張登山 鄒靜 陳慧 彭懿 劉志輝

·論著·

應(yīng)用HPLC法對(duì)肺寧合劑多成分含量測(cè)定研究

張登山 鄒靜 陳慧 彭懿 劉志輝

目的建立高效液相色譜法同時(shí)對(duì)肺寧合劑中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素6種指標(biāo)成分的含量測(cè)定。方法采用Hedera C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液-乙腈梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫：30℃，流速：1 mL/min。結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素的質(zhì)量濃度在相應(yīng)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性范圍分別為：16.20～518.2、9.741～311.7、37.27～1193.0、14.25～455.9、30.99～991.7、1.225～39.18 μg/mL，加樣回收率分別為103.05%、95.29%、104.11%、99.78%、96.28%、105.42%。結(jié)論所建立的HPLC方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可用于肺寧合劑的質(zhì)量控制。

肺寧合劑； 鹽酸麻黃堿； 鹽酸偽麻黃堿； 苦杏仁苷； 甘草苷； 甘草酸； 白花前胡甲素

肺寧合劑是江蘇省中醫(yī)院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，是臨床使用多年的有效制劑,由麻黃、苦杏仁、甘草、前胡、桔梗、瓜蔞皮、枇杷葉七味藥組成，為中藥復(fù)方制劑，具有止咳、平喘、化痰的功效[1]。由于早期醫(yī)院中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較低，僅有少量的定性鑒別、pH、相對(duì)密度等。而中藥制劑定性定量控制的方法研究很多，如制劑中多成分的薄層定性研究，尤其是指紋圖譜、特征圖譜的研究與應(yīng)用，多成分的含量測(cè)定方法的研究與制定，提高了中藥制劑質(zhì)量控制的水平。為提高肺寧合劑醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保制劑質(zhì)量,本研究應(yīng)用高效液相法進(jìn)行了肺寧合劑多成分含量測(cè)定方法研究，以建立其多成分含量測(cè)定的方法與標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1 儀器及試藥

1.1儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀：G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1316A柱溫箱，G1314A VWD檢測(cè)器，Agilent chemstation工作站。十萬(wàn)分之一電子分析天平(BP-211D型，德國(guó)Sartorius)；百分之一電子天平(浙江凱豐集團(tuán)有限公司，型號(hào)：KF10002)；水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司，型號(hào)：LKTC-B1-T)；DW調(diào)溫電熱器(上海平環(huán)燃燒設(shè)備工程技術(shù)有限公司)；超聲清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，型號(hào)：SK6200H)。

1.2試藥

肺寧合劑(批號(hào)：1703037，1609121，1703039；江蘇省中醫(yī)院)；各陰性樣品(實(shí)驗(yàn)室自制)；對(duì)照品鹽酸麻黃堿(批號(hào)：171241-201508)、鹽酸偽麻黃堿(批號(hào)：1237-9601)、苦杏仁苷(批號(hào)：110820-201506)、甘草苷(批號(hào)：111610-201607)、白花前胡甲素(批號(hào)：111711-200602)，以上對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，甘草酸(批號(hào)：160418)購(gòu)于成都普非德生物技術(shù)有限公司，所有對(duì)照品均為含量測(cè)定用。乙腈為色譜純(天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；水為超純水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1供試品溶液的制備

精密吸量取肺寧合劑4 mL，至10 mL的量瓶中，加甲醇至刻度，超聲15分鐘，冷卻，補(bǔ)足甲醇至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素對(duì)照品適量，加甲醇制成分別含上述對(duì)照品518.2、311.7、1193.0、455.9、991.7、39.18 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.3陰性樣品的制備

按制劑處方飲片劑量稱取4份，分別除去麻黃、甘草、苦杏仁和前胡，按照生產(chǎn)工藝分別制成陰性制劑，按“2.1”項(xiàng)下制備陰性樣品溶液。

2.4色譜條件及專屬性試驗(yàn)[3-7]

采用安捷倫1100高效液相色譜儀，Hedera C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脫(洗脫條件見表1)。檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，柱溫：30℃，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺麻黃陰性供試品溶液、缺苦杏仁陰性供試品溶液、缺甘草陰性供試品溶液和缺前胡陰性供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。圖中可見各指標(biāo)成分的分離良好，陰性樣品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

表1 梯度洗脫程序表

2.5線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，依次稀釋得相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液10 μL，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，記錄鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、杏仁苷、甘草苷、甘草酸和白花前胡甲素的峰面積。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得各對(duì)照品的線性方程及相關(guān)系數(shù)，見表2。結(jié)果表明，指標(biāo)成分在線性范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。

2.6精密度試驗(yàn)

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL共6份，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，記錄鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素的峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果各待測(cè)成分峰面積的RSD分別為0.87%、1.17%、0.34%、0.65%、0.32 %、0.75%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

注：1.麻黃堿；2.偽麻黃堿；3.苦杏仁苷；4.甘草苷；5.甘草酸；6.白花前胡甲素；A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.麻黃陰性溶液；D.苦杏仁陰性溶液；E.甘草陰性溶液；F.前胡陰性溶液

圖1 肺寧合劑HPLC圖

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為1703037的肺寧合劑樣品6份，依法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定，記錄供試品溶液中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素的峰面積，計(jì)算各待測(cè)成分峰面積的RSD分別為0.69%、0.35%、0.29%、3.44%、0.78%、0.76%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào)為1703037的肺寧合劑，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別依法于0、2、4、6、8、10、12、24小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄供試品溶液中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素的峰面積，計(jì)算各待測(cè)成分峰面積的RSD分別為0.54%、0.37%、0.53%、0.35%、0.38%、0.49%。結(jié)果表明24小時(shí)內(nèi)供試品溶液中各成分的穩(wěn)定性良好。

2.9加樣回收試驗(yàn)

精密量取已知含量的肺寧合劑(批號(hào)1703037)4 mL至25 mL量瓶中，精密加入約相當(dāng)于含量100%的各對(duì)照品溶液，共6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定并計(jì)算得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素的平均加樣回收率分別為103.05%、95.29%、104.11%、99.78%、96.28%、105.42%，RSD分別為1.63%、4.64%、0.61%、1.15%、1.35%、2.32%。結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好，見表3。

2.10含量測(cè)定

取3個(gè)批次的肺寧合劑，照“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定3個(gè)批次中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素的含量，結(jié)果見表4。

表3 肺寧合劑各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3,mg/mL)

3 討論

3.1測(cè)定目標(biāo)成分的選擇

肺寧合劑由麻黃、苦杏仁、甘草、前胡等7味中藥組成，具有宣肺化痰、疏風(fēng)止咳的作用。本制劑中，君藥為麻黃、苦杏仁和甘草，配以臣藥前胡。現(xiàn)代藥理研究表明，麻黃發(fā)揮平喘和發(fā)汗作用的有效成分為生物堿類成分——鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿[8]。麻黃堿通過(guò)促進(jìn)去甲腎上腺素和腎上腺素釋放，間接發(fā)揮腎上腺素作用；直接興奮α受體，使末梢血管收縮而緩解支氣管黏膜腫脹，直接興奮β受體，使支氣管平滑肌松弛；麻黃堿和偽麻黃堿均有增加心輸出量和升高血壓的作用?？嘈尤示哂薪禋庵箍绕酱?、潤(rùn)腸通便的作用，主要含有的化學(xué)成分為苦杏仁苷，文獻(xiàn)報(bào)道，苦杏仁苷具有鎮(zhèn)咳祛痰、降血糖、降血脂等藥理作用[9]。甘草具有鎮(zhèn)咳平喘、抗炎等作用，主要成分為三萜類和黃酮類化合物，其中甘草酸和甘草苷分別是三萜類和黃酮類化合物重要的單體活性成分，具有很強(qiáng)的藥理活性，比如抗炎作用、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)作用等[10]。前胡主治痰熱喘滿、咯痰黃稠等風(fēng)熱咳嗽痰多癥狀，以角型二氫吡喃香豆素類成分為主要的藥效活性成分。白花前胡甲素作為香豆素類的主要有效成分，具有舒張腸管平滑肌和鈣拮抗作用[11-12]。因此，本研究中選用肺寧合劑中比較有代表性的活性成分作為指標(biāo)成分，進(jìn)行樣品的含量測(cè)定。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)供試品溶液和混合對(duì)照品溶液中的待測(cè)成分在波長(zhǎng)190～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷的最大吸收波長(zhǎng)均為210 nm，其中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿只在210 nm處才有紫外吸收，甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素在210 nm波長(zhǎng)處也有較強(qiáng)吸收。綜合以上因素考慮，本試驗(yàn)選定210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3流動(dòng)相的選擇

本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)干擾較小且各指標(biāo)成分分離效果較好，分析時(shí)間短，因此選擇乙腈-水系統(tǒng)。為了改善峰形，需將流動(dòng)相調(diào)整為弱酸性，提高分離度。本研究考察了0.05%、0.1%、0.2%的磷酸水溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.1%磷酸水溶液的條件下，可以達(dá)到較好改善峰形的效果，因此，本研究選擇乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相系統(tǒng)。由于梯度洗脫系統(tǒng)在達(dá)到乙腈-水=20：80的比例時(shí)，流動(dòng)相黏度達(dá)到最大，流動(dòng)性較差，壓力升高，基線在35分鐘時(shí)有向上浮動(dòng)的趨勢(shì)，但不影響指標(biāo)成分的峰形和分離度。

3.4耐用性的考察

為考察色譜條件的耐用性，采用不同的柱溫(25℃、30℃、35℃)、流速(0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min)、3種高效液相儀waters 2695-2998、Agilent 1100、Agilent 1260，以及不同品牌的同類型色譜柱Hedera C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、依利特 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測(cè)定條件小的變動(dòng)對(duì)指標(biāo)成分的峰形和分離度的影響較小，此色譜條件可靠，適用于日常含量測(cè)定。

4 小結(jié)與展望

肺寧合劑是中藥復(fù)方用藥制劑，作為復(fù)雜樣品體系的質(zhì)量控制定性鑒別很難全面控制制劑質(zhì)量。本研究從多成分測(cè)定的角度出發(fā)，通過(guò)建立肺寧合劑中6個(gè)成分的含量測(cè)定方法，較全面地控制制劑質(zhì)量，為肺寧制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)的提升提供一定的參考依據(jù)。

同時(shí)考慮到中藥制劑多成分、多功效的特性，多個(gè)有效成分或指標(biāo)性成分也難以全面地控制制劑質(zhì)量。筆者在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，色譜圖中除了測(cè)定的指標(biāo)成分，還存在多個(gè)分離度好的未知色譜峰，因而可以建立肺寧合劑指紋圖譜，進(jìn)一步全面、系統(tǒng)地控制制劑質(zhì)量。

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StudyonthedeterminationofmulticomponentcompoundsinFeiningmixturebyHPLC

ZHANGDengshan,ZOUJing,CHENHui，etal.AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029，China

Correspondingauthor:LIUZhihui，E-mail：liuzh1008@126.com

Feiningmixture; Ephedrine hydrochloride; Pseudoephedrine hydrochloride; Amygdalin; Liquiritin; Glycyrrhizic acid; Praeruptorin A

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.001

2017-04-12)

(本文編輯： 禹佳)

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目二期

210029 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部(張登山、劉志輝)；南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(鄒靜、陳慧、彭懿)

作者簡(jiǎn)介： 張登山(1982- )，本科，主管藥師。研究方向：中藥制劑開發(fā)及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail:zds127127@163.com

劉志輝(1962- )，本科，主任中藥師。研究方向：中藥制劑開發(fā)及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail:liuzh1008@126.com