張夢梅，劉芳，胡凱弟，胡露，劉金霞，張美佳，劉書亮,2*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014) 2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品加工與安全研究所，四川 雅安，625014)

酵素食品微生物指標(biāo)與主要功效酶及有機酸分析

張夢梅1，劉芳1，胡凱弟1，胡露1，劉金霞1，張美佳1，劉書亮1,2*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014) 2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品加工與安全研究所，四川 雅安，625014)

為了解不同原料自然發(fā)酵酵素食品中微生物組成，評價市售酵素食品的理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)、主要功效酶活力和有機酸組成，對23份發(fā)酵期酵素樣品進行酵母菌數(shù)、乳酸菌數(shù)和醋酸菌數(shù)測定，對4種市售酵素食品進行總酸、可溶性固形物含量、微生物指標(biāo)及蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、超氧化物歧化酶活力測定，并采用高效液相色譜法對其有機酸的種類及含量進行分析。結(jié)果表明，發(fā)酵期酵素中廣泛存在酵母菌、乳酸菌和醋酸菌；市售酵素食品的功效酶活力偏低，主要有機酸為草酸、蘋果酸、乳酸和乙酸。結(jié)論：市售酵素食品質(zhì)量參差不齊，功效酶活力較低，與其宣傳功效不符。該研究為了解酵素食品品質(zhì)、正確看待酵素食品提供了數(shù)據(jù)參考。

酵素食品；微生物；酶活；有機酸

酵素，實際上是“酶”的舊譯，是由生物體產(chǎn)生的具有催化活性的大分子，參與人體新陳代謝、機體免疫和組織修復(fù)等生命活動。酵素食品是指以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、藥食同源中草藥等為原料，經(jīng)多種有益菌發(fā)酵而成的功能性產(chǎn)品，含有豐富的酶、維生素、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分[1]。具有改善腸胃功能[2-3]、增強機體免疫力[4]、美白抗衰[5]等功能。酵素食品的原料豐富，產(chǎn)品種類多樣，如酵素原液、酵素粉、酵素片、酵素飲料等。近年來，學(xué)者對酵素的發(fā)酵工藝和酵素食品的抗氧化性進行了較多研究。酵素食品發(fā)酵工藝有自然發(fā)酵和人工接種發(fā)酵兩種，人工接種發(fā)酵根據(jù)發(fā)酵劑的不同可以分為單一菌種發(fā)酵[6]和多菌混合發(fā)酵[7]。酵素食品普遍具有較好的抗氧化性，發(fā)酵過程中抗氧化性能總體呈現(xiàn)上升趨勢[8]。

酵母菌、乳酸菌和醋酸菌為發(fā)酵食品中的常見微生物，三者之間共同作用可以形成獨特風(fēng)味。如民間傳統(tǒng)茶飲料“紅茶菌”即是由酵母菌、乳酸菌和醋酸菌組成的共生體系將糖和茶葉發(fā)酵而成[9]；食醋的釀造也是常見的多菌發(fā)酵體系。酶活是酵素的主要質(zhì)量指標(biāo)，蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是酵素類食品的主要功效酶。其中SOD酶活性是評價酵素品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，也是各品牌在保健功效上的宣傳重點。有機酸是大分子化合物的代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵食品香味的形成中起著重要作用[10]。近年來關(guān)于酵素食品中有機酸成分的研究鮮見報道，僅蔣增良[11]對葡萄酵素、藍莓酵素、樹莓酵素中有機酸的種類及含量進行了分析，ARUN等[12]測定了環(huán)保酵素不同發(fā)酵階段的有機酸含量，酵素食品中有機酸來源于果蔬原料及有益菌的代謝產(chǎn)物。

本研究分析了不同原料的酵素發(fā)酵期的微生物組成，對國內(nèi)市售的4種不同品牌、不同原料的液體酵素進行了理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)、主要功效酶活性測定和有機酸成分分析，對液體酵素產(chǎn)品質(zhì)量進行了初步評價，以期為液體酵素食品品質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

發(fā)酵期酵素1～23號(發(fā)酵時間約為30～180 d)；市售酵素A、B、C、D。

表1 發(fā)酵期酵素原料

表2 市售酵素原料

1.2試劑與儀器

1.2.1 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯，杭州微生物試劑有限公司。

乳酸菌固體培養(yǎng)基(MRS)：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖20.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO40.58 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，牛肉膏10.0 g，MnSO40.25 g，吐溫80 2.0 g，乙酸鈉5.0 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 6.0～6.4。

醋酸菌固體培養(yǎng)基：酵母膏10.0 g，葡萄糖10.0 g，CaCO315.0 g，瓊脂20.0 g，水1 000 mL，使用前添加30 mL無水乙醇。

平板計數(shù)培養(yǎng)基(PCA)：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂15.0 g，水1 000 mL，pH 6.8～7.2。

以上培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 試劑

氫氧化鈉、鹽酸、福林試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、乳酸、乳酸鈉、標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白、L-酪氨酸、聚乙烯醇、橄欖油、乙醇、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、碘、碘化鉀、可溶性淀粉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、鄰苯三酚：分析純，成都市科龍化工試劑廠；酚酞：分析純，成都化學(xué)試劑廠；三羥甲基氨基甲烷，分析純：北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈：色譜純，瑞典Oceanpak公司。

有機酸標(biāo)準(zhǔn)品：L-蘋果酸(純度≥99%)，美國Sigma公司；檸檬酸(純度≥99.5%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乳酸、乙酸、琥珀酸、草酸、酒石酸(純度≥99.5%)，天津市光復(fù)精細化工研究所。

1.2.3 儀器與設(shè)備

CPA225D型精密天平，德國Sartorius公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；VBR90A手持折光儀，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；LC-2010C HT液相色譜儀，日本Shimazu公司，配可變波長紫外檢測器(UV)；LC-Solution工作站，日本Shimazu公司；Milli-Q Gradient超純水儀，美國Millipore公司；Sorvall ST 16R冷凍離心機，美國Termo Fisher Scientific公司；SCIENTZ-09無菌均質(zhì)器，寧波新芝生物科技有限股份有限公司；Sep-Pak C18固相萃取小柱，美國Waters公司。

1.3方法

1.3.1 理化指標(biāo)測定

總酸：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，采用酸堿滴定法，以乳酸計。每個樣品重復(fù)測定3次。

可溶性固形物：取1 mL樣品經(jīng)蒸餾水稀釋后采用VBR90A手持折光儀測定可溶性固形物含量。

1.3.2 微生物指標(biāo)分析

菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2010；酵母菌、霉菌數(shù)：參照GB 4789.15—2010；乳酸菌數(shù)：參照GB 4789.35—2010；醋酸菌數(shù)：將樣品梯度稀釋，選擇適宜梯度吸取0.1 mL液體涂布于醋酸菌固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)；大腸菌群：參照GB 2789.3—2010。

1.3.3 酶活性測定

酵素樣品原液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取上清液進行主要功效酶活力測定。

蛋白酶活力：采用福林酚法測定，參照GB/T 23527—2009。

脂肪酶活力：采用滴定法測定，參照GB/T 23535—2009。

α-淀粉酶活力：參照GB/T 24401—2009。

SOD酶活力：采用修改的Marklund方法，參照GB/T 5009.171—2003。

1.3.4 有機酸測定

1.3.4.1 有機酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

測定酵素食品中草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸的含量。按表3配制有機酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，并分別取2、10、50、75、100 μL，定容至1 mL，配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)液，用0.45 μm水相微孔濾膜過濾后，用HPLC分析獲得各種有機酸的線性方程。

表3 有機酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

1.3.4.2 樣品處理

取一定體積的酵素樣品以10 000 r/min離心10 min[13]。取上清液稀釋10倍后過0.45 μm水相微孔濾膜[13]，取5 mL濾液以1 mL/min流速流經(jīng)C18固相萃取小柱(使用前預(yù)先用5 mL甲醇活化，再用等量超純水平衡)除去色素干擾物，棄去初濾液，收集3 mL續(xù)濾液供HPLC分析，做3次重復(fù)[14-15]。

1.3.4.3 色譜條件

色譜柱：Sepax HP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：18 ℃；流動相：5%乙腈-95% 0.05 mol/L KH2PO4(用磷酸調(diào)至pH 2.5)；流速：0.6 mL/min；進樣量：10 μL；紫外檢測器波長：210 nm，得到的7種有機酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖1所示，所測的7種有機酸的相關(guān)系數(shù)均大于0.990(表4)。

1-草酸；2-酒石酸；3-蘋果酸；4-乳酸；5-乙酸；6-檸檬酸；7-琥珀酸圖1 7種有機酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜分離圖Fig.1 The standard map of 7standard organic acid

有機酸線性范圍/(mg·mL-1)線性方程相關(guān)系數(shù)R2草酸0.025～0.250y=1.0×107x+649090.9997酒石酸0.250～2.500y=2.0×106x+310980.9994蘋果酸0.150～1.500y=916346x+218280.9978乳酸0.250～2.500y=651568x+158680.9960乙酸0.300～3.000y=544790x+121690.9994檸檬酸0.150～1.50y=1.0×106x+145040.9992琥珀酸0.150～1.500y=670041x+3598.10.9987

2 結(jié)果與分析

2.1酵素微生物指標(biāo)分析

取發(fā)酵中不同原料酵素樣品1～23號進行酵母菌、乳酸菌及醋酸菌計數(shù)。由表1及表5可知，樣品1～11主要原料為蔬菜，多數(shù)樣品中含有極少的乳酸菌；12～13主要原料為水果，微生物以酵母菌為主；14～20主要原料為藥用植物，樣品中含有較多的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌；21～23為蔬菜、水果、藥用植物兩兩混合發(fā)酵樣品，均含有一定數(shù)量的酵母菌和醋酸菌，樣品間乳酸菌數(shù)量差異較大。除樣品1、8、14外均含有一定數(shù)量的酵母菌，大部分樣品含有乳酸菌和醋酸菌。樣品5、7、13的發(fā)酵體系中微生物以酵母菌為主，基本無乳酸菌、醋酸菌。樣品1、2、9的主要原料均為西胡瓜、黃瓜、萵筍，醋酸菌為該發(fā)酵體系中的主要微生物。微生物組成以酵母菌為主可能會使產(chǎn)品中乙醇含量過高、酸度過低，影響產(chǎn)品風(fēng)味且存在一定安全隱患。樣品15、18、19為發(fā)酵時間不同的趕黃草酵素，可以看出在發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)、乳酸菌數(shù)和醋酸菌數(shù)的數(shù)量級發(fā)生變化，3者間此消彼長。

表5 發(fā)酵期酵素中酵母菌、乳酸菌和醋酸菌數(shù)

2.2市售酵素總酸及可溶性固形物含量情況

測定4種市售酵素樣品的總酸和可溶性固形物含量，結(jié)果見表6。樣品D的總酸含量最高，為37.15 g/kg；樣品C的總酸含量最低，僅為6.78 g/kg。樣品C的可溶性固形物含量最高，為58.0%，而樣品B的可溶性固形物含量僅為4.8%?？扇苄怨绦挝锓从沉藰悠分心苋苡谒幕衔锏目偡Q，包括可溶性糖類和可溶性蛋白質(zhì)等。樣品B可溶性固形物含量較低可能是由于發(fā)酵原料單一，且與原料本身及加糖量有關(guān)。

表6 市售酵素的總酸及可溶性固形物含量

2.3市售酵素微生物指標(biāo)

市售酵素微生物檢測結(jié)果見表7。樣品A菌落總數(shù)、酵母菌數(shù)較多，分別為1.5×103CFU/mL和4.5×105CFU/mL。樣品D菌落總數(shù)和酵母菌數(shù)均小于1。4個樣品均無霉菌、大腸菌群檢出。若以GB 7101—2015《飲料》中規(guī)定的微生物限量為衡量標(biāo)準(zhǔn)，僅樣品D的微生物指標(biāo)合格。

表7 市售酵素微生物檢測結(jié)果

2.4市售酵素主要功效酶活性情況

對市售酵素樣品A、B、C、D蛋白酶活力、脂肪酶活力、α-淀粉酶活力及SOD酶活力進行測定。結(jié)果見表8，樣品A、B、C、D的蛋白酶活力分別為8、1、1、3 U/mL。結(jié)果表明，這4種酵素具有一定的蛋白酶活性，但活力較低。樣品C的脂肪酶酶活力為2 U/mL，其余3種樣品均無脂肪酶活力。4種樣品均無α-淀粉酶活力。樣品D的酶活力為41.7 U/mL，其余樣品無SOD酶活力。表明樣品D具有一定清除自由基的能力。

表8 市售酵素功效酶活力

注：“-”表示無相應(yīng)酶活力。

2.5市售酵素有機酸組成

由表9可知，不同原料的酵素中有機酸的組成和含量差異較大，但4種酵素樣品中均含有草酸、蘋果酸、乳酸和乙酸。樣品A有機酸以草酸、蘋果酸、乳酸和乙酸為主，樣品B有機酸以蘋果酸、乳酸和乙酸為主，樣品C以草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸和檸檬酸為主，樣品D中則含有所檢測的7種有機酸。有機酸種類與含量的差異可能與原料、發(fā)酵方式、發(fā)酵環(huán)境、微生物組成等多種因素有關(guān)。由產(chǎn)品標(biāo)簽可知，樣品A、B分別由單一蔬菜、藥材自然發(fā)酵而成；樣品C由52種蔬果及食用菌經(jīng)自然發(fā)酵而成，樣品D以24種綜合草本蔬果為原料，采用多種乳酸菌為菌種發(fā)酵而成。

表9 四種酵素樣品中有機酸的含量

注：-表示未檢出。

3 討論與結(jié)論

本文對自然發(fā)酵酵素中的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌數(shù)量進行了檢測，發(fā)現(xiàn)多數(shù)樣品中均存在該三類微生物，但數(shù)量存在差異。說明酵素自然發(fā)酵過程中廣泛存在酵母菌、乳酸菌和醋酸菌，結(jié)果與陳英等[16]一致，它們的存在對風(fēng)味物質(zhì)的形成有促進作用[17]。而樣品中酵母菌、乳酸菌和醋酸菌數(shù)量上的差異則與原料表面攜帶的微生物及樣品發(fā)酵環(huán)境有關(guān)。

本文對4種市售酵素中的有機酸進行了分析，不同樣品中有機酸的種類與含量不同，但均含有草酸、蘋果酸、乳酸和乙酸，其中樣品D的有機酸種類最為豐富。酵素中有機酸的形成除與原料有關(guān)外，主要來源于微生物以及各物質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化。乳酸的生成可能是由于發(fā)酵體系中乳酸菌的存在。在蘋果酸-乳酸發(fā)酵(MLF)[18-19]作用下，乳酸菌能將蘋果酸轉(zhuǎn)化成為乳酸和CO2。研究表明，乙酸的生成源于乳酸氧化而不是乳酸菌的糖代謝(乳酸氧化生成乙酸)[20]。大多數(shù)酵母菌可以利用高濃度的蘋果酸[21]。

與火龍果酵素[22]及核桃青皮果蔬酵素[23]相比，A、B、C、D四個樣品中主要功效酶活性均偏低。可能是由于某些酵素產(chǎn)品在殺菌過程中采用高溫，致使酶失去活性，對于要求無菌的酵素產(chǎn)品可以更改殺菌方式，如采用超濾除菌[23]、巴氏滅菌[24]等方式。另一方面，原料種類及比例對酶活性也有一定影響，可以對配方進行優(yōu)化以達到提高酶活性的目的。劉敏等[25]研究發(fā)現(xiàn)，不同配方發(fā)酵的酵素產(chǎn)品中的蛋白酶活力、纖維素酶活力、脂肪酶活力、總酸含量、ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力不同。楊靖娟等[26]利用D-最優(yōu)混料設(shè)計試驗法研究了配方中各原料不同組合對酵素酶活及活性成分含量等主要品質(zhì)指標(biāo)的影響，在最優(yōu)配方組合基礎(chǔ)下得到的酵素產(chǎn)品蛋白酶活力為293.04 U/g，SOD酶活力為57.00 U/g。

從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，選擇的4種市售酵素功效酶含量并不高，與產(chǎn)品宣傳不符。酵素產(chǎn)品的保健功效還需要經(jīng)過更全面、更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑u價。目前，國內(nèi)還沒有酵素的明確歸類及相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，缺乏審查細則，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，無法規(guī)范管理酵素市場，難以保證產(chǎn)品質(zhì)量。若按《GB/T 10789—2015飲料通則》對液體酵素產(chǎn)品進行分類，以水果、蔬菜為原料的產(chǎn)品可歸為發(fā)酵果蔬汁飲料(按照GB/T 31121—2014執(zhí)行)，以食用菌為原料的產(chǎn)品可歸為植物飲料(按照GB/T 31326—2014執(zhí)行)，實際生產(chǎn)中產(chǎn)品原料多結(jié)合了果蔬、食用菌、藥食源中草藥，且聲稱具有特定保健功能，因此也可歸為其他類飲料。不同的分類導(dǎo)致酵素難以有統(tǒng)一的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，酵素產(chǎn)品的歸類和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)將直接影響酵素產(chǎn)品的理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)和功效評價。在標(biāo)準(zhǔn)制定時應(yīng)根據(jù)酵素產(chǎn)品的具體類別明確可溶性固形物含量等理化指標(biāo)；酵素產(chǎn)品作為以果蔬、食用菌等為基礎(chǔ)的發(fā)酵產(chǎn)品應(yīng)有更細化的分類，如活菌型與非活菌型，又或者根據(jù)原料的不同進行劃分；由于目前其功效還未得到充分證實，更傾向于將其歸為飲料，在之后的研究中需要對其宣傳功效進行系統(tǒng)的驗證。本文研究結(jié)果為了解酵素產(chǎn)品品質(zhì)，正確看待酵素產(chǎn)品，促進酵素行業(yè)健康發(fā)展提供了參考。

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Analysisonmicroorganismindex,mainenzymesandorganicacidsofleavenfood

ZHANG Meng-mei1,LIU fang1,HU Kai-di1,HU Lu1, LIU Jin-xia1,ZHANG Mei-jia1,LIU Shu-liang1,2*

1(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China) 2(Institute of Food Processing and Safety,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

In order to understand the microorganism compositions of natural fermentation leaven food with different raw materials, and evaluate the physical-chemical index, microorganism index, main enzyme activity and organic acids components, the amount of yeast, lactic acid bacteria and acetic acid bacteria was detected. In this paper, the content of total acid and soluble solid, and the microorganism index of commercially available leaven food were detected. At the same time, the activity of protease, lipase, α-amylase and superoxide dismutase was determined, the organic acids was analyzed with high performance liquid chromatography. Results showed that there were yeast, lactic acid bacteria and acetic acid bacteria in leaven in the fermentation period. The activity of main enzymes of the commercially available leaven food was low. The main organic acids of commercially available leaven food were oxalic acid, malic acid, lactic acid and acetic acid. In conclusion, the quality of commercially available leaven food was not uniform. And the low enzyme activity was incompatible with the propaganda. This work could provide data reference for obtaining a correct view of leaven food and comprehending the leaven food quality.

leaven food; microorganism; enzyme activity; organic acids

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014137

碩士研究生(劉書亮教授為通訊作者，E-mail：lsliang999@163.com)。

四川省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(編號：14NZ0012)

2017-02-24，改回日期：2017-03-27