張英潔，王曉，鄭秀花，于金倩，劉峰，*

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟南250014；2.山東省分析測試中心山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東濟南250014）

高速逆流色譜分離鐵皮石斛中芥子酸的研究

張英潔1，2，王曉1，鄭秀花1，于金倩1，劉峰1，*

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟南250014；2.山東省分析測試中心山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東濟南250014）

運用高速逆流色譜技術(shù)從鐵皮石斛中分離制備出芥子酸，為石斛屬內(nèi)首次分離得到。分離采用的溶劑體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶6∶3∶7，體積比），上相做固定相，下相做流動相，流速2 mL/min，轉(zhuǎn)速800 r/min，檢測波長280 nm。單次進樣石斛提取物200 mg，分離出純度為93.11%的芥子酸20.34 mg，固定相保留率46.67%。體外抗氧化結(jié)果顯示，芥子酸有較強的DPPH自由基清除能力，IC50為0.046 mg/mL。

鐵皮石斛；高速逆流色譜；芥子酸；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼

鐵皮石斛（Derdrobium officinale Kimura et Migo），蘭科（Orchidaceae），石斛屬，多年生附生草本植物，表皮為鐵綠色，故稱為鐵皮石斛[1]。鐵皮石斛是一味寶貴的中草藥，《道藏》中將其列為“九大仙草”之首[2]，在民間被稱為“救命仙草”。鐵皮石斛性味甘，微寒；歸胃、腎經(jīng)；具有益胃生津、潤肺止咳、滋陰清熱的功效[3]。鐵皮石斛的鮮莖可以直接食用，用于燉湯、泡茶、浸酒[4]等，通常加工成干品，如鐵皮楓斗、鐵皮石斛功能性飲料[5]等。因此鐵皮石斛具有寶貴的醫(yī)學(xué)價值，研究前景尤其樂觀，具有很好的療效以及保健功能。新的藥理研究表明，鐵皮石斛可用于治療慢性萎縮性胃炎、高血壓、糖尿病等疾病，具有抗腫瘤、抗衰老和增強免疫力的作用[6]。目前，國內(nèi)外對于運用高速逆流色譜技術(shù)對鐵皮石斛進行系統(tǒng)分離這一部分還是空白，所以快速建立鐵皮石斛小分子化合物的系統(tǒng)分離技術(shù)至關(guān)重要，具有很好的創(chuàng)新性和可行性。

高速逆流色譜（High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC）運用了一種特殊的流體動力學(xué)現(xiàn)象[7]，不需要固態(tài)支撐體或載體的液液分配色譜，是一種能實現(xiàn)連續(xù)有效的分配功能的實用新型分離技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各種天然產(chǎn)物的分離純化，例如采用溶劑系統(tǒng)石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5∶5∶4.8∶5，體積比）分離純化九里香中的黃酮類化合物[8]；溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（9∶1∶5∶5，體積比）分離制備出山芝麻中的三萜類成分[9]；連續(xù)運用正丁醇-乙酸乙酯-0.5%乙酸（3∶1∶4，體積比）和0.2%三氟乙酸-正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈（6∶5∶2∶1，體積比）的溶劑體系分離得到紫甘薯的花色苷單體[10]等。本研究首次應(yīng)用HSCCC技術(shù)從鐵皮石斛制備出芥子酸，并對其DPPH自由基消除能力進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛由大連普瑞康生物技術(shù)有限公司提供；制備及分離用溶劑均為分析純；石油醚（90℃～120℃）、乙酸乙酯和正丁醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；乙腈為色譜純：美國天地公司；DPPH：日本W(wǎng)ako公司；實驗用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；SB-5200D超聲波清洗機：寧新芝生物科技股份有限公司；TH-Ⅱ型薄層加熱器：上海科哲生化科技有限公司；8823B型紫外檢測儀：北京賓達英創(chuàng)科技有限公司；Agilent 1120高效液相色譜儀、1100 Series 6320 iontrap電噴霧離子阱質(zhì)譜儀：美國Agilent公司；Varian INOVA-600核磁共振波譜儀：美國Varian公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取鐵皮石斛粉末50 g置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入500 mL工業(yè)乙醇（1∶10，體積比），水浴鍋100℃沸水浴加熱回流2 h，待冷卻至室溫后，抽濾，收集濾液，濾渣重提兩次，合并3次濾液，減壓濃縮至500 mL，用乙酸乙酯萃取，放掉下層水相，收集上層乙酸乙酯相，重復(fù)操作，直至上層乙酸乙酯相無色為止，將萃取液合并后減壓濃縮至干，得到鐵皮石斛的粗提物。

1.3.2 HSCCC溶劑體系的選擇

通過試驗分析比較不同比例高速逆流色譜的分配系數(shù)，確定高速逆流色譜最佳的溶劑體系是石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶6∶3∶7，體積比），準(zhǔn)確量取石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水，按比例置于分液漏斗中，充分振蕩混勻后靜置分層，分別收集上下相，上層做固定相，下層做流動相，超聲脫氣10 min，備用。

1.3.3 HSCCC的分離過程

將上層固定相以12 mL/min的流速注滿高速逆流色譜儀的螺旋管，轉(zhuǎn)速為800 r/min，待其注滿后，下層流動相以2 mL/min流速泵入，開啟檢測器和記錄儀，檢測波長為280 nm，當(dāng)主機出口流出流動相時，且螺旋柱內(nèi)固定相和流動相達到動力學(xué)平衡狀態(tài)固定相和流動相平衡后，將溶于固定相和流動相同比例的混合液中的樣品注入進樣圈，同時根據(jù)色譜圖收集各色譜峰組分，并取各組分做HPLC分析。

1.3.4 HPLC分析及結(jié)構(gòu)鑒定

鐵皮石斛高速逆流色譜分離各組分通過高效液相色譜法分析。HPLC檢測條件：色譜柱YMC-PackODSA-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），檢測器 UV 280 nm，流動相乙腈-0.2%甲酸水，流速1 mL/min，進量20 μL。HSCCC各峰組分的結(jié)構(gòu)根據(jù)ESI-MS-MS，NMR數(shù)據(jù)進行鑒定。

1.3.5 DPPH·的清除作用

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法常用于評價化合物或植物提取物的抗氧化活性[11]。DPPH·溶于乙醇溶液呈紫色，是一種穩(wěn)定的自由基，在517 nm處具有最大吸收峰[12]，當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑后，溶液顏色會變淺，517 nm處的吸光值變小，通過加入不同濃度的分離物反應(yīng)后測定吸光度值的變化情況，得出試驗數(shù)據(jù)，判斷自由基的清除情況，進而對其抗氧化能力作出評價[13]。DPPH自由基清除計算公式為：

DPPH 自由基清除率/%=（A對照－A樣品）/A對照×100

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛粗提物初步分離

準(zhǔn)確稱取10 g鐵皮石斛粗提物和5 g硅膠（100目～200目），拌樣，再準(zhǔn)確稱取 50 g硅膠（200目～300目）倒入石油醚∶乙酸乙酯=4∶1（體積比）的溶劑中，攪拌均勻后倒入分離柱，待柱面水平后靜置平衡8 h，然后加入用硅膠（100目～200目）拌好的粗樣，按梯度采用不同比例配制的石油醚∶乙酸乙酯（體積比）=4∶1，3 ∶1，2∶1，1∶1 的溶劑分別進行洗脫，收集洗脫液，硅膠層析檢測。根據(jù)硅膠層析結(jié)果，收集石油醚∶乙酸乙酯（體積比）=3∶1的洗脫部分，減壓濃縮至干，留用。

2.2 HSCCC分離條件優(yōu)化

中分配系數(shù)的測定方法，從溶劑系統(tǒng)中上下相各取等量置于試管中，加入適量鐵皮石斛粗提物樣品，振蕩混勻，靜置分層后，在硅膠薄層板點等量樣品，用石油醚-乙酸乙酯（3∶2，體積比）的展開劑展開，觀察樣品中各組分的相對含量以及在兩相溶劑中的分配情況，計算K值。分配系數(shù)K=Cs/Cm，式中：Cs指溶質(zhì)在固定相中濃度；Cm指溶質(zhì)在流動相中濃度。

通過試驗計算不同高速逆流色譜的K值，見表1，分析比較選擇出最佳溶劑體系。

表1 不同比例溶劑系統(tǒng)的分配系數(shù)Table 1 Partition coefficient（K）of compounds in different solvent systems

由表1可得，溶劑系統(tǒng)乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水（4∶1∶0.2∶5，體積比）分配系數(shù)過大，分離需要耗費很長時間才能把化合物洗脫出來，洗脫效果很不理想，如圖1（A）所示，改用嘗試溶劑系統(tǒng)石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶6∶3.5∶6.5，體積比），初步達到分離效果如圖1（B）所示，改良方法，稍微降低甲醇含量，采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶6∶3∶7，體積比）的溶劑系統(tǒng)，分配系數(shù)大小適合分離，保留率較高，分離效果最佳，見圖1（C），故可以確定選擇石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶6∶3∶7，體積比）作為HSCCC的溶劑系統(tǒng)。以上相做固定相，流速2 mL/min，轉(zhuǎn)速800 r/min，檢測波長為280 nm，上相保留率為46.67%。單次進樣200 mg，可分離出純度為93.11%的芥子酸20.34 mg。

圖1 鐵皮石斛高速逆流色譜分離圖Fig.1 High-speed countercurrent chromatography（HSCCC）separation of extract from Derdrobium officinale

2.3 HPLC分析

試驗中分別考察了甲醇-水，乙腈-水和乙腈-0.2%甲酸溶液等作為HPLC流動相時，鐵皮石斛中各組分的分離效果見圖2。

圖2 高速逆流色譜分離化合物液相分析圖Fig.2 The HPLC analysis diagram of HSCCC

結(jié)果表明：當(dāng)采用乙腈-0.2%甲酸溶液進行梯度洗脫時，流動相的流速為1 mL/min，在280 nm下檢測可以得到良好的分離效果，純度為93.11%。

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

ESI-MS-MS：測定分子量為224，淡黃色粉末，熔點181℃～183℃。UV λ max（MeOH）：283 nm。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.511（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），6.978（2H，s，H-2，6），6.436（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），3.801（6H，s，3，5-OMe）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：168.54（C-9），148.50（C-3，5），145.11（C-7），138.48（C-4），125.12（C-1），116.73（C-8），106.46（C-2，6），56.54（3，5-OMe）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，參照文獻中芥子酸[12]的相關(guān)數(shù)據(jù)，與其符合，得以確定該化合物為芥子酸。

2.5 對DPPH·的清除作用

對DPPH·的清除作用見圖3。

圖3 對DPPH·的清除作用Fig.3 Scavenging effects of sinapic acid on DPPH assay

由圖3可以看出，芥子酸對DPPH·有較好的清除作用，在濃度為0.01 mg/mL～0.2 mg/mL的時候，清除率隨著濃度的增加而增加，芥子酸濃度在0.2 mg/mL時，對DPPH·的清除率高達88.51%。經(jīng)計算得芥子酸清除 DPPH·的IC50為 0.046 mg/mL，而 VC的 IC50為0.002 6 mg/mL，芥子酸對DPPH·的清除率相對于VC較低。

3 結(jié)論

本試驗通過優(yōu)化條件運用高速逆流色譜技術(shù)分離制備出鐵皮石斛中的芥子酸，采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶6∶3∶7，體積比）的溶劑體系為，上相做固定相，流速為2 mL/min，轉(zhuǎn)速為800 r/min，檢測波長為280 nm，保留率為46.67%。單次進樣量200 mg，分離出芥子酸20.34 mg，純度為93.11%。通過試驗測定芥子酸對DPPH自由基有較好的的清除作用，IC50為0.046 mg/mL，可以為將來天然氧化劑[15]的開發(fā)提供參考依據(jù)。

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Study on Sinapic Acid from Derdrobium officinale by High-Speed Countercurrent Chromatography

ZHANG Ying-jie1，2，WANG Xiao1，ZHENG Xiu-hua1，YU Jin-qian1，LIU Feng1，*
（1.College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan 250014，Shandong，China；2.Shandong Key Laboratory of Quality Control of Chinese Medicine，Shandong Analysis and Test Center，Jinan 250014，Shandong，China）

Sinapic acid was separated and purified from Derdrobium officinale by high-speed countercurrent chromatography，which was isolated for the first time from Dendrobium.Ether-ethyl acetate-methanol-water（4∶6∶3∶7，volume ratio）was used as the two-phase solvent system，in which the upper and lower phase were used as the stationary and mobile phase，respectively.The flow rate was set at 2 mL/min，and the revolution speed was 800 r/min.The detection wavelength was 280 nm and the retention of stationary phase was 46.67%.Finally，20.34 mg of sinapic acid with a purity of 93.11%was obtained in a one-step separation from 200 mg of crude extracts.The results showed that sinapic acid had a strong DPPH radical scavenging ability in vitro and the IC50was 0.046 mg/mL.

Derdrobium officinale；high-speed countercurrent chromatography；sinapic acid；1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.005

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（2014AA022201-05）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2014YL005）

張英潔（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物分離純化。

*通信作者：劉峰（1981—），男，副研究員，博士，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。

2017-02-21