aerogenes，Lysobacter yangpyeongensis，Micrococcus luteus，Paenibacillus alginolyticus，Phyllobacterium ifriqiyense，Pseudomonas fluorescens，Rhizobium alamii，Sinorhizobium adhaerens，Sporolactobacillus laevolacticus of 31 species of 16 genera. After test，4 excellent strains of 7012，7134，7144，and 7164 were manufactured as inoculant termed as NFMF（Nitrogen Fixing and Multi Function）biofertilizer，with which the field experiment showed that soil microorganism quantity increased significantly after 3 months of NFMF biofertilizer inoculation，and soil activities of sucrase，catalase，urease，phosphatase，cellulase and xylanase significantly increased compared with the no inoculation control. In conclusion，NFMF can significantly increase wasteland soil bioactivity and it is valuable in the ecological restoration of wasteland soil.

biological nitrogen fixation；ACC deaminase；soil enzyme；ecological restoration

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0678

2017-08-18

內(nèi)蒙古自治區(qū)國土資源廳項(xiàng)目

毛曉潔，女，碩士研究生，研究方向：微生物生態(tài)；E-mail：maoxj@163.com

孫建光，男，博士，研究方向：微生物肥料；E-mail：jgsun@caas.ac.cn

（責(zé)任編輯 狄艷紅）