趙唯含 史瑞 譚祥 陳晨 毛堂友 李軍祥

·論著·

益氣活血法對MNNG誘導萎縮性胃炎癌前病變大鼠hedgehog信號通路的調控作用

趙唯含 史瑞 譚祥 陳晨 毛堂友 李軍祥

目的探討益氣活血法對萎縮性胃炎癌前病變大鼠hedgehog信號通路的調控影響。方法雄性Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、黃芪組、三七組、黃芪三七組、Purmorphamine組、環(huán)巴明組及葉酸組，運用MNNG負荷多因素法制備萎縮性胃炎癌前病變模型。應用HE染色評價胃黏膜病理損傷，應用Western Blot、RT-PCR和量子點介導的免疫熒光化學法分別檢測各組大鼠胃組織hedgehog信號通路的蛋白和基因表達水平。結果與空白組相比，模型組大鼠血清PGⅠ/PGⅡ和GAS含量顯著降低(P<0.01)，Shh、Ptch基因及蛋白含量均明顯下調(P<0.05，P<0.01)，Smo蛋白表達減弱(P<0.01)。與模型組相比，三七組、黃芪三七組及Purmorphamine組PGⅠ/PGⅡ明顯升高(P<0.01)，黃芪組、三七組及黃芪三七組GAS含量顯著升高(P<0.05)。三七組、黃芪三七組及葉酸組Shh蛋白表達明顯升高(P<0.05)，三七組和Purmorphamine組Ptch蛋白表達增多(P<0.05)，黃芪組、三七組、黃芪三七組和Purmorphamine組Smo蛋白表達顯著增強(P<0.05，P<0.01)。結論益氣活血法可激活hedgehog信號通路，對萎縮性胃炎癌前病變大鼠胃黏膜病變起到改善作用。

萎縮性胃炎癌前病變； 益氣活血法； hedgehog信號通路； 黃芪； 三七

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是消化系統(tǒng)常見疾病，以胃脘部疼痛脹滿多見，世界衛(wèi)生組織在1978年提出CAG與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[1]。Correa發(fā)生模式[2]是目前普遍認可的胃癌發(fā)展模式。目前臨床上常把CAG伴腸上皮化生、上皮內瘤變稱之為慢性萎縮性胃炎癌前病變或胃癌前期病變(precancerous lesions of gastric cancer，PLGC)[3]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)：益氣活血法能有效降低胃黏膜肌層增厚，抑制腸化生，具有顯著的抗炎及胃黏膜保護作用。本實驗擬通過觀察益氣活血法對MNNG誘導的PLGC大鼠hedgehog信號通路的影響，進一步明確其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物

健康雄性Wistar大鼠80只，體重(160±20) g，SPF級，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證編號：SCXK(京)20090007,飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所SPF級動物飼養(yǎng)間，12小時光照/黑夜循環(huán)，相對恒溫(25℃)，恒濕(75%)。

1.2試劑與藥物

MNNG溶液(日本TCI公司)；無水乙醇(湖北興銀河化工有限公司)；鹽酸雷尼替丁膠囊(浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司)；PGE1酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號：SEA165Ra)，PGE2酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號：SEA166Ra)，GAS酶聯(lián)免疫試劑盒(美國abcam，批號：ab133049)。黃芪(北京同仁堂)，由北京中醫(yī)藥大學中藥學院加工成浸膏；三七粉(北京同仁堂)；Purmorphamine(上海浩然生物有限公司)；環(huán)巴明(美國Sigma)；葉酸片(天津飛鷹制藥有限公司)。

1.3實驗動物分組及給藥

PLGC大鼠采用MNNG負荷乙醇、雷尼替丁、饑飽失常法造模[4]。大鼠每日自由飲用濃度為120 μg/mL的MNNG溶液，每天灌胃濃度為0.03 g/kg的鹽酸雷尼替丁溶液。同時每周禁食1次，每次禁食16小時，禁食第二天不予雷尼替丁灌胃，代之以體積分數(shù)45%的乙醇(1 mL/只)，連續(xù)造模16周。MNNG配置時需避光，現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后裝入用黑膠布包裹的避光飲水瓶內供模型組大鼠每天自由飲用。設10只空白組，造模大鼠隨機分為模型組、黃芪組、三七組、黃芪三七組、Purmorphamine組、環(huán)巴明組、葉酸組，每組10只。黃芪組予黃芪浸膏灌胃，劑量3.5 g/(kg·d)；三七組予三七粉沖劑灌胃，劑量0.7 g/(kg·d)；黃芪三七組予黃芪三七溶液灌胃，其中黃芪3.5 g/(kg·d)、三七0.7 g/(kg·d)；Purmorphamine組予Purmorphamine水溶液灌胃，劑量1.6 mg/(kg·d)；環(huán)巴明組予環(huán)巴明水溶液灌胃，劑量0.5 mg/(kg·d)；空白組和模型組予去離子水灌胃2 mL/天灌胃，共治療8周。

1.4標本的采集

待取材大鼠提前1天禁食水，采用10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，取到的動脈血置于離心管中室溫靜置1小時以上，常溫3000 r/min離心10分鐘，取上清，-80℃保存。取出胃組織，展開沖洗，觀察胃黏膜形態(tài)結構，胃竇部取材，部分用4%多聚甲醛固定。部分置入凍存管中，-80°保存。

1.5Elisa法檢測血清PGⅠ、PGⅡ及GAS含量

按照說明書要求雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定大鼠血清胃蛋白酶原Ⅰ(pepsinogen Ⅰ，PGⅠ)，胃蛋白酶原Ⅱ(pepsinogen Ⅱ，PGⅡ)和血清胃泌素(Gastrin，GAS)水平，并計算PGⅠ/PGⅡ比值。

1.6Western-blot檢測胃組織Shh、Ptch的蛋白表達

加入液氮，研磨組織，提取組織蛋白，蛋白定量后煮沸，上樣，凝膠電泳后轉膜，一抗稀釋，將封閉膜放入一抗中，4℃過夜；洗凈未結合的一抗，然后放入二抗中，室溫靜置2小時后曝光。蛋白圖像分析用labwork分析軟件分析灰度值。

1.7RT-PCR檢測胃組織Shh mRNA、Ptch mRNA表達

把組織放入研缽中，研磨成粉末狀，采用Trizol試劑法提取總RNA，再逆轉錄為cDNA。再將此設為模板，利用特異性引物合成PCR產物。引物序列及產物大小見表1。相對定量數(shù)據處理使用2-△△Ct法。

表1 引物序列及產物大小

1.8量子點介導的免疫熒光法檢測胃黏膜組織Smo蛋白的表達

石蠟切片脫蠟、水化、微波抗原修復、TBS洗滌,封閉緩沖液37 ℃濕盒孵育60分鐘,滴加Smo抗體,37℃孵育2小時,TBS-T漂洗5分鐘/次×3次,封閉緩沖液37 ℃濕盒孵育20分鐘,滴加QDs-SA標記的二抗,37 ℃濕盒孵育30分鐘,TBS-T漂洗5分鐘/次×3次,滴加緩沖甘油封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察,切片經BX51熒光顯微鏡及DP72相機(日本奧林巴斯光學工業(yè)有限公司)拍照。

1.9統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1各組大鼠胃黏膜組織肉眼及病理觀察

空白組大鼠胃黏膜表面顏色紅潤，結構正常，未見明顯萎縮及腸化；模型組大鼠顏色較空白組發(fā)白，部分大鼠可見糜爛及潰瘍形成，胃黏膜有明顯腸上皮化生，固有層腺體減少，排列不規(guī)則；各治療組大鼠較模型組有不同程度的改善，以Purmorphamine組為最佳。見圖1。

注：A:空白組；B：MNNG模型組；C:黃芪組；D：三七組；E：黃芪三七組；F：Purmorphamine組；G：環(huán)巴明組；H：葉酸組

圖1 各組大鼠胃組織染色觀察(×100)

2.2各組大鼠血清PGⅠ/PGⅡ及GAS水平的比較

與空白組比較，模型組大鼠血清PGⅠ/PGⅡ和GAS含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，三七組、黃芪三七組及Purmorphamine組PGⅠ/PGⅡ顯著升高(P<0.01)，GAS含量在黃芪組、三七組及黃芪三七組升高明顯(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清PGⅠ/PGⅡ及GAS水平比較

注： 與模型組比較，aP<0.05；與空白組比較，bP<0.05。

2.3各組大鼠胃組織Shh、Ptch蛋白表達的比較

與空白組相比，模型組大鼠胃組織Shh、Ptch蛋白含量顯著降低(P<0.01)，與模型組比較，三七組、黃芪三七組及葉酸組Shh、Ptch蛋白表達明顯升高(P<0.05)。三七組和Purmorphamine組Ptch蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠Shh、Ptch蛋白表達

注： 與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與空白組比較，cP<0.05，dP<0.01。

注： A:空白組；B：MNNG模型組；C:黃芪組；D：三七組；E：黃芪三七組；F：Purmorphamine組；G：環(huán)巴明組；H：葉酸組

圖2 各組大鼠胃組織Shh、Ptch的蛋白表達條帶

2.4各組大鼠胃組織Shh、Ptch基因表達的比較

與空白組比較，模型組大鼠Shh mRNA和Ptch mRNA含量顯著降低(P<0.05)，與模型組比較，三七組Shh mRNA含量顯著升高(P<0.05)，黃芪組、三七組、黃芪三七組和Purmorphamine組Ptch mRNA含量顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 對大鼠胃組織Shh mRNA及Ptch mRNA表達的影響

注： 與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與空白組比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.5各組大鼠Smo蛋白表達情況

與空白組相比較,模型組Smo蛋白表達顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，黃芪組、三七組、黃芪三七組，Purmorphamine組Smo蛋白明顯增多(P<0.05，P<0.01)，以Purmorphamine組增多最為明顯。見圖3、表5。

注： A:空白組；B：MNNG模型組；C: 黃芪組；D：三七組；E：黃芪三七組；F：Purmorphamine組；G：環(huán)巴明組；H：葉酸組

圖3 各組大鼠Smo的表達情況(×200)

注： 與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與空白組比較，cP<0.05，dP<0.01。

3 討論

慢性萎縮性胃炎癌前病變多病程較長，病情遷延難愈，臨床癥狀常見胃脘脹滿、隱痛，痛處固定不移，少氣乏力，舌質淡黯或有瘀斑，脈細澀；胃鏡下可見胃黏膜紅白相間，以白為主，黏膜下血管增生顯著，黏膜呈顆粒或結節(jié)狀。因為血管腔狹窄使局部血流變少，胃黏膜缺血缺氧，易于癌變[5]。故臨床認為本病為本虛標實證，病機為脾虛血瘀，益氣活血法為治療PLGC的主要治法。中藥黃芪和三七是益氣健脾及活血化瘀的代表藥，兩藥配伍是益氣活血法的代表[6]。

hedgehog信號通路幾乎涉及哺乳動物發(fā)育的所有過程，目前關于其與腫瘤的調控研究較為透徹，在消化系統(tǒng)疾病中，已經證實了hedgehog通路的激活是腫瘤發(fā)生的一個因素[7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)在幽門彈簧植入術誘導的萎縮性胃炎大鼠模型中，hedgehog信號通路呈抑制狀態(tài)，以黃芪、三七為代表的益氣活血法可激活hedgehog信號通路，進一步起到胃黏膜保護作用[8]。Shh作為hedgehog通路的信號肽之一，是其中表達最為廣泛，且研究最為深入的，在中樞神經發(fā)育和胚胎發(fā)育期發(fā)揮了分裂素、分化因子等作用[9]。Shiotani等[9]研究發(fā)現(xiàn)Shh在萎縮性胃炎及胃癌前病變的標本中表達較淺表性胃炎明顯下降。Shh的下游跨膜受體為Patched(Ptch)和Smoothened(Smo)。Ptch為12次跨膜蛋白，Smo為7次跨膜蛋白，結構上與G蛋白偶聯(lián)受體家族高度相似。一般情況下，Ptch和Smo結合在一起，兩者均沒有活性，當Hh蛋白被釋放后，與Ptch結合，此時Ptch將解除對Smo的抑制，Smo進而將信號向下傳導，激活下游的轉錄因子[10],引發(fā)細胞內信號下傳。

本次實驗采用MNNG負荷乙醇、雷尼替丁、饑飽失常法構建萎縮性胃炎癌前病變大鼠模型，16周后血清示PGⅠ/PGⅡ及GAS較正常組顯著降低，病理示模型組大鼠胃黏膜見不同程度的萎縮，可見明顯腸上皮化生，證明萎縮性胃炎癌前病變模型構建成功。陽性對照藥選擇了臨床常用的葉酸片，葉酸是維生素B的一種，可以促進細胞分裂，并促進蛋白質、氨基酸以及核酸的合成，與維生素B12一起促進紅細胞的成熟，在某些與炎癥相關的疾病的預防和控制中有一定的療效,可用于治療PLGC[11]。為了明確黃芪三七對CAG大鼠hedgehog通路的調控影響，另設了Purmorphamine組和環(huán)巴明組作為對照。Purmorphamine與Smo結合后可改變Smo的空間構象，繼而激活Shh通路下游分子[12]，因此purmorphamine可以作為hedgehog信號通路的特異性激活劑。環(huán)巴明(cyclopamine)是一種甾體生物堿，能通過直接結合Smo來抑制hedgehog信號通路的激活,是hedgehog信號通路的阻斷劑[13]。

本次實驗發(fā)現(xiàn)在MNNG誘導的萎縮性胃炎癌前病變模型中，hedgehog信號通路正調節(jié)因子Shh、Ptch、Smo均表達下降，說明在本模型中，hedgehog信號通路處于抑制狀態(tài)。與前期進行的CAG大鼠中hedgehog信號通路表達研究對比，PLGC對該通路的抑制作用更強，考慮這與其病理變化多為腸上皮化生及異型增生有關。有文獻報道[14]，在慢性淺表性胃炎-慢性萎縮性胃炎-癌前病變中，Shh的表達逐漸降低，這與本次實驗結論相符。本次實驗證實Purmorphamine作為激動劑可明顯改善hedgehog信號通路各因子表達，尤其對PLGC大鼠的病理損傷有較好的修復作用。同時中藥治療組中三七組和黃芪三七組對于各指標的改善具有較好的療效，證明活血法及益氣活血法對于萎縮性胃炎癌前病變效果良好，也符合中醫(yī)理論認為CAG初起在氣，久病由血及絡的病機認識。

綜上，筆者推測以中藥黃芪、三七為代表的益氣活血法能夠起到改善萎縮性胃炎癌前病變的作用，其具體機制可能為通過激活hedgehog信號通路，進一步改善胃黏膜萎縮，抑制腸上皮化生，進而起到保護胃黏膜、抑制癌變的作用。

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Regulationeffectsofinvigoratingqiandactivatingbloodtherapyonthehedgehogsignalpathwayinratswithprecancerouslesionsofatrophicgastritis

ZHAOWeihan,SHIRui,TANXiang,etal.DepartmentofGastroenterology,thehospitalofShanxiUniversityofChineseMedicine,Shanxi712000,China

Correspondingauthor:LIJunxiang,E-mail:lijunxiang1226@163.com

ObjectiveTo evaluate the effects of invigoratingqiand activating blood therapy on hedgehog signal pathway in rats with precancerous lesions of atrophic gastritis.MethodsThe model was established by MNNG, male wistar rats were randomly divided into control group, model group, Astragalus group, Panax notoginseng group, Astragalus plus Panax notoginseng group, Purmorphamine group, cyclopamine group and folic acid group. HE was used to evaluate the pathological injury of stomach. The mRNA and protein expression levels of hedgehog signal pathway were detected by RT-PCR, Western Blot analysis and immunofluorescence.ResultsCompared with the control group, GAS and PG I /PG II level were reduced in model group(P<0.01), the mRNA and protein expression levels of Shh and Ptch were obviously down-regulated (P<0.05，P<0.01); the expression of Smo protein was decreased(P<0.01). Compared with the model group, the level of PG I /PG II was increased in the Panax notoginseng group, Astragalus plus Panax notoginseng group and Purmorphamine group(P<0.01), the level of GAS was increased in the Astragalus group, Panax notoginseng group and Astragalus plus Panax notoginseng group(P<0.05). The protein of Shh was increased in the Panax notoginseng group, Astragalus plus Panax notoginseng group and folic acid group(P<0.05). The protein of Ptch was markedly up-regulated in Panax notoginseng group and Purmorphamine group(P<0.05). The expression of Smo was significantly increased in Astragalus group, Panax notoginseng group and Astragalus plus Panax notoginseng group and Purmorphamine group(P<0.05，P<0.01).ConclusionInvigoratingqiand activating blood therapy can activate hedgehog signal pathway, and can improve the gastric mucosal lesion in precancerous lesion of atrophic gastritis.

Precancerous lesions of atrophic gastritis; Invigoratingqiand activating blood therapy; Hedgehog signal pathway; Astragalus; Panax notoginseng

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.005

2017-04-04)

(本文編輯： 禹佳)

國家自然科學基金(81373585)

712000 陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院消化一科(趙唯含)；北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院消化內科[史瑞、譚祥(碩士研究生)、陳晨(碩士研究生)、毛堂友(博士研究生)、李軍祥]

趙唯含(1988- )，女，博士，講師。研究方向:中醫(yī)藥防治胃腸疾病的研究。E-mail: weihanzhaodoc@163．com

李軍祥(1964- ) ，博士，主任醫(yī)師，博士生導師。研究方向: 中醫(yī)藥防治慢性肝膽和胃腸道疾病。E-mail:lijunxiang1226@163.com