李朋朋，吳運(yùn)東，葉 嘉，李丹花，喬莉娟，張玉星，董金皋

(1.邯鄲學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北 邯鄲 056005；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071001 )

鴨梨PbChiⅡ的克隆與表達(dá)分析

李朋朋1，吳運(yùn)東1，葉 嘉1，李丹花1，喬莉娟1，張玉星2，董金皋2

(1.邯鄲學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北 邯鄲 056005；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071001 )

為明確幾丁質(zhì)酶在鴨梨抗病過(guò)程中的作用，以鴨梨為試材，提取總RNA，采用RT-PCR方法克隆幾丁質(zhì)酶基因PbChiⅡ，分析PbChiⅡ在梨黑星病菌誘導(dǎo)下的表達(dá)模式，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a-PbChiⅡ，在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達(dá)PbChiⅡ蛋白，分析重組蛋白在非生物脅迫下的生長(zhǎng)能力。結(jié)果表明：PbChiⅡ基因全長(zhǎng)(基因登錄號(hào)：KP876485)969 bp，實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)分析顯示，PbChiⅡ基因的表達(dá)受病原菌的調(diào)控，在供試的96 h內(nèi)，梨黑星病菌可誘導(dǎo)該基因表達(dá)，且表達(dá)量在48 h達(dá)到最高。將PbChiⅡ基因成功克隆到原核表達(dá)載體pET30a上，SDS-PAGE分析表明，該重組蛋白在37 ℃，1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2 h，表達(dá)量最大。轉(zhuǎn)pET30a-PbChiⅡ載體的大腸桿菌BL21(DE3)菌株表達(dá)了分子量約35.53 kDa的重組蛋白。誘導(dǎo)的蛋白可增強(qiáng)菌體在NaCl、CuCl2、CdCl2和ZnSO4等非生物脅迫下的生長(zhǎng)能力。為進(jìn)一步探索PbChiⅡ基因的功能提供了基礎(chǔ)資料。

鴨梨；幾丁質(zhì)酶基因；原核表達(dá)；非生物脅迫；表達(dá)模式

幾丁質(zhì)酶 (Chitinase，Chi)作為一類病程相關(guān)蛋白，是植物遭受生物因素和非生物因素后誘導(dǎo)并產(chǎn)生的[1-3]。

目前已知的植物幾丁質(zhì)酶都屬于小分子蛋白，分子量為25～40 kDa，最適pH值為6.0，多數(shù)以單體形式存在，50 ℃下仍穩(wěn)定存在并保持酶活性，等電點(diǎn)為3～10[4-6]。細(xì)胞內(nèi)、外均有分布，等電點(diǎn)偏酸或偏堿，常被稱為酸性幾丁質(zhì)酶或堿性幾丁質(zhì)酶。很多動(dòng)物、植物、微生物都可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。由于植物自身缺乏有效的免疫系統(tǒng)，因此容易受到外界環(huán)境影響。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，植物會(huì)產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)來(lái)保護(hù)自身[7]。幾丁質(zhì)酶作為一類非常重要的病程相關(guān)蛋白，它能夠降解真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)[8-9]。

研究報(bào)道，幾丁質(zhì)酶在植物的防御機(jī)制中起著重要作用，體內(nèi)外試驗(yàn)表明，單子葉植物和雙子葉植物中的幾丁質(zhì)酶均能抑制真菌幾丁質(zhì)的生長(zhǎng)，植物幾丁質(zhì)酶對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒等生物脅迫和鹽害、冷害、凍害等非生物脅迫均有一定的抗性。

把植物中的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入酵母、大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析、利用是植物幾丁質(zhì)酶發(fā)展的一個(gè)重要方向。Fan等[10]從車前草中克隆得到幾丁質(zhì)酶基因，其純化產(chǎn)物能水解幾丁質(zhì)并可抑制香蕉炭疽盤長(zhǎng)孢菌的生長(zhǎng)。Xayphakatsa等[11]將水稻ClassⅡ類幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)綠色木霉具有一定的抑制效果。Chen等[12]將水稻幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可以降解幾丁質(zhì)的活性。將植物幾丁質(zhì)酶在微生物中進(jìn)行表達(dá)存在許多問(wèn)題，如產(chǎn)生包涵體、無(wú)抑菌活性、表達(dá)產(chǎn)物無(wú)活性等，導(dǎo)致后續(xù)無(wú)法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行繼續(xù)研究。隨著蛋白表達(dá)技術(shù)研究的不斷深入，植物幾丁質(zhì)酶在大腸桿菌、酵母等中進(jìn)行表達(dá)、應(yīng)用的前景十分廣闊。

本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆鴨梨幾丁質(zhì)酶基因PbChiⅡ，分析其在梨黑星病菌處理下的表達(dá)情況，構(gòu)建PbChiⅡ的原核表達(dá)載體并對(duì)PbChiⅡ在大腸桿菌(Escherichiacoli)中的表達(dá)情況和重組蛋白在非生物脅迫下的生長(zhǎng)能力進(jìn)行分析，為后續(xù)PbChiⅡ基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用果實(shí)采自滄州市肅寧縣鴨梨果園。 梨黑星病菌(Venturianashicola)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)梨中心實(shí)驗(yàn)室分離保存。載體pET30α、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XhoⅠ等均購(gòu)自大連TaKaRa公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 鴨梨PbChiⅡ基因的克隆 根據(jù)已克隆得到的PbChiⅡ序列設(shè)計(jì)特異引物，根據(jù)pET30a載體圖譜上的酶切位點(diǎn)選擇適宜的限制性內(nèi)切酶，設(shè)計(jì)基因的上下游引物，上下游引物分別加酶切位點(diǎn)SacⅠ和XhoⅠ，引物序列如下：F：5′-CGAGCTCATG

GAGAAAAAATGGCTTCTG-3′(下劃線部分是SacⅠ酶切位點(diǎn)，斜體為保護(hù)堿基)；R：5′-CCGCTCGAGA

GAAGACGAAGACGAAGAAGATG-3′(下劃線部分是XhoⅠ酶切位點(diǎn)，斜體為保護(hù)堿基)。

以鴨梨cDNA為模板，利用上述設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為：cDNA 1.0 μL，10×Ex PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTP(2.5 mol/L)2.0 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 病原菌接種方法 將梨黑星病菌分生孢子制成孢子懸浮液，濃度約為1×106個(gè)/mL，噴施于7，14，21 d的幼果及成熟期果實(shí)，于噴施后0，3，6，12，24，48，72，96 h取樣，將樣品迅速置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?duì)照果實(shí)取樣時(shí)間及保存方法同上。

1.2.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)分析 RNA的提取采用CTAB法進(jìn)行[13]。用qRT-PCR分析儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。以梨β-Actin(GenBank登錄號(hào)：GU830958)為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)特異引物，上游引物：5′-TTGGGATGGGTCAGAAGG-3′，下游引物：5′-CTGTGAGCAGAACTGGGTG-3′。根據(jù)PbChiⅡ序列設(shè)計(jì)引物，上游引物：5′-ACTACAACTATGGAGAAACG

GGTG-3′和下游引物：5′-CAAAGACATCGTGGGCTG

AAG-3′。反應(yīng)體系為TaKaRa公司的SYBR Master Mix 12.5 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL，加ddH2O補(bǔ)至25 μL。按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)。每處理重復(fù)3次，用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[14]。

1.2.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建 將帶有酶切位點(diǎn)的PbChiⅡ連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，涂布于含氨芐的LB平板，培養(yǎng)12 h，隨機(jī)挑取菌落接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定后送上海生物工程有限公司測(cè)序。

將測(cè)序正確的PbChiⅡ片段連接載體pET30α，轉(zhuǎn)化Trans5α后提取質(zhì)粒做雙酶切檢測(cè)，將獲得的PbChiⅡ片段與pET30α片段連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET30α-PbChiⅡ，提取質(zhì)粒，將雙酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆送上海生工測(cè)序。

1.2.5 IPTG誘導(dǎo)下重組菌株的生長(zhǎng)速度測(cè)定 將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá)時(shí)，經(jīng)終濃度為1 mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)后，與沒有進(jìn)行誘導(dǎo)的菌體進(jìn)行吸光度的比較。

1.2.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的菌液接種于含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)至菌液OD600=0.5時(shí)，向培養(yǎng)基中加入IPTG，使其終濃度為1 mmol/L，37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)1，2 h，向菌體中加入50 μL 1×蛋白上樣緩沖液，沸水浴15 min后將樣品取出并冷卻至室溫，離心后取10 μL上清液于15%的分離膠和5%的濃縮膠中進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)[15]。以重組菌未誘導(dǎo)、空載菌BL21(pET30a)誘導(dǎo)2 h、空載菌BL21(pET30a)未誘導(dǎo)為對(duì)照。

1.2.7 重組菌株抵抗非生物脅迫能力 將重組菌株在LB液體培養(yǎng)基于28 ℃，220 r/min的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h，將菌液濃度稀釋成10-3和10-4，分別吸取10 μL菌液滴在含有NaCl(250，500，750 mmol/L)、CuCl2(250，500，750 μmol/L)、CdCl2(250，500，750 μmol/L)、ZnSO4(250，500，750 μmol/L)的LB平板上，10-3和10-42個(gè)不同濃度菌

液分別滴加在平板兩邊，以不添加NaCl、CuCl2、CdCl2、ZnSO4的LB平板作為對(duì)照。37 ℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1鴨梨PbChiⅡ基因的克隆

利用RT-PCR方法，從果實(shí)的cDNA模板上擴(kuò)增出一條約900 bp大小的條帶，經(jīng)進(jìn)一步克隆測(cè)序得知片段大小為969個(gè)核苷酸，編碼322個(gè)氨基酸，雙下劃線表示起始密碼子。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PbChiⅡ蛋白屬于第Ⅱ類幾丁質(zhì)酶(圖1，2)。

圖1 PbChiⅡ基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 The PCR amplification of PbChiⅡ

圖2 PbChiⅡ的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PbChiⅡ

2.2生物脅迫誘導(dǎo)鴨梨果實(shí)中PbChiⅡ的表達(dá)

對(duì)幼果和成熟期鴨梨果實(shí)進(jìn)行病原菌處理，分析PbChiⅡ的表達(dá)情況。結(jié)果表明，從處理后3 h開始，PbChiⅡ的表達(dá)量開始升高，處理后48 h，PbChiⅡ的表達(dá)量達(dá)到最大值。7，14，21 d 的幼果和成熟期果實(shí)經(jīng)黑星病菌處理后48 h，PbChiⅡ的表達(dá)量分別是同期對(duì)照的3.58，10.18，9.51，6.37倍。7 d幼果經(jīng)黑星病菌處理后48 h，PbChiⅡ的表達(dá)量分別是處理后3，6，12，24，72，96 h的2.80，2.13，1.46，1.42，1.62，2.06倍，14 d幼果經(jīng)黑星病菌處理后48 h，PbChiⅡ的表達(dá)量分別是處理后3，6，12，24，72，96 h的2.61，1.29，1.27，1.11，1.23，1.74倍，21 d幼果經(jīng)黑星病菌處理后48 h，PbChiⅡ的表達(dá)量分別是處理后3，6，12，24，72，96 h的3.09，2.45，1.45，1.41，1.35，1.51倍，成熟期果實(shí)經(jīng)黑星病菌處理后48 h，PbChiⅡ的表達(dá)量分別是處理后3，6，12，24，72，96 h的1.99，1.49，1.41，1.19，1.49，1.55倍(圖3)。

A. 7 d幼果；B.14 d幼果；C.21 d幼果；D.成熟期果實(shí)。A. 7 d young fruit；B. 14 d young fruit；C. 21 d young fruit；D.Mature fruit.

2.3原核表達(dá)載體構(gòu)建

將PbChiⅡ片段與pET30a質(zhì)粒片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后提取陽(yáng)性菌液質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，得到約5 kb和1 kb的條帶，表明PbChiⅡ已連接到pET 30a上。將重組質(zhì)粒再次測(cè)序，結(jié)果表明，插入片段與克隆測(cè)序完全一致。表明pET30a-PbChiⅡ得以成功構(gòu)建(圖4)。

圖4 PbChiⅡ基因原核表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證Fig. 4 Digestion of PbChiⅡ prokaryotic expression vector by two restriction enzymes

2.4重組菌在IPTG誘導(dǎo)下的生長(zhǎng)速度測(cè)定

將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，與未誘導(dǎo)的菌體相比生長(zhǎng)減慢。表明目的基因開始轉(zhuǎn)錄，使菌株生長(zhǎng)減慢，目的基因得以表達(dá)(圖5)。

2.5目的融合蛋白的表達(dá)

SDS-PAG分析表明，重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后出現(xiàn)一條分子量約35.53 kDa的融合蛋白條帶，重組菌未誘導(dǎo)、空載菌BL21(pET30a)未誘導(dǎo)及對(duì)應(yīng)誘導(dǎo)的空載菌都未出現(xiàn)目的蛋白條帶。由此表明PbChiⅡ蛋白得以成功表達(dá)(圖6)。

圖5 重組菌的生長(zhǎng)速度測(cè)定Fig.5 Determination of the growth rate of recombinant isolate

2.6重組菌株在非生物脅迫下的生長(zhǎng)情況

植物幾丁質(zhì)酶基因是一類與抗逆相關(guān)的基因，它受不同脅迫的誘導(dǎo)。本試驗(yàn)中，與BL21(DE3)+pET30a相比，BL21(DE3)+pET30a-PbChiⅡ在含有NaCl(250，500，750 mmol/L)、CuCl2(250，500，750 μmol/L)、CdCl2(250，500，750 μmol/L)、ZnSO4(250，500，750 μmol/L)等非生物脅迫因子的LB固體培養(yǎng)基中具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)能力(圖7)，但是由于原核生物與真核生物的基因表達(dá)系統(tǒng)存在很大差異，因此，該幾丁質(zhì)酶基因在真核生物中是否存在相同現(xiàn)象還需進(jìn)一步研究。

M.Protein molecular weight Marker；1.重組菌未誘導(dǎo)；2.空載菌BL21(pET30a)誘導(dǎo)2 h；3.空載菌BL21(pET30a)誘導(dǎo)1 h；4.空載菌BL21(pET30a)未誘導(dǎo)；5.誘導(dǎo)4 h；6.誘導(dǎo)3 h；7.誘導(dǎo)2 h；8.誘導(dǎo)1 h。

M.Protein molecular weight Marker；1. BL21(pET30a-PbChiⅡ ) without IPTG induction；2.BL21(pET30a) for 2 h cultivation with IPTG induction；3.BL21(pET30a) for 1 h cultivation with IPTG induction；4.BL21(pET30a) without IPTG induction；5.BL21(pET30a-PbChiⅡ ) for 4 h cultivation with IPTG induction；6.BL21(pET30a-PbChiⅡ) for 3 h cultivation with IPTG induction；7.BL21(pET30a-PbChiⅡ ) for 2 h cultivation with IPTG induction；8.BL21(pET30a-PbChiⅡ ) for 1 h cultivation with IPTG induction.

圖6重組載體pET30a-PbChiⅡ誘導(dǎo)蛋白的SDS-PAGE分析
Fig.6TheinducedproteinofrecombinedvectorpET30a-PbChiⅡanalyzedbySDS-PAGE

3 討論與結(jié)論

由真菌引起的植物病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一類重要病害，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)制，它涉及不同的免疫反應(yīng)。包括PR蛋白在內(nèi)的許多抗性基因已經(jīng)從植物中克隆并在植物中得到了廣泛應(yīng)用，且在植物抗病中起了重要作用[16-17]。起初，僅在抗性植株和對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的植株中發(fā)現(xiàn)了PR蛋白，后來(lái)，在被病原菌侵染的感病植株中和受非生物脅迫的植株中也發(fā)現(xiàn)了PR蛋白，在這些PR蛋白中，幾丁質(zhì)酶能夠降解真菌幾丁質(zhì)，在自然界中廣泛存在，且在植物抵抗病菌中起著重要作用[18]。幾丁質(zhì)酶基因在植物抗逆過(guò)程中也起著重要作用[19]。

外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)受多種因素影響，如載體類型、外源基因結(jié)構(gòu)及培養(yǎng)條件等，因此，若想使外源基因得到最大程度的表達(dá)，必須對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。本研究所用表達(dá)載體為pET30a，在IPTG終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)2 h的條件下成功獲得了與預(yù)測(cè)蛋白分子量大小一致的蛋白條帶，這為進(jìn)一步研究PbChiⅡ蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

當(dāng)菌液OD600=0.6時(shí)，分別向接種BL21(DE3)+pET30a-PbChiⅡ(A)和BL21(DE3)+pET30a(B)的LB液體培養(yǎng)基中加入IPTG以誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，將BL21(DE3)+pET30a-PbChiⅡ(A)和BL21(DE3)+pET30a(對(duì)照)(B)接種在含有NaCl、CuCl2、CdCl2和ZnSO4的LB平板上，LB平板上紅線的左側(cè)接種10-3的菌液，右側(cè)接種10-4的菌液，培養(yǎng)基中含有NaCl(250，500，750 mmol/L)、CuCl2(250，500，750 μmol/L)、CdCl2(250，500，750 μmol/L)和 ZnSO4(250，500，750 μmol/L)，以LB培養(yǎng)中不添加任何物質(zhì)的為對(duì)照。

Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) was added to the cultures of BL21 (DE3)+pET30a-PbChiⅡ(A)and BL21(DE3)+pET30a (B)to induce the expression of recombinant protein. The cultures were adjusted to OD600=0.6. Spot assays of BL21(DE3)+pET30a-PbChiⅡ(A) and BL21(DE3)+pET30a (control) (B)on Luria-Bertani (LB) plates with NaCl，CuCl2，CdCl2and ZnSO4，Ten microliters from 10-3(left side of the red line on the plate) to 10-4(right side of the red line on the plate) dilutions were spotted onto LB plates without any supplement (CK) or with NaCl (250，500，50 mmol/L)，CuCl2(250，500,750 μmol/L)，CuCl2(250，500,750 μmol/L) and ZnSO4(250，500,750 μmol/L)，respectively.

圖7重組蛋白在非生物脅迫下的生長(zhǎng)
Fig.7Thegrowthofrecombinantproteinunderabioticstresses

植物在被病原菌侵染初期就產(chǎn)生了防衛(wèi)反應(yīng)[20-22]，本研究表明，梨黑星病菌侵染鴨梨果實(shí)3～96 h后，PbChⅡ的表達(dá)量均高于處理后0 h，表明PbChiⅡ在寄主被病原菌侵染的初期可能就開始發(fā)揮作用。

幾丁質(zhì)酶不但受生物脅迫的誘導(dǎo)，也受非生物脅迫的誘導(dǎo)[23]。本研究中，重組蛋白在4種非生物脅迫下(NaCl、CuCl2、CdCl2、ZnSO4)表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)特性，有研究報(bào)道[24-25]，在脅迫條件下，含有重組蛋白的E.coli在脅迫條件下生長(zhǎng)良好，Chaurasia等[26]發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫、熱脅迫等條件下，植物螯合態(tài)合成酶基因PCS在E.coli具有很好的表達(dá)特性。甘蔗dirigent蛋白基因SiDir的重組蛋白在NaCl和PEG脅迫下仍具有良好的生長(zhǎng)特性[25]。甘蔗幾丁質(zhì)酶基因ScChiⅢ的重組蛋白在鹽脅迫等條件下仍表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)特性[27]。這表明在生物脅迫和非生物脅迫下，幾丁質(zhì)酶基因在原核生物和真核生物中的調(diào)控機(jī)制是類似的。

[1] 蔣選利，李振岐，康振生，等. 幾丁質(zhì)酶與植物的抗病性[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，11(3)：71-75.

[2] 張福麗，王占斌，王志英. 幾丁質(zhì)酶在植物抗真菌病害中的作用[J]. 林業(yè)科技，2006，31(3)：24-27.

[3] Guan Y，Ramalingam S，Nagegowda D，et al.Brassicajunceachitinase BjCHI1 inhibits growth of fungal phytopathogens and agglutinates Gram-negative bacteria[J]. Journal of Experimental Botany，2008，59(12)：3475-3484.

[4] 高武軍，孫 毅，王景雪，等. 植物幾丁質(zhì)酶及其基因工程研究進(jìn)展[J]. 世界農(nóng)業(yè)，1999，1(3)：22-24.

[5] 陳 龍. 植物幾丁質(zhì)酶的生物學(xué)作用[J]. 生物學(xué)教學(xué)，2002，27(7)：26-27.

[6] 朱雪峰，陳崇順，郁志芳. 植物幾丁質(zhì)酶的生物功能[J]. 生命的化學(xué)，2000，20(1)：36-37.

[7] Walters D，Walsh D，Newton A，et al. Induced resistance for plant disease control：maximizing the efficacy of resistance elicitors[J]. Phytopathology，2005，95(12)：1368-1373.

[8] Neuhaus J-M．Plant chitinases (PR-3，PR-4，PR-8，PR-11) [M]//Datta S K.Muthukrishnan S (eds) Pathogenesis-related proteins in plants Boca Raton.CRC Press LLC，1999：77-105．

[9] Punja Z K．Genetic engineering of plants to enhance resistance to fungal pathogens[M]．New York：Fungal Disease Resistance in Plants Biochemistry Molecular Biology and Genetic Engineering，2004：207-258．

[10] Fan J，Wang H，F(xiàn)eng D，et al. Molecular characterization of plantain class i chitinase gene and its expression in response to infection byGloeosporiummusarumCke and Massee and other abiotic stimuli[J]. Journal of Biochemistry，2007，142(5)：561-570.

[11] Xayphakatsa K，Tsukiyama T，Inouye K，et al. Gene cloning，expression，purification and characterization of rice(OryzasativaL.)class Ⅱ chitinase CHT11[J]. Enzyme and Microbial Technology，2008，43(1)：19-24.

[12] Chen A，Yu L，F(xiàn)an J，et al. The expression，purification and activity analysis of the rice chitinase gene inEscherichiacoli[J]. Chinese Journal of Biotechnology，2008，24(2)：188-192.

[13] 蔡斌華，張計(jì)育，高志紅，等. 一種改良的提取草莓屬葉片總RNA的方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24(6)：875-877.

[14] Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method[J]. Methods，2001，25(4)：402-408.

[15] Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature，1970，227(5259)：680-685.

[16] Hartl L，Zach S，Seidl-Seiboth V. Fungal chitinases：diversity，mechanistic properties and biotechnological potential[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2012，93(2)：533-543.

[17] 陳冬陽(yáng)，楊明明，高 翔，等. 普通小麥幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 麥類作物學(xué)報(bào)，2016，36(5)：539-548.

[18] Takken F W，Joosten M . Plant resistance genes：their structure，function and evolution[J]. European Journal of Plant Pathology，2000，106(8)：699-713.

[19] Rawat S，Ali S，Mittra B，et al. Expression analysis of chitinase upon challenge inoculation toAlternariawounding and defense inducers inBrassicajuncea[J]. Biotechnology reports，2017，13：72-79.

[20] Mohamed F，Lydia F，Masumi I，et al. Expression of potential defense responses of Asian and European pears to infection withVenturianashicola[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，2004，64(6)：319-330.

[21] 程 曦，田彩娟，李愛寧，等. 植物與病原微生物互作分子基礎(chǔ)的研究進(jìn)展[J]. 遺傳，2012，34(2)：134-144.

[22] Dodds P N，Rathjen J P. Plant immunity：towards an integrated view of plant-pathogen interactions[J]. Nature Reviews Genetics，2010，11(8)：539-548.

[23] Viswanathan R，Samiyappan R. Antifungal activity of chitinases produced by some fluorescent pseudomonads againstColletotrichumfalcatumwent causing red rot disease in sugarcane[J]. Microbiological Research，2001，155(4)：309-314.

[24] Gupta K，Agarwal P K，Reddy M K，et al. SbDREB2A，an A-2 type DREB transcription factor from extreme halophyteSalicorniabrachiataconfers abiotic stress tolerance inEscherichiacoli[J]. Plant Cell Reports，2010，29(10)：1131-1137.

[25] Jin L G，Li P X，Jing P F，et al. A novel dirigent protein gene with highly stem-specific expression from sugarcane，response to drought，salt and oxidative stresses[J]. Plant Cell Reports，2012，31(10)：1801-1812.

[26] Chaurasia N，Mishra Y，Rai L C. Cloning expression and analysis of phytochelatin synthase (pcs) gene fromAnabaenasp. PCC 7120 offering multiple stress tolerance inEscherichiacoli[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，376(1)：225-230.

[27] Su Y，Xu L，F(xiàn)u Z，et al. ScChi，encoding an acidic class Ⅲ chitinase of sugarcane，confers positive responses to biotic and abiotic stresses in sugarcane[J]. International Journal of Molecular Sciences，2014，15(2)：2738-2760.

CloningandExpressionAnalysisofPbChiⅡfromPyrusbretschneideriYali

LI Pengpeng1，WU Yundong1，YE Jia1，LI Danhua1，QIAO Lijuan1，ZHANG Yuxing2，DONG Jingao2

(1.College of Life Science and Engineering，College of Handan，Handan 056005，China；2.Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China)

To clarify the role of chitinase in the process of pear resistance disease, the total RNA of Yali was extracted and specific primers were designed to amplify the coding region of PbChi Ⅱ protein by RT-PCR，analysed the expression pattern ofPbChiⅡ after treatment with pathogens. The prokaryotic expression vector pET30a-PbChiⅡ was constructed and the recombinant protein was expressed inE.coliBL21 (DE3). The recombinant protein growth ability was analyzed under abiotic stress. The results showed that the length ofPbChiⅡ(GenBank accession Number：KP876485) gene was 969 bp，Quantitative Real-time PCR ( qRT-PCR) analysis revealed that the expression ofPbChiⅡ was regulated by pathogens，and enhanced up to the peak at 48 h after treatment withVenturianashicoladuring 96 h. ThePbChiⅡ gene was successfully subcloned into the expression vector pET30a. SDS-PAGE analysis showed that a specific recombinant protein of approximately 35.53 kDa was produced in the BL21 (DE3) with the prokaryotic expression vector pET30a-PbChiⅡ in 37 ℃ with 1.0 mmol/L IPTG for 2 hours. This protein enhanced the stress of isolate with NaCl，CuCl2，CdCl2and ZnSO4. This research provided basic references for further study the function ofPbChiⅡ.

PyrusbretschneideriYali；Chitinase gene；Prokaryotic expression；Abiotic stresses；Expression pattern

2017-07-19

邯鄲學(xué)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目(16101)；邯鄲市科技局項(xiàng)目(1627201054-2)；河北省高校冀南太行山區(qū)野生資源植物應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心

李朋朋(1987-)，女，河北邯鄲人，講師，博士，主要從事植物病理學(xué)研究。

Q78

A

1000-7091(2017)05-0045-07

10.7668/hbnxb.2017.05.008