張鵬鈺，袁 珍，王國(guó)瑞，王同朝，尹 鈞，3，衛(wèi) 麗，3，劉毓俠

(1.河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；4.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002)

普通小麥Trx59基因的克隆及功能驗(yàn)證

張鵬鈺1，2，袁 珍2，王國(guó)瑞2，王同朝1，2，尹 鈞2，3，衛(wèi) 麗2，3，劉毓俠4

(1.河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；4.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為進(jìn)一步挖掘小麥春化相關(guān)基因，探明小麥春化發(fā)育調(diào)控機(jī)制，從不同春化發(fā)育特性小麥品種春化響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序結(jié)果中篩選并克隆到1個(gè)EST序列，命名為Trx59，該基因的開放閱讀框?yàn)?72 bp，編碼124個(gè)氨基酸，保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，Trx59基因有1個(gè)Thioredoxin結(jié)構(gòu)域。利用qRT-PCR分析了在春化處理過程中Trx59基因在不同春化發(fā)育特性小麥品種的表達(dá)特性，并利用VIGS技術(shù)進(jìn)行基因功能的初步驗(yàn)證。結(jié)果表明：隨著春化處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Trx59基因的表達(dá)量逐漸升高，從表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間來看，Trx59基因的表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間表現(xiàn)為春性品種高于且早于冬性品種。構(gòu)建BSMV：Trx59重組載體并接種于小麥植株，14 d后出現(xiàn)明顯的光漂白現(xiàn)象，Trx59基因的表達(dá)水平急劇降低，說明Trx59基因已被顯著抑制；BSMV：Trx59接種的小麥植株穗分化明顯晚于陰性對(duì)照組，初步判斷Trx59基因與小麥發(fā)育有關(guān)。

小麥；春化；表達(dá)分析；病毒誘導(dǎo)的基因沉默；功能驗(yàn)證

硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)是一類高度保守的低分子量蛋白。自Andersen等[1-2]在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白作為核苷酸還原酶的氫供體以來，人們相繼在動(dòng)、植物中發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白并對(duì)其功能進(jìn)行了諸多研究。硫氧還蛋白擁有多種生物學(xué)功能，其中包括參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、基因轉(zhuǎn)錄等，對(duì)維持體內(nèi)穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)起著十分重要的作用[3-4]。有研究認(rèn)為，Trxh在谷物種子萌發(fā)過程中起非常重要的作用。任江萍等[5-6]通過基因槍法將反義Trxs基因?qū)肫胀ㄐ←溨?，發(fā)現(xiàn)在種子萌發(fā)過程中轉(zhuǎn)Trxs基因小麥植株的Trxh活性明顯低于對(duì)照，脫支酶活性也低于對(duì)照從而增強(qiáng)小麥抗穗發(fā)芽的能力。反義Trxs基因?qū)π←溩蚜５矸鄯e累也有一定的正效應(yīng)，轉(zhuǎn)基因株系的總淀粉和支鏈淀粉的積累速率較對(duì)照顯著提高[7]。硫氧還蛋白通過還原儲(chǔ)藏蛋白和其他胚乳蛋白分子內(nèi)部的二硫鍵進(jìn)而增加儲(chǔ)藏蛋白對(duì)水解作用的敏感性，同時(shí)還直接或間接通過抑制蛋白抑制因子來改變酶的活性[8-10]。任江萍和Guo等[11-12]報(bào)道，轉(zhuǎn)反義Trxs基因小麥植株在種子發(fā)芽過程中谷蛋白降解速度明顯慢于對(duì)照植株。Trx與植物抗逆性也密切相關(guān)，如抗旱、耐熱、抗氧化和低溫等脅迫。干旱誘導(dǎo)產(chǎn)生的硫氧還蛋白CDSP32，通過保護(hù)葉綠體的結(jié)構(gòu)來對(duì)抗由干旱引起的氧化脅迫[13]。夏德習(xí)等[14]報(bào)道，轉(zhuǎn)硫氧還蛋白M1 型基因能夠增強(qiáng)植物對(duì)逆境的耐受力，尤其是氧化脅迫。在低溫脅迫下，水稻中的Trx23被誘導(dǎo)表達(dá)從而抑制了MPK3和MPK6的活性[15]。

普通小麥?zhǔn)俏覈?guó)麥類作物的主要栽培種，其發(fā)育特性決定了小麥的種植區(qū)域[16-17]。本研究從不同春化發(fā)育特性小麥品種遼春10和京841春化響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組Illumina高通量測(cè)序結(jié)果中，篩選到1個(gè)Unigene59候選基因，經(jīng)生物學(xué)信息分析該基因含有1個(gè)Thioredoxin結(jié)構(gòu)域，暫命名為Trx59。本研究系統(tǒng)分析了該基因在不同發(fā)育特性小麥品種中的表達(dá)特性；并利用VIGS的方法進(jìn)行基因初步功能驗(yàn)證，以期為研究硫氧還蛋白在低溫脅迫下的作用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料及處理方法

本試驗(yàn)所用小麥品種為春性品種遼春10號(hào)(LC10)和冬性品種京841(J841)，均由國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心提供。

春化材料處理方法：挑取籽粒飽滿且大小均一的遼春10號(hào)和京841小麥種子，用75%酒精浸泡30 s，重復(fù)1次，用蒸餾水浸泡5 min，置于黑暗處25 ℃浸泡12 h，待種子萌動(dòng)后腹溝朝下置于培養(yǎng)皿中放入4 ℃的春化箱中進(jìn)行低溫處理，分別于春化處理7，14，21，28，35，42，49 d后取小麥葉片，液氮速凍后-80 ℃保存。

BSMV病毒沉默材料處理方法：挑選籽粒飽滿且大小均一的京841種子，種子消毒處理同春化材料處理方法，待種子萌動(dòng)出芽1～2 cm后移植萌動(dòng)沙土∶草炭土=1∶1的花盆中，并放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃/18 ℃、16 h光照/8 h黑暗、光照強(qiáng)度350 μmol/(m2·s)，當(dāng)小麥長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的小麥植株進(jìn)行大麥花葉條紋病毒(BSMV)的接種。

1.2總RNA提取及cDNA第一鏈合成

取上述保存葉片在液氮中細(xì)研，采用TRIzol試劑(Invitrogen)提取葉片總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScriptRTreagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)的操作說明進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.3目的基因克隆

分別以J841和LC10的cDNA為模板，Trx59-F1和Trx59-R1為引物(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25 μL，包含LATaq(5 U/μL)0.2 μL、2×GC BufferⅡ 2 μL、dNTP Mixture(10 mmol/L) 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，連接至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)挑取陽(yáng)性單克隆，送往北京華大基因有限公司測(cè)序。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

將不同春化處理7～49 d所取的遼春10號(hào)和京 841 的葉片混合后提取RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，Trx59-F2和Trx59-R2為引物(表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析，參照TaKaRa熒光定量PCR SYBR?Green Ⅰ試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)在 Bio-red CFX96 熒光定量 PCR 儀上運(yùn)行，PCR反應(yīng)體系為 20 μL，反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s。以小麥的β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。

1.5BSMV病毒沉默載體的構(gòu)建及接種

1.5.1 BSMV病毒沉默載體的構(gòu)建 選取J841 的cDNA作為模板，用表1中的引物對(duì)Trx59-F3和Trx59-R3擴(kuò)增出Trx59的cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)，連入pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化至DH5α，挑取陽(yáng)性單克隆，經(jīng) PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性后測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒，用NheⅠ 酶切BSMV-Trx59-pMD18-T質(zhì)粒得到目的片段以及BSMV-γ：GFP載體。然后將目的片段與經(jīng)NheⅠ酶切后的BSMV-γ：GFP載體大片段連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取白色菌斑置于 37 ℃搖菌，提取質(zhì)粒酶切檢測(cè)，選取陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證。將BSMV-α、BSMV-γ和BSMV-γ重組質(zhì)粒用MluⅠ進(jìn)行線性化、BSMV-β載體用SpeⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化及回收純化。純化后的BSMV線性化產(chǎn)物，用Promega公司的RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7和Ribo m7G Cap Analog的試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，以試劑盒中線性化的DNA template為陽(yáng)性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，每個(gè)體系取2.5 μL體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行1%的凝膠電泳檢測(cè)。

1.5.2 BSMV病毒接種 取BSMV-α 45 μL，BSMV-β 45 μL，BSMV-γ/重組載體45 μL，2×GKP Buffer 135 μL，混合均勻用于病毒接種。接種液摩擦接種于第2葉片，每株5～10 μL，接種完畢后噴施少量0.1% DEPC水以保持濕潤(rùn)，用保鮮膜覆蓋3 d，置于光照培養(yǎng)箱(25 ℃/18 ℃、16 h光照/8 h黑暗、光照強(qiáng)度350 μmol/(m2·s)中。BSMV病毒接種3 d后，揭開保鮮膜，定期澆水，觀察接種后小麥植株的表型，并于接種7 d開始每周取新生葉片直至第49天，提取總RNA，用于轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)。

表1 基因克隆和載體構(gòu)建引物Tab.1 The primers for gene cloning and vector construction

注：引物序列中下劃線標(biāo)注部分為引入的酶切位點(diǎn)序列。

Note：The underline part in primer sequence is the enzyme loci.

2 結(jié)果與分析

2.1Trx59基因的克隆及序列分析

以LC10和J841的cDNA為模板，Trx59-F1和Trx59-R1為引物擴(kuò)增均得到長(zhǎng)度為718 bp的片段，與預(yù)期產(chǎn)物大小一致(圖1)。將PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，連接至pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，且J841和LC10的擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果完全一致。Trx59基因的ORF為372 bp，編碼124個(gè)氨基酸，保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，Trx59基因有1個(gè)Thioredoxin結(jié)構(gòu)域，屬于Thioredoxin家族。

1.J841；2.LC10；M.DL2000。

2.2Trx59基因編碼氨基酸的同源序列及進(jìn)化樹分析

運(yùn)行NCBI軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，搜索出多條與Trx59同源的氨基酸序列，用DNAMAN軟件對(duì)不同物種的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有參比序列均含有1個(gè)Thioredoxin結(jié)構(gòu)域，Trx59基因編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度與其他物種Thioredoxin結(jié)構(gòu)域序列長(zhǎng)度相近，該結(jié)構(gòu)域在序列上非常保守。Trx59基因編碼的氨基酸序列與烏拉圖小麥、山羊草、大麥、甘蔗、番薯、三葉草氨基酸序列同源性分別達(dá)59.0%，56.6%，50.7%，30.0%，29.0%，26.3%(圖2)。

運(yùn)用MEGA5.1軟件對(duì)這些序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，分析不同物種Trx蛋白的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果如圖3所示，Trx59與烏拉圖小麥和山羊草的Trx蛋白親緣關(guān)系最近，其次是大麥，和三葉草、柑橘、菜豆Trx蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.3Trx59基因在不同春化發(fā)育特性小麥品種中的表達(dá)特性分析

春化處理過程中，Trx59基因在不同春化發(fā)育特性小麥品種中均呈拋物線型趨勢(shì)(圖4)。春化處理第14天，Trx59基因在春性品種LC10中表達(dá)量急劇升高，于春化42 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后表達(dá)量下降；Trx59基因在冬性品種J841中表達(dá)量緩慢增加，從第35天時(shí)表達(dá)量急劇升高，于第49天達(dá)到最大值，但其表達(dá)量仍低于春性品種LC10。從表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間來看，Trx59基因的表達(dá)在春性品種要高于且早于冬性品種。

圖2 Trx59基因編碼的氨基酸序列與其他物種氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of the amino acid sequences of Trx59 with other species

圖3 Trx59遺傳進(jìn)化分析Fig.3 A phylogenetic tree analysis of Trx59 with other species

2.4BSMV病毒接種后表型變化及基因表達(dá)特性分析

J841小麥植株長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)進(jìn)行BSMV病毒接種，BSMV：Trx59病毒接種后7 d小麥植株第2葉片出現(xiàn)微弱的病毒癥狀和光漂白現(xiàn)象；接種14 d后，第2葉片光漂白現(xiàn)象明顯且進(jìn)一步擴(kuò)大，新生出的第3片葉出現(xiàn)白斑，說明病毒已成功侵染小麥植株(圖5)。病毒接種21 d后，陰性對(duì)照組BSMV：00出現(xiàn)微弱的光漂白現(xiàn)象，BSMV：Trx59接種的小麥植株第2片葉子已完全白化，第3片葉子白化癥狀非常明顯，新生的第4片葉也出現(xiàn)了微弱的失綠表型。BSMV：Trx59病毒接種后第35天，光漂白癥狀逐漸消失，新生葉片正常生長(zhǎng)。

圖4 春化處理過程中Trx59基因在LC10和J841中的表達(dá)特性分析Fig.4 Relative expression analysis of Trx59 gene in LC10 and J841 under vernalization treatment

圖5 BSMV：Trx59接種14 d后小麥植株葉片表型的變化Fig.5 Changes of leaf phenotypes after BSMV：00 and BSMV： Trx59 inoculation at 14 days

BSMV病毒接種后每周挑取生長(zhǎng)良好、病毒表型明顯的小麥植株葉片，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測(cè)BSMV：Trx59轉(zhuǎn)錄本水平表達(dá)量變化。定量結(jié)果顯示：在BSMV病毒接種第7天時(shí)，Trx59基因的表達(dá)水平急劇降低，約為對(duì)照的0.7倍，隨著BSMV病毒接種時(shí)間的延長(zhǎng)，Trx59基因的表達(dá)量繼續(xù)降低；在BSMV病毒接種后第21天，Trx59基因表

達(dá)量最低，為對(duì)照的36%，說明Trx59基因已被顯著抑制(圖6)。

圖6 BSMV：Trx59病毒接種后Trx59基因表達(dá)特性分析Fig.6 Expression analysis of Trx59 genes after the inoculation of BSMV：Trx59 recombinant vector

2.5BSMV-VIGS植株幼穗分化進(jìn)程分析

小麥幼穗分化受多種因素如品種、光照、溫度等的影響。目前人們普遍認(rèn)為二棱期是小麥通過春化作用的重要指標(biāo)[18]。BSMV：00和BSMV：Trx59病毒接種14 d后，小麥植株的幼穗分化均處于單棱期；病毒接種21 d后，BSMV：00接種的小麥植株幼穗分化開始進(jìn)入二棱初期，BSMV：Trx59接種的小麥植株穗分化仍處于單棱期。BSMV：00接種的小麥植株在病毒接種28 d后穗分化進(jìn)入二棱中期，而BSMV：Trx59接種的小麥植株穗分化剛剛進(jìn)入二棱初期，明顯晚于陰性對(duì)照組(表2)。

表2 接種BSMV病毒對(duì)小麥幼穗分化的影響Tab.2 Effect of BSMV virus inoculation on spike differentiation process of wheat

3 結(jié)論與討論

硫氧還蛋白廣泛存在于生物體內(nèi)，參與多個(gè)生化代謝過程。盡管其有一個(gè)保守的活性中心CXXC，但也有不含該基序的蛋白，稱為TRX類似蛋白。本研究克隆的Trx59基因不含有CXXC，應(yīng)歸屬于TRX類似蛋白。該基因編碼124個(gè)氨基酸，結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示：該基因有1個(gè)Thioredoxin結(jié)構(gòu)域，序列分析表明，不同發(fā)育特性小麥品種中該基因序列高度保守，且該基因沒有內(nèi)含子。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，該基因與烏拉圖小麥和山羊草的Trx蛋白親緣關(guān)系最近。

據(jù)報(bào)道，在各種生物和非生物脅迫下，硫氧還蛋白均被誘導(dǎo)表達(dá)。He等[19]發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯中的TRXh1基因在4 ℃低溫脅迫下表達(dá)量升高，從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控馬鈴薯塊莖的糖含量。本研究中，Trx59基因在春化處理過程中在不同春化發(fā)育特性品種中均呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，且春性品種早于冬性品種，說明Trx59基因受低溫脅迫而被誘導(dǎo)表達(dá)，與Xie等[15]和Kocsy等[20]的研究結(jié)果一致。

VIGS作為新出現(xiàn)的功能基因組學(xué)研究方法，它是利用反向遺傳學(xué)研究基因的功能，克服了傳統(tǒng)功能基因組學(xué)研究方法的局限性，操作簡(jiǎn)單，試驗(yàn)周期短，能夠在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)失去目標(biāo)基因功能的表型，從而進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，所有工作都在一代植物中完成，不需要復(fù)雜的突變體篩選，不需要遺傳轉(zhuǎn)化，大大降低了成本和勞動(dòng)強(qiáng)度，而且VIGS能瞬時(shí)沉默幼苗或成熟植株靶基因，即使是具有突變致死效應(yīng)或與生長(zhǎng)發(fā)育緊密相關(guān)的基因，也可用VIGS技術(shù)來鑒定功能[21-22]。本研究中采用VIGS方法將Trx59基因沉默后，植株葉片出現(xiàn)白色條紋狀帶，與空載相比，基因表達(dá)量明顯降低，進(jìn)一步說明該基因被沉默。從穗分化進(jìn)程來看，BSMV：Trx59接種的小麥植株穗分化明顯慢于空載，說明Trx59基因沉默后，小麥幼穗分化進(jìn)程受到抑制，由此可以初步判斷Trx59基因與小麥春化發(fā)育有關(guān)，還需要進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

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CloningandFunctionalVerificationofTrx59GeneinCommonWheat

ZHANG Pengyu1，2，YUAN Zhen2，WANG Guorui2，WANG Tongchao1，2，YIN Jun2，3，WEI Li2，3,LIU Yuxia4

(1.Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops，Zhengzhou 450002，China；2.School of Agronomy，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；3.National Engineering Research Center for Wheat，Zhengzhou 450002，China；4.Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China)

In order to further excavate the related genes of wheat vernalization，explored the regulation mechanism of wheat vernalization，this study screened and cloned an EST sequence from a high-throughput RNA sequencing analysis comparing the transcriptomes with wheat varieties with different developmental characteristics under vernalization and non-vernalization treatment，and namedTrx59. The open reading frame (ORF) ofTrx59 gene was 372 bp，ecoding 124 amino acids，and contained one thioredoxin domain structure. Expression analysis was conducted by qRT-PCR and the gene function was verification by using VIGS technique. The result showed that the expression level ofTrx59 was gradually up-regulated during vernalizaton process；the expression level and time ofTrx59 gene in spring variety LC10 was higher and earlier than that in winter variety J841. BSMV：Trx59 recombinant vector was built and inoculated wheat plants of J841. After 14 days of inoculation，the leaves appeared visible light bleaching phenomenon，and the expression level ofTrx59 reduced sharply，indicating thatTrx59 gene had been significantly suppressed；the spike differentiation process of plants inoculated by BSMV：Trx59 was later than that of the negative control group，deducing that theTrx59 genes may be related to the wheat developmental characteristics.

Wheat；Vernalization；Expression analysis；VIGS；Functional verification

2017-08-05

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2017YFD0301106)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471452)

張鵬鈺(1991-)，女，河南鄭州人，在讀博士，主要從事小麥發(fā)育研究。

衛(wèi) 麗(1966-)，女，河南商丘人，研究員，博士，主要從事小麥發(fā)育研究。 劉毓俠(1965-)，女，河南商丘人，研究員，主要從事作物遺傳育種及期刊編輯工作。

Q78；S512.03

A

1000-7091(2017)05-0001-06

10.7668/hbnxb.2017.05.001