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        示蹤劑技術(shù)用于廢棄食用油脂快速檢測與鑒別

        2017-11-03 16:25:10金玲王鑫黃春燕梁恒興萬渝平吳文林
        食品研究與開發(fā) 2017年21期
        關(guān)鍵詞:示蹤劑羅丹明食用油

        金玲,王鑫,黃春燕,*,梁恒興,萬渝平,吳文林

        (1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,四川成都611137;2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院,四川成都610045)

        示蹤劑技術(shù)用于廢棄食用油脂快速檢測與鑒別

        金玲1,2,王鑫2,黃春燕2,*,梁恒興2,萬渝平2,吳文林2

        (1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,四川成都611137;2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院,四川成都610045)

        建立熒光分光光度法和高效液相色譜-熒光檢測法快速測定廢棄食用油脂中示蹤劑羅丹明B的方法。將添加了示蹤劑羅丹明B的油樣用無水乙醇提取后,分別采用熒光分光光度計(jì)和高效液相色譜-熒光檢測器進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,采用兩種方法檢測時,羅丹明B在0.5 μg/L~30 μg/L濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系;檢出限均為1 μg/kg;在10、50、100 μg/kg添加水平時,均能有效測定出示蹤劑含量,兩種方法均適用于食用油中非法添加廢棄食用油脂的確證。本研究建立的基于示蹤技術(shù)的廢棄食用油脂快速檢測手段和方法,可有效防止廢棄食用油脂回流餐桌,確保我國食用油的安全使用,同時也為廢棄食用油脂的監(jiān)管提供新的思路與依據(jù)。

        廢棄食用油脂;示蹤劑;羅丹明B;熒光分光光度法;液相色譜-熒光檢測法

        隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和居民生活水平的提高,食用油的消費(fèi)量迅速增加。與此相應(yīng)的,廢棄食用油脂(又稱地溝油、老油、潲水油)產(chǎn)生量也迅速增長。據(jù)統(tǒng)計(jì),全國每年產(chǎn)生的廢棄食用油脂至少有200萬噸~500萬噸。

        食用油在反復(fù)煎炸后,營養(yǎng)成分大大降低,可能誘發(fā)多種疾病,甚至致癌[1]。因此,國家規(guī)定廢棄食用油脂嚴(yán)禁在食品中使用。由于國外飲食習(xí)慣不同,加之較完善的法律系統(tǒng),鮮有“地溝油”事件發(fā)生,因而主要針對廢棄食用油脂生物利用方面進(jìn)行研究[2-4],而國內(nèi),由于法律監(jiān)管力度較低,盡管《食品安全法》中明確規(guī)定“禁止生產(chǎn)經(jīng)營用回收食品作為原料生產(chǎn)的食品”以及2010年國務(wù)院辦公廳發(fā)布《關(guān)于加強(qiáng)地溝油整治和餐廚廢棄物管理的意見》(國辦發(fā) [2010]36號,意見要求)嚴(yán)厲打擊非法生產(chǎn)銷售“地溝油”行為,但廢棄食用油脂成本低廉,監(jiān)管復(fù)雜,使得一心想獲取暴利的不法商家有機(jī)可乘,導(dǎo)致廢棄食用油脂回流餐桌、流入食品生產(chǎn)中的現(xiàn)象屢禁不止。因此,如何保證精煉后的產(chǎn)品不再回流到食品生產(chǎn)和加工各環(huán)節(jié),是目前的當(dāng)務(wù)之急。

        2011年12月,衛(wèi)生部初步確定了4個儀器法和3個可現(xiàn)場使用的快速檢測地溝油的方法,然而這些方法特異性不強(qiáng),均不能作為“地溝油”判定手段。目前,廢棄食用油脂的相關(guān)研究主要集中在依靠其自身成分和理化性質(zhì)的檢測方法研究方面,如采用電導(dǎo)率檢測[5-6]、過氧化值測定[7]、酸價值測定[8]、膽固醇含量測定[9]、特征脂肪酸鑒別[10]等。同樣,我國現(xiàn)行的國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2716-2005)中,關(guān)于食用油的理化性質(zhì)指標(biāo)檢測也僅僅包括酸價、過氧化值、浸出油溶劑殘留、游離酚(棉籽油)、總砷、鉛、黃曲霉毒素、苯并芘、農(nóng)藥殘留9項(xiàng)指標(biāo)。這些方法在一定程度上可以用于廢棄食用油脂的部分檢測,但是均存在一些缺點(diǎn)。由于經(jīng)特殊加工處理后的廢棄食用油脂與純凈合格食用油感官和性狀上并無差別,而且主要是以一定比例摻入食用植物油的形式出售,常規(guī)檢測方法難以鑒別,導(dǎo)致廢棄食用油脂監(jiān)管難度大,無法從根本上解決問題[11]。近些年來,近紅外光譜[12-13]、傅里葉變換紅外光譜[14-15]和拉曼光譜[16-17]的快速鑒別取得一些成效,先進(jìn)的大型儀器設(shè)備也運(yùn)用到這項(xiàng)工作中[18-19],但絕大部分方法僅僅是將食用植物油與廢棄食用油脂區(qū)分開,且存在誤判的可能性;其次,通過這些方法并不能準(zhǔn)確判斷摻入廢棄食用油脂的比例,絕大多數(shù)方法使用的設(shè)備昂貴,操作步驟復(fù)雜,因此到目前為止,國內(nèi)還沒有公布有效的檢測廢棄食用油脂的方法。

        示蹤技術(shù)始于上世紀(jì)50年代,是指利用放射性或非放射性標(biāo)記物在體內(nèi)或體外跟蹤其行徑、轉(zhuǎn)變和代謝等過程的技術(shù)[20],具有靈敏度高、測量方法簡單、成本低、可準(zhǔn)確定位等特點(diǎn),因此廣泛應(yīng)用于油田開發(fā)[21]、水文地質(zhì)工程[22]、生物醫(yī)學(xué)[23-24]等領(lǐng)域。常見的示蹤劑有化學(xué)示蹤劑、同位素示蹤劑、酶標(biāo)示蹤劑等。本實(shí)驗(yàn)所用的示蹤劑為羅丹明B(Rhodamine B),又名玫瑰紅B、堿性玫瑰精,是一種典型的化學(xué)示蹤劑,也是一種常見的工業(yè)染料和化學(xué)分析試劑[25],具有摩爾吸光系數(shù)高、光穩(wěn)定性好、波長范圍寬以及量子產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、熒光標(biāo)記、熒光探針等方面[26]。

        目前尚沒有將示蹤劑技術(shù)應(yīng)用于廢棄食用油脂追蹤、鑒別的文獻(xiàn)報道。本試驗(yàn)擬將示蹤技術(shù)引入食用油中非法添加廢棄食用油脂的鑒別研究,并與中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2430-2010[27]《進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測方法》進(jìn)行對比,建立靈敏、簡便、快速的檢測方法,為食品監(jiān)管部門對廢棄食用油脂的安全監(jiān)管提供支撐,保障我國食用油的安全使用。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        20組食用油樣品:超市,2組廢棄食用油脂:四川金德意飼料油脂有限公司。樣品詳細(xì)信息見表1。

        表1 樣品來源Table 1 Origins of sample

        羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品、甲酸(色譜純):美國Sigma公司;乙腈、甲醇(色譜純):德國Merck公司;無水乙醇(分析純):天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Ultimate 3000高效液相色譜儀(配熒光檢測器):美國Thermo Fisher公司;RF-5301PC熒光分光光度計(jì):日本Shimadzu公司;VORTEX 3旋渦混勻器:德國IKA公司;TGL-16M臺式離心機(jī):湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;KQ2200DV超聲波清洗器:昆山超聲儀器有限公司;Milli-Q純水儀:美國Millipore公司。

        1.3 方法

        1.3.1 示蹤劑的添加

        為避免不同油樣對羅丹明B提取的影響差異,現(xiàn)將羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液按10、50、100 μg/kg添加水平分別加入到22種樣品中(n=6)。

        1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

        精密稱取羅丹明B適量,用甲醇溶解,得到濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。再分別準(zhǔn)確量取貯備液適量,用甲醇稀釋成 0.5、1、5、10、20、30 μg/L 6 個水平濃度,于4℃冰箱保存待用。

        1.3.3 樣品的制備

        準(zhǔn)確稱取5.0 g食用油樣品于50 mL離心管中,加入25 mL無水乙醇,渦旋混勻,超聲15 min,5 000 r/min離心5 min,收集上清液。過0.22 μm有機(jī)濾膜,濾液分別供熒光分光光度計(jì)和高效液相色譜-熒光檢測器測定。

        1.3.4 熒光分光光度計(jì)測定方法

        在激發(fā)波長(Ex)550 nm,發(fā)射波長(Em)580 nm的條件下,測定羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的熒光強(qiáng)度,以熒光強(qiáng)度對相應(yīng)的濃度作圖,繪制工作曲線,然后在相同條件下測定樣品中羅丹明B的熒光強(qiáng)度,再用回歸方程求得含量。

        1.3.5 液相色譜條件

        色譜柱:Agilent ZORBAX StableBond C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為甲醇乙腈溶液(甲醇∶乙腈=85∶15,體積比);梯度洗脫程序:0~8 min,60%B;8 min~12 min,60%~100%B;12 min~15 min,60%B。熒光檢測器(FLD),激發(fā)波長(Ex)550 nm,發(fā)射波長(Em)580 nm。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 羅丹明B的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

        采用熒光分光光度計(jì)對羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的激發(fā)及發(fā)射光譜進(jìn)行掃描,所得激發(fā)及發(fā)射光譜如圖1。

        圖1 羅丹明B的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜Fig.1 Excitation spectrum and Emission spectrum of Rhodamine B fluorescein

        由圖1可知,羅丹明B在乙醇溶液中最大激發(fā)波長為550 nm,最大發(fā)射波長為580 nm。

        2.2 助溶劑的選擇

        示蹤劑羅丹明B易溶于水和無水乙醇,且具有一定的脂溶性。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),向食用油中直接添加羅丹明B固體,完全不溶。因此需考察多種助溶劑,使羅丹明B完全溶解于回收油。試驗(yàn)中考察了水、甲醇、乙腈、無水乙醇、異丙醇等5種溶劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn),羅丹明B和以上5種溶劑可以完全互溶,但回收油與羅丹明B的水、甲醇、乙腈和無水乙醇溶液無法互溶。而羅丹明B的異丙醇溶液,能夠在較低比例下與回收油完全互溶。5 g油與1 mL異丙醇完全互溶,但是隨著異丙醇的逐漸加入,二者逐漸不溶。由于該方法往回收油中添加羅丹明B的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于上述比例。因此,最終決定采用異丙醇為助溶劑,將羅丹明B按一定量加入到油中。

        2.3 提取溶劑的選擇與優(yōu)化

        羅丹明B是酸堿兩性化合物,易溶于水、甲醇、乙腈和無水乙醇。試驗(yàn)中選擇了水、甲醇、無水乙醇、乙腈、乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1,體積比)作為提取溶劑。結(jié)果見圖2。

        圖2 不同溶劑對羅丹明B提取率的比較Fig.2 Comparison of the extraction efficiencies of different solvent for Rhodamine B

        由圖2可知,在上述提取溶劑中水、甲醇、無水乙醇提取率類似,乙腈提取率次之,乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1,體積比)提取率最差。考慮到高效、低毒、成本低,初步篩選出水和無水乙醇兩種提取溶劑。但水的密度較回收油高,不便于分離羅丹明B水層溶液。因此,最終采用無水乙醇作為提取溶劑。

        2.4 提取溶劑體積的優(yōu)化

        優(yōu)化提取溶劑的體積時分別選擇10、15、20、25和30 mL進(jìn)行考察,結(jié)果見圖3。

        圖3 不同提取體積條件下的提取率Fig.3 Extraction efficiency under different extraction volume

        由圖3可知,提取率隨著提取溶劑體積增大而增大,當(dāng)提取溶劑體積為25 mL時,提取率不再提高??紤]到為使羅丹明B充分提出,因此,最終選擇中間溶劑用量25 mL。

        2.5 提取時間的優(yōu)化

        在一定時間范圍內(nèi),提取效率和提取時間一般呈正相關(guān)關(guān)系。本試驗(yàn)進(jìn)行超聲提取時間的優(yōu)化時分別選擇 5、10、15、20 和 25 min 進(jìn)行考察,結(jié)果見圖 4。

        圖4 不同提取時間條件下的提取率Fig.4 Extraction efficiency under different extraction time

        由圖4可知,提取率隨著提取時間的增大而增大。當(dāng)提取時間達(dá)到15min以上時提取率幾乎達(dá)到100%。因此,確定15 min為最佳提取時間。

        2.6 流動相的選擇

        在考察流動相種類時,分別采用甲醇∶乙腈(85∶15,體積比)-水體系、甲醇 ∶乙腈(85∶15,體積比)-0.1%甲酸水作流動相對羅丹明B進(jìn)行分離分析,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇∶乙腈(85∶15,體積比)-0.1%甲酸水體系作為流動相梯度洗脫羅丹明B的峰形較好,如圖5C(以樣品1為例)。因此,最終選擇甲醇∶乙腈(85∶15,體積比)-0.1%甲酸水作流動相。

        圖5 羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品(A)、空白油樣(B)、加標(biāo)后油樣(C)的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of Rhodamine B(A),Blank sample of oil(B),Oil sample spiked with Rhodamine B(C)

        2.7 線性關(guān)系

        將“1.3.2”所配的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行熒光分光光度計(jì)檢測,以熒光強(qiáng)度(Int)對溶液濃度(X)進(jìn)行線性回歸,得到羅丹明B的標(biāo)準(zhǔn)曲線:Int=0.058 8 X+0.065 2(R2=0.999 9)。按照“1.3.5”的色譜條件,將“1.3.2”所配的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相-熒光檢測器檢測,以峰面積(Y)對溶液濃度(X)進(jìn)行線性回歸,得到羅丹明B的標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=1 494.144X+327.535(R2=0.999 9);二者結(jié)果均表明,羅丹明B在0.5 μg/L~30 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        2.8 檢出限與定量限

        對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級稀釋,按3倍信噪比計(jì)算該方法的檢出限,得出高效液相-熒光檢測法檢測時羅丹明B的檢出限為1 μg/kg;按10倍信噪比計(jì)算該方法的定量限,得出該方法中羅丹明B的定量限為2.5 μg/kg。按照 LOD=3.3δ/S 公式計(jì)算。式中 LOD:檢測限;δ:響應(yīng)值的偏差;S:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率[28]。經(jīng)計(jì)算,得出熒光分光光度法的檢出限也為1 μg/kg。

        2.9 精密度與重復(fù)性試驗(yàn)

        取5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用“1.3.4”的熒光分光光度計(jì)條件分析,連續(xù)6次測定,記錄熒光光度值Int,計(jì)算6次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%,表明儀器的精密度良好。配制加標(biāo)量為50 μg/kg的1號樣品6份,用熒光分光光度計(jì)測定并計(jì)算羅丹明B的含量,結(jié)果6份樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%,表明該方法重復(fù)性良好。

        取5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照“1.3.5”的色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行高效液相色譜-熒光檢測法分析,測得羅丹明B峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%,表明儀器的精密度良好。配制加標(biāo)量為50 μg/kg的1號樣品6份,按“1.3.3”項(xiàng)下制備供試品溶液,按照“1.3.5”的色譜條件分析,計(jì)算羅丹明B的含量,結(jié)果6份樣品羅丹明B峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%,表明該方法重復(fù)性良好。

        2.10 加樣回收試驗(yàn)

        按照“1.3.1”項(xiàng)下添加示蹤劑羅丹明B,按照“1.3.3”項(xiàng)下制備樣品,按照“1.3.4”和“1.3.5”項(xiàng)下的條件檢測,計(jì)算羅丹明B含量和加標(biāo)回收率,結(jié)果見表2。

        表2 不同添加量的樣品加標(biāo)回收率(n=6)Table 2 Recoveries in different spiked samples(n=6)

        續(xù)表2 不同添加量的樣品加標(biāo)回收率(n=6)Continue table 2 Recoveries in different spiked samples(n=6)

        3 結(jié)論

        本試驗(yàn)對20個批次的食用油和2個廢棄食用油脂進(jìn)行了示蹤劑羅丹明B添加模擬試驗(yàn),建立了用無水乙醇提取、高效液相色譜-熒光檢測器和熒光分光光度法分別測定廢棄食用油脂中示蹤劑羅丹明B的檢測方法。通過模擬添加試驗(yàn),表明該方法能夠有效地檢測食用油中添加廢棄食用油脂的情況。本試驗(yàn)選取熒光劑作為示蹤劑,較紫外檢測器靈敏度提高了3個數(shù)量級。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,表明兩種檢測方法操作簡單,靈敏度高,精密度和重復(fù)性好,結(jié)果可靠。且在油樣前處理的過程中,省去了SN/T 2430-2010進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測方法中采用GPC凈化的前處理步驟,樣品只需經(jīng)過純無水乙醇提取后離心即可進(jìn)樣檢測,前處理時間極大縮短,有機(jī)溶劑使用量也顯著減少,操作檢測更為快速。單用熒光分光光度法與用液相色譜-熒光檢測法結(jié)果基本一致,在考慮快速檢驗(yàn)的情況下,選擇熒光分光光度計(jì)測定更為高效。

        杜絕廢棄食用油脂回流餐桌,就必須從源頭上進(jìn)行監(jiān)管。判斷油樣品是否是廢棄食用油脂,就目前已有的研究方法而言,所測指標(biāo)種類較多,測定項(xiàng)目繁雜,設(shè)備昂貴,操作復(fù)雜,真陽性率結(jié)果較低。本試驗(yàn)僅需對加入廢棄食用油脂中的示蹤劑進(jìn)行檢測與追蹤,“以一替多”地避免了檢測項(xiàng)目的耗時、耗力、耗材,使得檢測方法具備特異性。示蹤劑的加入,如同給廢棄食用油脂制定了特殊身份,一旦純凈的食用油樣中檢測出該物質(zhì),即可追蹤此油的來源,這將顯著提高了我國食用油中非法添加廢棄食用油脂的監(jiān)測力度,有利于食品安全保障工作的開展。本課題組將繼續(xù)篩選多種示蹤劑種類,并以不同的排列組合方式或添加方式定點(diǎn)用于固定生產(chǎn)企業(yè),建立廠家的編碼身份認(rèn)證,通過特異性測定來實(shí)現(xiàn)廢棄食用油脂的溯源。

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        [28]國家藥典委員會.中國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:9101

        Tracer Technology Used for Rapid Determination and Identification of Waste Cooking Oil

        JIN Ling1,2,WANG Xin2,HUANG Chun-yan2,*,LIANG Heng-xing2,WAN Yu-ping2,WU Wen-lin2
        (1.Pharmaceutical College,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,Sichuan,China;2.Chengdu Institute for Food and Drug Control,Chengdu 610045,Sichuan,China)

        To develop fluorescence spectrophotometry and liquid chromatography-fluorescence detector methods for quick determination of tracer agent Rhodamine B in processed products from waste cooking oil.The oil samples with tracer agent Rhodamine B were extracted with anhydrous ethanol,and then use fluorescence spectrophotometry and liquid chromatography-fluorescence detector methods to determine and analyze the processed extract respectively.The result showed that these two methods had a good linearity over the range of 0.5 μg/L-30 μg/L and the limit of quantification(LOQ)were 1 μg/kg.Beside that,the average contents detected at three spiked levels(10,50,100 μg/kg)were valid.Both methods can be applied to estimate adding condition of processed product from waste cooking oil in edible oil.This research based on the tracer technique in processed products from waste cooking oil for rapid detection means and methods,which can effectively prevent waste edible oil back to the table,ensure the safety of edible oil and provide new ideas and basis for regulation of waste cooking oil.

        processed products from waste oil;tracer agent;Rhodamine B;fluorescence spectrophotometry;liquid chromatography-fluorescence detector

        10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.024

        四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012YQ09016705);成都市科技惠民項(xiàng)目(成科計(jì)[2013]44號)

        金玲(1993—),女(漢),碩士研究生,研究方向:藥物分析。

        *通信作者:黃春燕(1981—),女(漢),助理研究員,碩士,研究方向:藥物分析。

        2017-08-23

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