張來軍,李曉梅,陳永敢,陳 攀,杭瑜瑜,公維潔

(海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院,海南 三亞 572022)

重金屬脅迫對羅非魚血細(xì)胞DNA損傷的影響

張來軍,李曉梅,陳永敢,陳 攀,杭瑜瑜,公維潔

(海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院,海南 三亞 572022)

為研究重金屬對魚類的毒性效應(yīng),將羅非魚血細(xì)胞分別暴露于低、中、高三種不同濃度的四種重金屬溶液Cr(VI)、Pb、Cu、Hg中2 h,采用單細(xì)胞凝膠電泳實驗(彗星電泳)技術(shù)檢測血細(xì)胞的DNA損傷程度,對照組不加任何重金屬,檢測指標(biāo)包括尾部DNA含量、尾長、尾矩、Olive尾矩.結(jié)果顯示,魚血細(xì)胞對四種重金屬脅迫均極為敏感,隨重金屬脅迫濃度的升高,DNA損傷程度增加.因此,羅非魚可作為評價重金屬污染遺傳毒性損傷的敏感性生物標(biāo)記物.

單細(xì)胞凝膠電泳;魚血細(xì)胞;重金屬污染;DNA損傷

0 引言

重金屬污染,是指由重金屬或其化合物造成的環(huán)境污染.隨著城市現(xiàn)代化和工業(yè)化的加速發(fā)展,導(dǎo)致重金屬污染物通過河流、排泄口、家庭污水管、大氣遷移和沿海傾倒的廢物進(jìn)入海洋.由于重金屬具有不易移動、難溶解,以及富集性的特性,很難在環(huán)境中降解,進(jìn)入生物體后也難以被排出,從而造成生物體慢性中毒,以致水體中痕量重金屬通過食物鏈的各個環(huán)節(jié)對生態(tài)系統(tǒng)造成危害并最終危及人類的健康.為了能準(zhǔn)確、及時、全面地反映海洋環(huán)境質(zhì)量現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢,需要隨時進(jìn)行環(huán)境檢測[1].

近年來,單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel eletrophoresis,SCGE),或彗星電泳(Comet assay)技術(shù)常被用于水環(huán)境污染遺傳毒理學(xué)檢測[2-4].這一技術(shù)最早用于動物細(xì)胞 DNA 損傷檢測,具有簡便、快速、靈敏等特點,現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于各種真核生物不同類型的細(xì)胞試驗.外界環(huán)境中的理化因素會對細(xì)胞DNA造成損傷,進(jìn)而可能引起基因突變或癌變,所以判斷細(xì)胞DNA是否損傷是環(huán)境監(jiān)測中重要的一環(huán).在1999年舉行的國際基因毒性檢驗程序?qū)ｎ}學(xué)術(shù)討論會中,單細(xì)胞凝膠電泳(pH>13)被定為確定某物質(zhì)是否具有基因毒性的最佳方法[5].

羅非魚生長于16～38℃的水域,為廣鹽性魚類,海淡水中均可生存,耐低氧.本研究以羅非魚為實驗材料,采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù),檢測四種重金屬Cr6+、Pb2+、Cu2+、Hg2+脅迫對羅非魚外周血細(xì)胞DNA 的損傷,為重金屬脅迫的血液毒理學(xué)以及評價重金屬對海洋環(huán)境中生物的影響提供參考資料.

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器

正常熔點瓊脂糖(NMA, 西班牙),低熔點瓊脂糖(LMA),Triton X-100,肌氨酸鈉, DMSO,上述試劑均為Amresco分裝產(chǎn)品.重鉻酸鉀、硫酸銅、醋酸鉛和氯化汞均為國產(chǎn)分析純.倒置熒光顯微鏡(德國Leica 公司DMI 3000),電泳儀(Tanon EPS 300),電泳槽(北京六一,DYCP-33A).

1.2實驗動物

羅非魚購自海南省三亞市荔枝溝農(nóng)貿(mào)市場,為海水養(yǎng)殖魚,體長不超過15 cm.試驗前用曝氣自來水加天然海水,配制成鹽度為17‰～20‰的實驗用水,馴養(yǎng)1 周,每天換水1次,試驗時挑選健康正常個體進(jìn)行處理.

1.3試驗方法

用肝素處理的注射器鰓動脈無菌取血,血液用PBS緩沖液稀釋到105～106cell/mL,等體積分到不同的離心管中.Cr6+、Pb2+、Cu2+、Hg2+離子脅迫濃度分別按《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 11607)最高限量值的100倍、500倍和1000倍設(shè)置成低濃度組、中濃度組和高濃度組三個脅迫濃度組,具體脅迫濃度如表1至表4中所示.空白對照組不加任何重金屬離子,25 ℃脅迫2 h.脅迫結(jié)束后,血細(xì)胞以1000 r/m離心收集,再用PBS緩沖液沖洗1次,離心,重新加入PBS,調(diào)整細(xì)胞密度,觀察細(xì)胞活力,準(zhǔn)備電泳.

1.4單細(xì)胞凝膠電泳

按Zhang[6]等改良方法進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳.將潔凈的載玻片在0.6%的常熔點瓊脂糖中浸沒后取出,置37 ℃烘箱烘烤過夜以備電泳;將血細(xì)胞懸液和1%低熔點瓊脂糖等體積混合均勻,鋪在預(yù)處理后的載玻片上,4 ℃固化5 min,將載玻片放入新鮮配制的裂解液(2.5 mol·L-1NaCl,0.1 mol·L-1EDTA,0.01 mol·L-1Tris,1%肌氨酸鈉,pH 10,1% Triton X-100,10% DMSO)中,裂解1 h;蒸餾水沖洗后,再放入電泳緩沖液(0.3 mol·L-1NaOH,1mmol·L-1EDTA,pH>13)中,變性解旋20 min;電泳20 min(26 V,300 mA);400 mmol·L-1Tris緩沖液(pH 7.5)中和3次;從裂解到中和的所有過程需在4 ℃下進(jìn)行.將載玻片置于冰冷的無水乙醇中,脫水10 min,室溫晾干, EB(20 μg· mL-1)染色,鏡檢,照相.也可不經(jīng)過脫水過程,直接染色觀察.

1.5彗星圖像分析和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

每個處理隨機(jī)取約50個細(xì)胞圖像,用CASP軟件進(jìn)行分析,可得到諸多反應(yīng)DNA損傷程度的參數(shù),本文選擇尾部DNA含量(TDNA%)、尾長(TailLength,TL)、尾矩(TailMomen,TM)和Olive尾矩(Olive TailMoment,OTM)四種參數(shù)作為衡量細(xì)胞DNA損傷程度的評價指標(biāo).

用SPSS13.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),比較各濃度組之間及其與對照組之間各組數(shù)據(jù)差異的顯著性,實驗重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1重金屬Cu2+脅迫對羅非魚血細(xì)胞DNA損傷的形態(tài)觀察

圖1為Cu2+脅迫對羅非魚血細(xì)胞影響的幾種典型彗星圖像.其中圖 1A是空白對照組,其血細(xì)胞核大小均勻,呈圓形熒光團(tuán),彗星頭部DNA集中,亮度強(qiáng),無拖尾或輕微拖尾現(xiàn)象;DNA 受損的血細(xì)胞由于其DNA鏈斷裂,電泳時斷片向陽極移動,產(chǎn)生彗星樣拖尾,且隨著Cu2+濃度的提高,DNA鏈斷裂程度由輕到重,彗尾逐漸變長,并在一定程度下熒光強(qiáng)度增加;彗星頭部逐漸變小,熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)?圖 1B、C、D).

注：A:空白對照組;B:1 mg·L-1 ;C:10 mg·L-1;D:15 mg·L-1圖1 不同濃度Cu2+引起羅非魚血細(xì)胞 DNA 受損典型彗星電泳圖像(×200)

2.2四種重金屬對羅非魚血細(xì)胞DNA損傷的影響彗星電泳結(jié)果

經(jīng)彗星圖像分析軟件CASP軟件處理彗星圖像后,得到的 TDNA%、TL、TM、OTM四個參數(shù)數(shù)值經(jīng)SPSS統(tǒng)計處理后,用Mean±SD表示.四種重金屬離子Cr6+、Pb2+、Cu2+、Hg2+對魚血細(xì)胞DNA損傷的分析結(jié)果以下列各表所示.

表1 不同劑量Cr6+對羅非魚血細(xì)胞DNA損傷的彗星電泳結(jié)果

注：與對照組比較“*”表示差異顯著(P<0.05),“**”表示差異極顯著(0.05

由表1數(shù)據(jù)可知,低、中和高3個Cr6+濃度組的4項指標(biāo)值顯著高于對照組(P<0.05),其中高濃度組與對照組之間的差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01),且與低濃度組和中濃度組之間也具有差異(P<0.05).但是低濃度組與中濃度組之間比較差異不顯著(P>0.05).因此隨Cr6+脅迫濃度的提高,TDNA%、TL、TM和OTM的值也隨之增加,魚血細(xì)胞DNA損傷越嚴(yán)重.Cr6+脅迫濃度與DNA損傷程度二者間存在著明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系.四種參數(shù)中,TDNA%、TM和OTM最能夠體現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系.

表2 不同劑量Pb2+對羅非魚血細(xì)胞DNA損傷的彗星電泳結(jié)果

注：“*”表示與對照組比較差異顯著(P<0.05)

由表2可知,隨Pb2+脅迫濃度的增加,TDNA%、TL、TM和OTM的值也隨之增加.高濃度組的四項指標(biāo)分別顯著高于對照組和低濃度組(P<0.05),中濃度組的TDNA%和OTM與對照組比較也具有顯著差異(P<0.05),而低濃度組除OTM高于對照組(P<0.05)外,其他指標(biāo)與對照組比較沒有差異(P>0.05).Pb2+脅迫濃度與DNA損傷程度二者間也存在著明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系.

表3 不同劑量Cu2+對羅非魚血細(xì)胞DNA損傷的彗星電泳結(jié)果

注：與對照組比較“*”表示差異顯著(P<0.05),“**”表示差異極顯著(0.05

由表3可知,隨Cu2+脅迫濃度增加,四項指標(biāo)TDNA%、TL、TM和OTM的值也明顯增加.低、中和高三個濃度組的4項指標(biāo)與對照組各值比較均有極顯著差異(P<0.01);且高濃度組的4項指標(biāo)還顯著高于中、低兩個濃度組(P<0.05)(數(shù)據(jù)未顯示).在實驗所設(shè)濃度范圍內(nèi),隨Cu2+脅迫的濃度增加,魚血細(xì)胞DNA損傷加重,Cu2+濃度與DNA損傷程度之間存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系.

表4 不同劑量Hg2+對羅非魚血細(xì)胞DNA損傷的彗星電泳結(jié)果

注：與對照組比較“*”表示差異顯著(P<0.05),“**”表示差異極顯著(0.05

由表4可知,隨Hg2+脅迫濃度的升高,TDNA%、TL、TM和OTM的值隨之增加.高、中和低3個濃度組的4項指標(biāo)均顯著高于對照組(P< 0.05),其中高濃度組的TDNA%值顯著大于中、低2個濃度組(P<0.05).在實驗所設(shè)濃度范圍內(nèi),隨脅迫的Hg2+濃度增加,魚血細(xì)胞DNA損傷加重,二者間存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系.

因此,魚血細(xì)胞對四種重金屬污染極為敏感,隨重金屬脅迫濃度升高血細(xì)胞DNA損傷嚴(yán)重.四種參數(shù)TDNA%、TL、TM、OTM中,TDNA%和OTM最能體現(xiàn)出重金屬脅迫濃度與DNA損傷程度之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系.

3 討論

重金屬污染與其他污染相比,具有范圍廣、長期持久和不可逆等特點,可以長期留在水體和土壤中,再通過富集作用大量積累在植物體內(nèi),或通過食物鏈進(jìn)入到動物體內(nèi).實驗室條件下,海水中的鎘能迅速而大量的蓄積于波紋巴菲蛤的內(nèi)臟團(tuán)、腮和肌肉組織中[7],而近江牡蠣的體內(nèi)也具有蓄積大量鉛的能力[8].進(jìn)入動物體內(nèi)的重金屬影響生長發(fā)育,破壞正常的細(xì)胞活動,嚴(yán)重時引起死亡.重金屬脅迫對動物DNA的影響表現(xiàn)為引起堿基損傷、DNA鏈斷裂、鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián)等,從而影響DNA的完整性,產(chǎn)生遺傳毒性,因此檢測動物細(xì)胞DNA損傷是評價環(huán)境污染物遺傳毒性的一個重要參數(shù).而單細(xì)胞凝膠電泳是迄今檢測DNA損傷非常靈敏的方法;魚類是首批與彗星電泳密切結(jié)合用于水環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域研究的動物模型.Pandrangi等在1995最先將兩種淡水魚美洲洄魚(Ameiurusnebulosus)和鯉魚(Cyprinuscarpio)作為實驗材料檢測湖底沉積物中有毒廢料的毒性效果[9].但是迄今為止海洋環(huán)境中應(yīng)用于彗星電泳的魚種類極為有限,僅有十多種.最常用的是鰈形目魚類[10-11],細(xì)鱗鯻(Theraponjarbua)[12-13],雜斑盔魚(Corisjulis)[14-15],以及海鱸魚[16-17],分別用于檢測重金屬[13,17]、有機(jī)物[10-11]、農(nóng)藥[12]等污染物對魚類的影響;我國僅有大彈涂魚一種被用于彗星電泳研究,檢測鎘、鉛、鉻等重金屬對其外周血細(xì)胞DNA損傷的影響[18-20].我國用于海洋污染監(jiān)測的物種,包括魚類,大多數(shù)未實驗動物化和實現(xiàn)市場化供應(yīng),因此開展海洋污染物生物監(jiān)測迫切需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的實驗動物.

羅非魚作為彗星電泳的實驗材料曾用于軟骨藻酸(Domoic acid, DA)和苯并(a) 芘的毒性檢測[21-22].本實驗用四種重金屬Cr6+、Pb2+、Cu2+、Hg2+脅迫羅非魚血細(xì)胞,彗星電泳檢測DNA損傷程度,發(fā)現(xiàn)四種重金屬均引起了羅非魚血細(xì)胞DNA損傷,且損傷的程度隨重金屬脅迫的濃度升高而加劇.說明羅非魚對環(huán)境污染物,包括重金屬污染較為敏感,可以將這種魚類作為指示生物用于水環(huán)境污染生物檢測研究.

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DNADamageinHemocytesofTilapia(Oreochromisniloticus)InducedbyHeavyMetalswithSCGETechnique

ZHANG Lai-jun, LI Xiao-mei, CHEN Yong-gan, CHEN Pan, HANG Yu-yu, GONG Wei-jie

(School of Life Sciences and Ecology, Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572022, China)

To investigate the toxic effects of heavy metal on marine fish, hemocytes ofOreochromisniloticuswere respectively exposed to four kinds solution— Cr(VI), Pb, Cu and Hg, each with three concentrations.Then the DNA damage to hemolymph cells was detected by single cell gel electrophoresis(comet assay) after two hours, whereas the control group did not add any heavy metal.The detection indexes include tail DNA content, tail length, tail moment and Olive tail moment.Results showed that blood cells were highly sensitive to the four kinds of heavy metal.Furthermore, with the increase of the concentration of heavy metal, the degree of DNA damage increased.Therefore,Oreochromisniloticuscan be a sensitive biological marker to evaluate the genetic toxicity effects of heavy metals.

single cell gel electrophoresis;Oreochromisniloticushemocytes; heavy metal; genetic damage

格式：張來軍,李曉梅,陳永敢,等.重金屬脅迫對羅非魚血細(xì)胞DNA損傷的影響[J].海南熱帶海洋學(xué)院學(xué)報,2017,24(5)：31-35.

2017-06-11

國家自然科學(xué)基金(31260139);海南省自然科學(xué)基金(313050)

張來軍(1968-),女,甘肅慶陽人,海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院副教授,博士,研究方向為細(xì)胞生物學(xué).

Q75；X55

A

2096-3122(2017) 05-0031-05

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.05.06

(編校李由明)