黃 剛，胡 凡，柴 文，文 安，劉詩英，吳曉牧

(江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內科，南昌 330006)

超濾濃縮腦脊液ESAT-6對結核性腦膜炎的診斷價值

黃 剛，胡 凡，柴 文，文 安，劉詩英，吳曉牧

(江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內科，南昌 330006)

目的探討離心超濾技術濃縮腦脊液檢查結核桿菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)在診斷結核性腦膜炎(TBM)中的價值。方法選取TBM患者40例(TBM組)和非TBM患者20例(非TBM組)，每位患者留取2份腦脊液(一份為原液，另一份為離心超濾濃縮)，使用ELlSA法檢測其ESAT-6水平。結果TBM組中濃縮ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05)，而非TBM組中濃縮ESAT-6的敏感性與原液比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論利用離心超濾濃縮技術能提高腦脊液ESAT-6檢查的敏感性，且操作簡單，可作為快速診斷TBM的參照指標。

結核性腦膜炎； 早期分泌性抗原靶蛋白-6； 超濾濃縮;免疫組織化學； 腦脊液;診斷

結核性腦膜炎(TBM)是由結核分枝桿菌感染所致的高致殘率及高致死率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，在肺外結核所占的比例逐年增加。因其臨床、癥狀體征無特異性，且腦脊液方面的檢查特異性及敏感性亦較低，使得TBM早期診斷極易被誤診及漏診。而腦脊液中的早期分泌性靶抗原-6(ESAT-6)檢查被用于診斷TBM，其無濃縮的腦脊液ESAT-6檢查特異性較高約為96.49%，而陽性率較低約為67.35%[1]，限制了其在臨床的應用。因此，本研究利用離心超濾濃縮腦脊液技術提高ESAT-6檢出的敏感性，以期達到快速診斷TBM的目的。

1 資料與方法

1.1病例資料

研究對象來自于2014—2016年江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內科住院患者，其中TBM患者40例(TBM組)：依據(jù)Marais等[2]的診斷標準確診，均為初次確診未進行抗結核治療，男20例，女20例，年齡14～72歲；非TBM患者20例(非TBM組)：男7例，女13例，年齡18～80歲，真菌性腦炎并肺結核1例，多發(fā)性硬化并肺結核1例，自身免疫性腦炎3例，單純皰疹病毒性腦炎8例，帶狀皰疹病毒性腦炎7例。

1.2方法

檢測方法：患者均在發(fā)病2周內行腰穿檢查留取2份腦脊液，每份為3 mL。其中一份腦脊液通過超濾離心管，2500 r·min-1，30 min，濃縮為100 μL。均于-80 ℃保存，采用ELISA方法檢測2份腦脊液中的ESAT-6水平，取9個質量濃度標準品(200、150、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 ng·mL)及TBM組(原液和濃縮液)、非TBM組(原液和濃縮液),各100 μL，加入反應孔,置4 ℃冰箱過夜。沖洗2次，牛血清37 ℃封閉1 h；沖洗5次，加入二抗37 ℃孵育2 h；沖洗5次，加入辣根過氧化物酶20 min顯色，然后加入100 μL終止反應的液體。按試劑盒提供的標準品為定性值，顏色較深為陽性，顏色較淡為陰性。敏感性=陽性數(shù)/總樣本量×100%。

統(tǒng)計學方法：通過統(tǒng)計軟件(SPSS16.0)對所得數(shù)據(jù)進行處理，2組比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2組原液和濃縮液ESAT-6檢測結果見表1。TBM組中濃縮ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05)，而非TBM組中濃縮ESAT-6的敏感性與原液比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。非TBM組2例陽性分別為真菌性腦炎合并肺結核、多發(fā)性硬化合并肺結核患者。

表1 2組腦脊液ESAT-6表達情況

*P<0.05，#P>0.05與同組原液比較。

3 討論

TBM是一種比較嚴重的肺外結核，占肺外結核的7%～10%[3]。其近年來發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，死亡率約為30%，致殘率約為25%[4]，診斷治療的延誤是死亡率和致殘率高的主要原因。但是現(xiàn)有的檢查手段對該病的早期診斷、早期治療仍然十分困難。目前臨床上涉及TBM診斷的檢查有腦脊液生化常規(guī)及細胞學、影像學檢查、病原學檢查、免疫學檢查等。這些檢查中：1)腦脊液生化常規(guī)及細胞學在TBM方面有特征性表現(xiàn)(如細胞學呈混合細胞反應)，但是TBM的腦脊液非常不典型，因此該檢查只能作為參考。2)頭CT或MRI在TBM診斷沒有特征性表現(xiàn)故只能作為輔助。3)病原學檢查是目前確診TBM的方法，腦脊液抗酸染色的方法檢出率較低，結核桿菌培養(yǎng)時間較長，通常要4～6周，陽性檢出率只有20%～30%[5]，不利于TBM早期診斷。4)免疫學檢查方法有兩種，第一種為干擾素-γ釋放試驗，但它不能分辨結核感染是活動期還是既往感染，故不能作為單獨診斷結核病的方法；第二種是腦脊液中的早期ESAT-6檢查目前處于實驗室研究，其特異性均在90%以上[1，6-7]。因此，檢測TBM患者腦脊液中的ESAT-6很有可能成為早期快速精準診斷TBM的方法。

ESAT-6主要是結核桿菌早期分泌的抗原，具有較好的免疫原性，因此其特異性也較高，但是腦脊液原液檢查ESAT-6不穩(wěn)定，其敏感性在67.35%～88%[1，6-7]之間，使得其臨床應用前景并不樂觀。造成ESAT-6不穩(wěn)定的原因可能為：與患者顱內結核桿菌感染的嚴重程度有一定的相關性，感染重的患者顱內結核桿菌數(shù)量較多，其分泌的ESAT-6抗原的量較大，濃度高，容易檢測到；而感染較輕的患者結核桿菌數(shù)量少，其腦脊液的ESAT-6抗原量少濃度低，檢測時容易出現(xiàn)陰性的結果。故本研究利用離心超濾的技術解決腦脊液原液中ESAT-6抗原濃度較低的缺點，濃縮TBM患者的腦脊液，提高腦脊液中ESAT-6抗原的濃度。

本研究中，TBM組選取首次確診為TBM的患者(未使用抗結核治療)40例，留取2份腦脊液(一份為原液，另一份為離心超濾濃縮)，原液檢測ESAT-6抗原發(fā)現(xiàn)有32例為陽性，8例為陰性，敏感性為80%，8例陰性患者病情都較輕；通過離心超濾濃縮腦脊液檢測ESAT-6抗原，其敏感性為100%，TBM組中濃縮ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05)。提示通過離心超濾技術能夠改善輕癥患者的假陰性的結果。另外，非TBM組中出現(xiàn)了2例腦脊液原液檢測為陰性，但是濃縮后腦脊液檢測為陽性,1例為多發(fā)性硬化合并肺結核的患者，另一例為真菌性腦膜炎合并肺結核患者，進一步檢測這2例患者血中的ESAT-6抗原亦為陽性，出現(xiàn)這種情況的原因筆者考慮：1)這2例患者患有肺結核，肺部的結核桿菌會產(chǎn)生ESAT-6抗原并釋放進入血液。2)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病破壞了患者的血腦屏障，導致血液中的ESAT-6抗原部分進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，腦脊液中的ESAT-6抗原濃度較低，導致了原液檢測為陰性，濃縮后檢測為陽性。臨床對于這類患者可通過腦脊液生化、常規(guī)、細胞學、抗酸染色及影像學等進行鑒別診斷。

總之，利用離心超濾濃縮技術能顯著提高腦脊液ESAT-6檢查的敏感性，可以作為TBM快速診斷的方法之一。由于ELISA是通過定性的方法進行判斷實驗結果，有其局限性，但是這種方法操作簡單，容易判定結果，無需特殊的實驗設備，適合在基層醫(yī)院使用。

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(責任編輯：羅芳)

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