王沛政,徐云升

(海南熱帶海洋學(xué)院 海南省海洋食品工程技術(shù)研究中心,海南 三亞, 572022)

(研究簡(jiǎn)報(bào))

海南發(fā)酵羅非魚細(xì)菌多樣性分析

王沛政,徐云升

(海南熱帶海洋學(xué)院 海南省海洋食品工程技術(shù)研究中心,海南 三亞, 572022)

為了探討海南發(fā)酵羅非魚細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)多樣性,本文采用 Hi Seq 測(cè)序平臺(tái),對(duì)發(fā)酵羅非魚中細(xì)菌 16S DNA V3-V4 區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析.結(jié)果表明：發(fā)酵羅非魚樣品中細(xì)菌組成較為豐富.消化鏈球菌屬(Peptostreptococcu)在發(fā)酵魚樣本微生物群落中所占比例為約33% ;其次為乳酸乳球菌屬(Lactococcus),所占比例約為16%,這兩個(gè)菌屬是發(fā)酵羅非魚的主要優(yōu)勢(shì)種群.變形桿菌屬(Proteus)所占比例約為10%,摩根菌屬(Morganella)所占比例約為8%,嗜冷菌屬(Psychrobacter)所占比例約為8%,普羅威登斯菌屬(Providencia)所占比例約為4%,鏈球菌屬(Streptococcus)所占比例約為3%,腸桿菌屬(Enterobacteriaceae_norank)所占比例約為2%.另外,樣品中也檢出少量有潛在危害的鏈球菌屬等致病菌.

發(fā)酵;羅非魚;微生物多樣性

0 引言

羅非魚是FAO(聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織)向世界推廣養(yǎng)殖的主要魚類,也是我國(guó)農(nóng)業(yè)部確定為我國(guó)淡水養(yǎng)殖的優(yōu)勢(shì)品種.海南是我國(guó)羅非魚養(yǎng)殖的重要區(qū)域.發(fā)酵羅非魚可以對(duì)海南羅非魚養(yǎng)殖提供深加工的渠道,也能增加養(yǎng)殖戶的收入.利用有益微生物對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行有效控制有利于改善食品品質(zhì)和保證食用安全,同時(shí)對(duì)發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效調(diào)控,可以改善發(fā)酵品味和縮短腌制時(shí)間.近年來(lái),國(guó)內(nèi)外有關(guān)于發(fā)酵食品微生物多樣性的不少研究報(bào)道,后立瓊[1]報(bào)道了從苗族酸湯中分離得到Lactobacillusplantarum、Lactobacillusacidophilus、Lactobacilluslactis和Streptococcusthermophilus菌種.陳之蘭等[2]報(bào)道西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳中Lactobacilluscasei是優(yōu)勢(shì)菌群.Li等[3]報(bào)道云南景洪市和勐海縣豆豉的主要優(yōu)勢(shì)菌種是Leuconostocmesenteroides和Staphylococcusgallinarum.高秀芝[4]報(bào)道東北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Bacillus和Lactobacillus.Lee等[5]報(bào)道韓國(guó)八大傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性非常豐富.這些研究報(bào)道為發(fā)酵食品中有益微生物的開發(fā)和利用提供了基礎(chǔ)條件.目前未見海南發(fā)酵羅非魚中微生物種群的相關(guān)報(bào)道.

傳統(tǒng)的微生物鑒定方法很難鑒定眾多的復(fù)雜微生物,隨著生物技術(shù)的進(jìn)步,細(xì)菌基因組序列近年來(lái)常被用于復(fù)雜微生物的鑒定.在細(xì)菌基因組中,16S rRNA基因長(zhǎng)度在1500個(gè)堿基左右,含有9 個(gè)variable Regions (可變區(qū)域) 和10 個(gè)Conserved Regions (保守區(qū)域),其中可變區(qū)具有屬或種的特異性.因此,16S rRNA被認(rèn)為是最適于細(xì)菌分類鑒定的特征核酸序列.為了適用于高通量平臺(tái)測(cè)序,考慮到測(cè)序平臺(tái)讀長(zhǎng)的限制,目前高通量測(cè)序最常用的是V3,V3-V4和V6區(qū)[6-7].

為了探討和開發(fā)海南發(fā)酵羅非魚中的有益微生物,本文采用 Hi Seq 測(cè)序平臺(tái),對(duì)發(fā)酵羅非魚中細(xì)菌 16S DNA V3 -V4 區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析,來(lái)揭示海南發(fā)酵羅非魚中的細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成.

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

發(fā)酵羅非魚樣品來(lái)自海南熱帶海洋學(xué)院食品專業(yè)自制.

1.2發(fā)酵羅非魚樣品微生物DNA提取

參照天根生化科技(北京)有限公司微生物基因組DNA提取試劑盒.

1.3瓊脂糖凝膠電泳

Nano Drop分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度,瓊脂糖電泳上樣體積為 2 ul,1%瓊脂糖凝膠,電泳緩沖液為0.5TBE,100V電泳60 min.染色時(shí)放在含有溴化乙錠的染色液中染色30 min,在254 nm的紫外燈下觀察.

1.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)及程序

PCR 擴(kuò)增包括10×Buffer(含MgCl2) 3 μL,2.5mM dNTPs 1.0 μL,5u TaqDNA聚合酶0.1 μL,10uM正向和反向引物2 μL,模板2 μL,ddH2O 6.9 μL,總體積為15 μL.

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s、52～60℃退火30 s、72℃延伸45 s,共計(jì)30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存.

1.5發(fā)酵羅非魚樣品微生物多樣性檢測(cè)

發(fā)酵羅非魚DNA 樣品微生物16S V3-V 4多樣性委托國(guó)家基因組北方中心諾賽基因組研究中心檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

圖1 發(fā)酵羅非魚DNA樣品擴(kuò)增結(jié)果

2.1發(fā)酵羅非魚DNA擴(kuò)增質(zhì)量瓊脂糖電泳檢測(cè)分析

發(fā)酵羅非魚DNA樣品擴(kuò)增結(jié)果有目的條帶(圖1中第1泳道),瓊脂糖凝膠電泳 NTC為空白對(duì)照(圖1中第2泳道),且空白對(duì)照無(wú)條帶,所以樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果合格.

2.2發(fā)酵魚樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

發(fā)酵魚樣本微生物群在綱(Class)水平的群落結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖2所示,圖中可以看出Gammaproteobacteria (γ-變形菌綱) 在發(fā)酵魚樣本微生物群落結(jié)構(gòu)中所占比例最高為 37%;其次為Clostridia (梭狀芽胞桿菌綱) 所占比例為33%;Bacilli (桿菌綱)排第三所占比例為26%;Alphaproteobacteria(變形菌綱)所占比例為1%.以上四種合計(jì)占發(fā)酵魚樣本微生物群落結(jié)構(gòu)比例達(dá)97%.

圖2 發(fā)酵魚樣本細(xì)菌群綱(Class)分類水平的群落結(jié)構(gòu)

圖3 發(fā)酵魚樣本微生物群科(Family)分類水平的群落結(jié)構(gòu)

發(fā)酵魚樣本微生物群在科水平的群落結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖3所示,圖中可以看出Clostridia (梭狀芽胞桿菌綱)中的Peptostreptococcaceae(消化鏈球菌科)在發(fā)酵魚樣本微生物群落結(jié)構(gòu)中所占比例最高為 33% ;其次為Gammaproteobacteria (γ-變形菌綱) 中的Enterobacteriaceae (腸桿菌科) 所占比例為25%;Bacilli (桿菌綱) 中的 Streptococcaceae (鏈球菌科)排第三所占比例為18%;Gammaproteobacteria (γ-變形菌綱) 中的Moraxellaceae(莫拉菌科)所占比例為6%;Bacilli (桿菌綱) 中的Staphylococcaceae(葡萄球菌科)所占比例為4%;Enterococcaceae(腸球菌科)所占比例為3%,Vibrionaceae(弧菌科)所占比例為1%.以上合計(jì)占發(fā)酵魚樣本微生物群落比例達(dá)95%.

圖4 發(fā)酵魚樣本微生物群屬(Genus)分類水平的群落結(jié)構(gòu)

發(fā)酵魚樣本微生物群在屬水平的群落結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖4所示,圖中可以看出Clostridia (梭狀芽胞桿菌綱)中的Peptostreptococcu (消化鏈球菌)在發(fā)酵魚樣本微生物群落結(jié)構(gòu)中所占比例最高為 33% ;其次為Bacilli (桿菌綱) 中的Lactococcus (乳酸乳球菌) 所占比例為16%;Gammaproteobacteria (γ-變形菌綱) 中的Proteus (變形桿菌)排第三所占比例為10%; Morganella(摩根菌屬)所占比例為8%; Psychrobacter(嗜冷菌)所占比例為8%;Bacilli (桿菌綱) 中的Providencia(普羅威登斯菌)所占比例為4%;Streptococcus(鏈球菌)所占比例為3%;Enterobacteriaceae_norank(腸桿菌)所占比例為2%.以上合計(jì)占發(fā)酵魚樣本微生物群落比例達(dá)90%.

3討論

已有研究報(bào)道表明發(fā)酵水產(chǎn)品加工和保藏的優(yōu)勢(shì)菌主要是乳酸菌、微球菌和葡萄球菌、腸桿菌等.李改燕[8]確定了糟魚發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物菌群為芽孢桿菌、葡萄球菌、乳酸細(xì)菌和酵母菌.李燕等[9]對(duì)黃山臭鱖魚發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus(乳酸菌)是主要優(yōu)勢(shì)菌.對(duì)比國(guó)外的魚類發(fā)酵食品,Matsui等[10]報(bào)道日本傳統(tǒng)發(fā)酵魚(Saba-Narezushi)中主要優(yōu)勢(shì)菌種是Lactobacillus(乳酸菌)、Lactococcus(乳酸乳球菌)和Leuconostoc(明串珠菌),Kuda等[11]通過(guò)測(cè)定日本發(fā)酵魚制品,發(fā)現(xiàn)乳酸菌和乳酸球菌為主要的微生物菌群.

本研究利用高通量測(cè)序方法從海南發(fā)酵羅非魚樣本中共檢測(cè)到2個(gè)優(yōu)勢(shì)種群Peptostreptococcu(消化鏈球菌)和Lactococcus(乳酸乳球菌),以上這兩種菌屬占菌群體數(shù)目一半左右.Proteus(變形桿菌)、Morganella(摩根菌屬)、Psychrobacter(嗜冷菌)、Providencia(普羅威登斯菌)、Streptococcus(鏈球菌)和Enterobacteriaceae_norank(腸桿菌)所占比例為10～20%之間.通過(guò)比較發(fā)海南發(fā)酵魚中的優(yōu)勢(shì)菌與上述國(guó)內(nèi)外報(bào)道所檢測(cè)到優(yōu)勢(shì)種群有差異,這些差異可能是由于發(fā)酵方式不同及所在地域不同引起.本研究研究檢測(cè)到有益菌種,例如Lactobacillus等對(duì)人體健康有特殊的保健作用,且在食品、飼料及醫(yī)療保健領(lǐng)域中享有重要作用[12].鏈球菌病是羅非魚養(yǎng)殖首要病害,近年來(lái)暴發(fā)大規(guī)模鏈球菌病,使羅非魚養(yǎng)殖戶遭受嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.本研究檢測(cè)到在發(fā)酵魚中檢測(cè)到Streptococcus(鏈球菌),其所占比例為3%,因此在發(fā)酵羅非魚加工中對(duì)原材料采購(gòu)中有必要加強(qiáng)對(duì)鏈球菌的檢測(cè).

[1]后立瓊.苗族酸湯中乳酸菌的分離鑒定及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2012:1-3+44.

[2]陳之蘭,楊吉霞,李夢(mèng)寒,等.西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中乳酸菌多樣性及微生物數(shù)量分析[J].食品科學(xué),2013,34(17):140-145.

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MicrobialDiversityinHainanFermentedTilapia

WANG Pei-zheng, XU Yun-sheng

(Hainan Ocean Food Engineering Technology Research Center,Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572200，China)

In order to investigate the diversity of bacterial population structure in Hainan fermented tilapia, V3-V4 regions of the bacterial 16S DNA were analyzed on the basis of theHiSeqsequencing platform.The results showed that the population of bacteria in fermented tilapia samples was abundant.Whereas, the proportion ofPeptostreptococcusin the microbial community of the fermented fish samples is about 33%, followed by that ofLactococcus—about 16%.These two genera are the dominant species in fermented tilapia.Meanwhile,Proteusis accounted for 10%;Morganella, 8%;Psychrobacter, 8%;Providencia, 4%,Streptococcus3%; andEnterobacteriaceae_norank, 2%.In addition, small amount of the potentially harmfulstreptococciwas also detected in the samples.

fermentation; Tilapia; microbial diversity

格式：王沛政,徐云升.海南發(fā)酵羅非魚細(xì)菌多樣性分析[J].海南熱帶海洋學(xué)院,2017,24(5):92-95.

2017-06-26

2016年海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目(ZDKJ2016009-03)

王沛政(1972-),男,陜西西安人,海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院教授,研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué).

徐云升(1963-),男,遼寧遼陽(yáng)人,海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院教授,研究方向?yàn)槭称饭こ?

TS201.3

A

2096-3122(2017) 05-0092-04

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.05.16

(編校李由明)