周麗娜,周 靜,李輝信,胡 鋒,徐 莉

南京農(nóng)業(yè)大學, 南京 210000

鎘對苯并(a)芘在蚯蚓亞細胞組分中分配積累的影響

周麗娜,周 靜,李輝信,胡 鋒,徐 莉*

南京農(nóng)業(yè)大學, 南京 210000

通過外源添加不同濃度鎘離子(Cd2+)來研究復合污染條件下鎘(Cd)對苯并(a)芘(BaP)在蚯蚓體內(nèi)不同亞細胞組分(組分C：細胞溶質(zhì)組分；組分D：固體顆粒組分；組分E：細胞碎片組分)中的分配積累情況,并探究其內(nèi)在機制。結果表明,BaP主要分布于蚯蚓的細胞碎片組分,其次為固體顆粒組分,在細胞溶質(zhì)組分中的濃度最低。在Cd2+添加處理下,隨著Cd2+濃度的增加,3個細胞組分中的BaP濃度呈先降低后升高的趨勢。隨著Cd2+濃度的增加,3個亞細胞組分中的蛋白含量與乙酰膽堿酯酶(AChE)活性均呈先升高后下降的趨勢；而蚯蚓細胞溶質(zhì)和細胞碎片組分中的谷胱甘肽S-轉移酶(GST)活性呈先下降后上升的趨勢,但固體顆粒組分中逐漸增加。相關性分析表明,蚯蚓細胞溶質(zhì)和細胞碎片組分中的蛋白含量與其對應組分中的BaP濃度呈顯著負相關；細胞溶質(zhì)組分中的AChE活性與該組分中的BaP濃度呈顯著負相關；而GST的活性與BaP濃度沒有顯著相關性。綜上所述,BaP主要分配積累在細胞碎片組分中,Cd2+可能通過影響蛋白含量及AChE的活性,從而影響B(tài)aP在細胞碎片和細胞溶質(zhì)組分中的積累,使得BaP的濃度隨著Cd2+濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。

苯并(a)芘；鎘；赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)；亞細胞組分；復合污染

重金屬和多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是土壤環(huán)境中重要的兩類污染物,它們往往同時存在形成復合污染[1]。這不僅嚴重損害土壤生態(tài)系統(tǒng),同時給人類健康帶來風險[2- 3],因此,對復合條件下污染物的毒性測定及環(huán)境生態(tài)風險評估十分必要[4]。

我國污染土壤普查表明[5]：重金屬鎘(Cd)被確定為中國土壤污染的首要污染物,在占中國國土三分之二的630萬km2被調(diào)查的土地上,有7%的點位被測出鎘超標。苯并(a)芘(BaP)具有細胞毒性、致突變性及致癌性,是多環(huán)芳烴中最受關注的污染物之一[6-9]。它們可以通過工業(yè)排放、化肥施用、污水灌溉、污泥農(nóng)用等途徑進入農(nóng)田系統(tǒng),形成復合污染,這不僅對作物生長和發(fā)育產(chǎn)生不良影響,而且會通過食物鏈對人和動物健康構成威脅,是目前環(huán)境科學領域研究的熱點之一[10-11]。

蚯蚓是土壤中生物量最大的動物類群之一,它不僅在維持生態(tài)系統(tǒng)功能中起著不可替代的作用(如促進土壤有機質(zhì)的分解、養(yǎng)分循環(huán)與釋放,改善土壤性狀等),而且也是土壤污染狀況的重要指示生物。多個國家和組織利用蚯蚓進行污染物的生態(tài)風險評價,特別是赤子愛勝蚓(Eiseniafetida),以其對污染物敏感性高、實驗可操作性強,而被經(jīng)濟合作與發(fā)展組織選作評估污染物毒性的模式動物,并建立了相應的標準測試流程[12]。

目前,國內(nèi)外的研究多專注于重金屬或多環(huán)芳烴單一或復合條件下對蚯蚓的生態(tài)毒性效應。單一污染下,王慧[13]等報道了鎘暴露會對赤子愛勝蚓體內(nèi)的纖維素酶活性產(chǎn)生抑制作用,張薇等[14]研究表明苯并(a)芘可以誘導蚯蚓體內(nèi)細胞色素P450含量的增加,同時又抑制了超氧化物歧化酶(SOD)的活性；復合污染下,趙作媛[15]發(fā)現(xiàn)鎘和菲復合污染會對蚯蚓的毒性產(chǎn)生拮抗作用,且隨鎘濃度升高其降低菲毒性的程度降低,朱江[16]也報道了重金屬(Cd)和典型多環(huán)芳烴菲(Phe)復合污染對安德愛勝蚓(Eiseniaandrei)和白線蚓(Fridericiabulbosa)的毒性效應,發(fā)現(xiàn)污染物的組成以及濃度影響復合污染的交互作用類型,表現(xiàn)出或拮抗或協(xié)同的毒性效應,生物體內(nèi)的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性變化可作為表征Cd-Phe復合污染的一項重要的參考指標。

雖然毒性效應的研究有了一定的積累,但至今對于不同類型污染物復合條件下,污染物在蚯蚓體內(nèi)分配積累特征的研究為數(shù)不多。與此同時,以往的毒性試驗主要集中于研究污染物在蚯蚓個體水平上的分布特征,而忽視了基于蚯蚓亞細胞水平或分子水平上污染物的行為[17-19]。而污染物在蚯蚓體內(nèi)的行為特征,特別是污染物在亞細胞水平上的分布,更有助于揭示蚯蚓對污染物的固定和解毒策略,并且一些重要的生態(tài)毒理學資料必須從亞細胞水平上才能獲得[20-21]。本研究室前期基于土壤污染暴露環(huán)境下的研究表明,單一Phe污染下,赤子愛勝蚓的不同亞細胞組分中Phe的濃度存在差異,并通過Phe的濃度差異推斷Phe在蚯蚓體內(nèi)的分配過程[22],故對污染物在蚯蚓亞細胞水平上的積累分布的研究可以更好地評價污染物的毒性及闡明蚯蚓對污染物的固定和解毒機制。

一些研究表明,部分蚯蚓的生理生化指標可以用于評價污染物積累分配特征。如蛋白的含量,污染物可以通過誘導蚯蚓體內(nèi)部分蛋白酶的表達,促進蛋白濃度的提高,從而提供與污染物的結合位點,促進污染物的積累[21]；乙酰膽堿酯酶(AChE)是生物神經(jīng)傳導中的一種關鍵性酶, 該酶降解乙酰膽堿(ACh), 保證神經(jīng)信號在生物體內(nèi)的正常傳遞,它可能通過影響生物體的正常生理代謝過程,影響生物對污染物的轉化代謝[23-25]；谷胱甘肽S-轉移酶(GST)也被發(fā)現(xiàn)在生物體對外源污染物代謝解毒以及分配過程中起著重要的作用[26],如影響各細胞分室間對化學物質(zhì)的結合和運輸功能[27],可以通過轉運蛋白將污染物運入液泡達到去毒作用等[28-30]。

綜上所述,本研究通過構建復合污染條件,即在一定濃度BaP污染處理下,同時添加不同濃度的Cd2+,采用半靜態(tài)溶液培養(yǎng)7d,之后對蚯蚓亞細胞組分中BaP的積累分布特征進行研究,同時測定蚯蚓各組分中的蛋白含量,乙酰膽堿酯酶以及谷胱甘肽S-轉移酶的活性,通過研究以上生化指標與BaP的相關性來嘗試揭示在復合污染下Cd對BaP在蚯蚓亞細胞組分中分配積累的影響機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)購自安徽蚯蚓養(yǎng)殖基地。選用大小及體重相近(300—500 mg),成熟且?guī)в协h(huán)帶的健康蚯蚓作為受體[12]。

苯并(a)芘為分析純,純度為98%,購于百靈威科技有限公司。氯化鎘(CdCl2)為分析純,純度為99%,選自阿拉丁試劑。

1.2 實驗設計

本實驗采用半靜態(tài)溶液培養(yǎng)方法進行略加修改[31]。50 mg/L BaP模擬培養(yǎng)液配制如下：采用硝酸鈣(Ca(NO3)2)、硫酸鎂(MgSO4)、硝酸鈉(NaNO3)及硝酸鉀(KNO3)配制成 0.1 mmol/L Ca2+, 0.1 mmol/L Mg2+, 1.0 mmol/L Na+及0.1 mmol/L K+濃度的模擬液,BaP以丙酮溶解,溶于模擬液至終濃度為50 mg/L,丙酮體積終濃度為1‰。在此基礎上,設定4個處理,即添加不同濃度的CdCl2,使得Cd2+終濃度為0,0.2,0.5,0.8 mg/L,備用。

實驗采用玻璃培養(yǎng)皿,每個培養(yǎng)皿中放入10條蚯蚓及20 mL污染物模擬水溶液并用封口膜封住,膜上扎上小口,防止蚯蚓逃逸且保證通氣,于(20±1) ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每天挑除死亡蚯蚓,并更換培養(yǎng)液,第7天進行采樣,用液氮殺死后儲存于-70 ℃冰箱。每個處理設定4個重復。

1.3 亞細胞分組

本實驗將蚯蚓分為3個亞細胞組分。具體過程如下：蚯蚓融化后放置于含有 5 mL 冰冷的 Tris-HCl (0.01 mol/L,pH=7.0) 緩沖液勻漿瓶中,在1500 r/min條件下勻漿 5 min (組織勻漿器 DY89- 2,寧波生物技術公司)。然后勻漿液在高速冷凍離心機中(Sigma 3K 30, Sigma 公司),分別在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min,收集上清(細胞溶質(zhì)部分)。得到的沉淀加入2 mL 氫氧化鈉(NaOH)溶液(1 mol/L)進行充分消解,并繼續(xù)在高速冷凍離心機中,分別在10000 g,20 ℃條件下離心10 min,收集上清(細胞碎片部分)及沉淀(固體顆粒部分)。收集的3個組分冷凍后置于 ALPHA 1- 2 LD plus 冷凍干燥器中干燥。最后樣品儲存于 -70 ℃冰箱中,等待進一步測定。

1.4 苯并(a)芘測定

苯并(a)芘的提取參考Contreras-Ramos等[32]的方法,并略加改動。 蚯蚓經(jīng)過預處理后,固體組分稱重后與3倍于其質(zhì)量的無水硫酸鈉(Na2SO4)混合后,置于研缽中磨成粉末。將粉末轉移到棕色玻璃離心管中(40 mL,安捷倫公司,美國),加入15 mL二氯甲烷作萃取劑,密封。將離心管置于加有冰水的超聲波清洗器中進行超聲萃取1 h,然后在一個渦旋儀在渦旋 60 s,再次超聲1 h,提取液在3500 r/min條件下離心15 min,提取上清液。此過程重復2次。上清液合并后移取6 mL,并過加有3 g柱層層析硅膠的硅膠柱,用11 mL 1∶1 的二氯甲烷和正已烷溶液分兩次洗脫；洗脫液收集至旋轉蒸發(fā)瓶中,在 40 ℃ 水浴條件下旋轉蒸發(fā),濃縮至干。用2 mL甲醇進行溶解定容,過 0.22 μm 有機濾膜后上機分析。

苯并(a)芘測定采用反相高效液相色譜(LC- 20AT, 日本 Shimadzu 公司) 測試, 并配有紫外-可見檢測器(SPD- 20A),色譜柱為C18柱(Shim-pack VP-ODS, 250× 4.6 mm, 5 μm),保護柱為C18柱(Shim-pack GVP-ODS, 10× 4.6 mm, 5 μm)。色譜條件如下：流動相為色譜純級甲醇,流動相均為每次測樣前過 0.45 μm 濾膜并超聲脫氣；在流速 1.0 mL/min下實行等度洗脫；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量 20 μL。根據(jù)出峰時間定性,根據(jù)峰面積由外標法定量。檢測信號由HW- 2000 色譜工作站(南京千譜軟件有限公司)記錄并處理數(shù)據(jù)。

1.5 生化測定

蚯蚓不同亞細胞組分中,蛋白含量采用考馬斯亮藍比色法測定,通過測定595 nm波長下的吸光度可計算出蛋白的含量；乙酰膽堿酯酶的活力采用TNB(對稱三硝基苯, Sym-Trinitrobenzene)比色法測定,在412 nm波長下測定吸光度,酶活性單位以每毫克組織蛋白在37 ℃保溫6分鐘,水解反應體系中1 μmol基質(zhì)為1個活力單位,結果表示為U/mgprot；谷胱甘肽-S-轉移酶的活力采用分光光度計法,在412 nm波長下測定吸光度,通過催化谷胱甘肽(GSH)與1-氯- 2, 4二硝基苯(CDNB)的結合來表征,酶活性單位以每毫克組織蛋白,在37 ℃反應1min扣除非酶促反應,使反應體系中GSH濃度降低1 μmol/L為1個酶活力單位。以上測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗結果采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理軟件進行統(tǒng)計分析,用單因素方差分析法(one-way ANOVA)中的Duncan法進行不同濃度Cd2+處理樣本間的差異顯著性分析(P< 0.05),采用Pearson相關性來分析生化測定結果與對應BaP含量的相關性(P< 0.05),均采用OriginPro 9.0軟件作圖。

2 結果

2.1 鎘對蚯蚓體內(nèi)苯并(a)芘分配積累的影響

由圖1可得,與空白相比,添加Cd2+的處理下,蚯蚓體內(nèi)的BaP的積累量均顯著降低。且隨著Cd2+濃度的升高,蚯蚓體內(nèi)BaP的濃度呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,并在0.5 mg/L Cd2+處理中,BaP的濃度達到最小值。

比較蚯蚓不同亞細胞組分對BaP的積累(圖1)可得,相同處理下,BaP主要集中積累于蚯蚓的細胞碎片組分內(nèi),其次為固體顆粒組分,在細胞溶質(zhì)組分中的積累量最低。不同濃度Cd2+的添加能夠抑制BaP在細胞碎片和固體顆粒物中的積累,并在0.5 mg/L Cd2+處理中達到最小值,但是0.8 mg/L Cd2+處理促進了細胞溶質(zhì)組分中BaP的積累。

圖1 不同濃度Cd2+對蚯蚓體內(nèi)苯并(a)芘分配積累的影響Fig.1 Effcet of different concentration of Cd2+ on the distribution and accumulation of BaP in the earthworm a. 代表個體總量，b. 代表不同亞細胞組分分布

2.2 鎘對蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的影響

由圖2可得,蚯蚓體內(nèi)的總蛋白含量隨著Cd2+濃度的增加呈先上升后下降的趨勢,在0.5 mg/L Cd2+處理下蛋白含量顯著增加。

比較蚯蚓各亞細胞組分中的蛋白含量(圖2)可知,相同處理下,細胞碎片組分中的蛋白含量最高,其次為細胞溶質(zhì)組分,固體顆粒組分中最少。在添加Cd2+的處理下,各組分中的蛋白含量均呈先上升后下降的趨勢,在0.5 mg/L Cd2+處理中顯著增加至最大值,隨后在0.8 mg/L Cd2+處理中又出現(xiàn)不同程度的降低。

圖2 不同濃度Cd2+對蚯蚓體內(nèi)蛋白濃度的影響Fig.2 Effcet of different concentration of Cd2+ on the concentration of protein in the earthworm

2.3 鎘對蚯蚓體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力的影響

由圖3可知,蚯蚓體內(nèi)總乙酰膽堿酯酶活力呈先上升后下降的趨勢,在0.5 mg/L Cd2+處理下顯著增加,達到最大值,隨后在0.8 mg/L Cd2+處理下顯著降低,達到最小值。

比較各亞細胞組分中的乙酰膽堿酯酶活力(圖3)可得,相同處理下,細胞碎片組分中的乙酰膽堿酯酶活力最高,其次為細胞溶質(zhì)和固體顆粒組分。在添加Cd2+的處理下,細胞溶質(zhì)組分中乙酰膽堿酯酶的活力隨著Cd2+濃度的增加呈逐漸降低的趨勢；而細胞碎片和固體顆粒組分中乙酰膽堿酯酶的活力呈先上升后下降的趨勢,均在0.5mg/L Cd2+處理下達到最大值,隨后在0.8 mg/L Cd2+處理下又有所降低。

圖3 不同濃度Cd2+對蚯蚓體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力的影響Fig.3 Effcet of different concentration of Cd2+ on the activity of AChE in the earthworm

2.4 鎘對蚯蚓體內(nèi)谷胱甘肽S-轉移酶活力的影響

由圖4可知,蚯蚓體內(nèi)總谷胱甘肽S-轉移酶活力隨著Cd2+濃度的增加呈先降低后升高的趨勢,在0.5 mg/L Cd2+處理下達到最小值,隨后在0.8 mg/L Cd2+處理下顯著增加達到最大值。

比較各亞細胞組分中的谷胱甘肽S-轉移酶活力(圖4)可知,細胞溶質(zhì)與細胞碎片組分中中谷胱甘肽S-轉移酶活力總體相近,而在固體顆粒組分中較低。Cd2+能增加細胞溶質(zhì)及固體顆粒組分中谷胱甘肽S-轉移酶的活性,而抑制細胞碎片中谷胱甘肽S-轉移酶的活性。在添加Cd2+的處理下,細胞溶質(zhì)和細胞碎片組分中的谷胱甘肽S-轉移酶活性都呈先下降后上升的趨勢,并在0.5 mg/L Cd2+處理下達到最小值,隨后又在0.8 mg/L Cd2+處理下顯著增加,而固體顆粒組分中谷胱甘肽S-轉移酶活性隨著Cd2+濃度的增加在0.8 mg/L Cd2+處理下顯著增加。

圖4 不同濃度Cd2+對蚯蚓體內(nèi)谷胱甘肽S-轉移酶活力的影響Fig.4 Effcet of different concentration of Cd2+ on the activity of GST in the earthworm

2.5 相關性分析

通過相關性分析可得,不同濃度Cd2+添加處理下,細胞溶質(zhì)組分中的蛋白濃度及乙酰膽堿酯酶活力與細胞溶質(zhì)組分中的BaP積累量呈顯著負相關；細胞碎片組分中的蛋白濃度與細胞碎片組分中的BaP積累量呈顯著負相關(表1)。

表1 不同亞細胞組分中酶活指標與苯并(a)芘濃度之間的相關性分析

AChE: acetylcholinesterase ;GST: glutathione s-transfer;*表示在 0.05 水平(雙側)上顯著相關

3 討論

本研究結果顯示,不同濃度Cd2+對BaP的積累有不同程度的抑制作用,蚯蚓體內(nèi)的總BaP濃度在0.5 mg/L Cd2+處理組時達到最小值,隨后又有所回升,但均小于不添加Cd2+的處理,且BaP主要集中積累在細胞碎片組分中,其次為固體顆粒組分,在細胞溶質(zhì)組分中的積累量最少。這與段曉塵[33]的研究結果一致,這可能是因為細胞碎片組分中含有細胞膜等物質(zhì),具有較強的親脂性,易與疏水性的化學物質(zhì)相結合,而BaP是一種疏水性有機污染物,從而BaP在細胞碎片組分中的積累量增加[22,34]。

BaP處理下,蚯蚓3個亞細胞組分中的蛋白濃度均隨外加鎘離子濃度的增加呈先增加后減少的趨勢。由相關性分析可得,細胞溶質(zhì)與細胞碎片組分中BaP濃度與蛋白濃度呈顯著負相關,這可能是因為隨著Cd2+濃度的增加,促進了生物體內(nèi)與金屬解毒、貯藏和體內(nèi)平衡作用有關的蛋白的合成,例如金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)[35-36],多個研究表明,鎘暴露可以促進金屬硫蛋白基因的表達[33],并通過金屬硫蛋白對鎘的吸附,促進鎘進入蚯蚓體內(nèi)并增加積累[37]。此外,Mosleh等[38]研究發(fā)現(xiàn)有機污染物-除草劑異丙隆的暴露也可以促進水生顫蚓(Tubifextubifex)中金屬硫蛋白含量的增加。而金屬硫蛋白對重金屬的高度親和性導致BaP與蛋白的結合受到Cd2+的競爭抑制作用,從而降低了BaP在蚯蚓體內(nèi)的積累量；反之,在高濃度Cd2+濃度下,蚯蚓蛋白表達受到抑制,從而降低鎘在蚯蚓體內(nèi)的積累,減弱了相互的競爭,促進了BaP在蚯蚓體內(nèi)的積累。

復合污染下,隨著Cd2+濃度的增加,3個亞細胞組分中的乙酰膽堿酯酶活力隨著Cd2+濃度的增加呈先增加后降低的趨勢,同時,高歡歡[39]在Cd脅迫下研究麥長管蚜體內(nèi)乙酰膽堿酯酶基因表達,以及趙詔[23]在Cd暴露下研究家蠶體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力變化,均獲得了類似的結果,即鎘對乙酰膽堿酯酶活力的影響呈低濃度刺激,高濃度抑制的現(xiàn)象。低濃度Cd2+處理下生物體會表現(xiàn)出毒物興奮效應,促進AChE的表達,會對生物體的正常代謝有促進作用,反之,高濃度Cd2+處理下會表現(xiàn)出毒物抑制效應,抑制了AChE的活性,對生物體正常的生理代謝過程產(chǎn)生抑制作用[23,40-41],同時,生物體中生理生化過程的改變會影響污染物的代謝轉化。本研究發(fā)現(xiàn)細胞溶質(zhì)組分中的BaP濃度與乙酰膽堿酯酶活力呈顯著負相關,這可能就是因為低濃度Cd2+誘導了AChE的表達,促進蚯蚓對BaP的代謝解毒作用,從而導致了BaP濃度的降低,而高濃度Cd2+抑制了AChE的表達,減弱了蚯蚓對BaP的代謝解毒作用,故BaP濃度呈現(xiàn)增加的趨勢。

谷胱甘肽-S-轉移酶在生物體解毒外源污染物過程中起著重要的作用。谷胱甘肽在分子抗氧化機理中起著關鍵作用,它可以通過谷胱甘肽S-轉移酶作用與異生物質(zhì)結合,生成親水的谷朧甘膚衍生物,通過排泄的方式排出體外,具有降低化學反應活性的效應[42-43]。但由本試驗可得,蚯蚓體內(nèi)各組分中BaP的濃度與谷胱甘肽S-轉移酶活力之間雖然沒有顯著相關性,但是隨著Cd2+濃度的增加,谷胱甘肽S-轉移酶的活力呈先下降,隨后又上升的趨勢,這與Lei等[44]的研究一致,谷胱甘肽S-轉移酶能夠參與外源污染物的代謝,隨著污染暴露時間以及濃度存在先抑制后恢復的過程。

4 結論

綜上所述,Cd2+顯著抑制了BaP在蚯蚓體內(nèi)的總積累量,BaP主要集中積累在細胞碎片組分中,其次為固體顆粒組分,在細胞溶質(zhì)組分中的積累量最少。Cd2+的加入可以抑制BaP在細胞碎片和固體顆粒組分中BaP的積累,但高濃度的Cd2+促進了細胞溶質(zhì)組分中BaP的積累。Cd2+可能通過誘導乙酰膽堿酯酶的表達,促進了機體對外源污染物的防御能力及代謝作用,從而減弱BaP的積累。

[1] Mielke H W, Wang G D, Gonzales C R, Powell E T, Le B, Quach V N. PAHs and metals in the soils of inner-city and suburban New Orleans, Louisiana, USA. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2004, 18(3): 243- 247.

[2] 高巖, 駱永明. 蚯蚓對土壤污染的指示作用及其強化修復的潛力. 土壤學報, 2005, 42(1): 140- 148.

[3] Ping L F, Luo Y M, Zhang H B, Li Q B, Wu L H. Distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in thirty typical soil profiles in the Yangtze River Delta region, east China. Environmental Pollution, 2007, 147(2): 358- 365.

[4] 朱永恒, 濮勵杰, 趙春雨, 王宗英. 土地污染的一個評價指標: 土壤動物. 土壤通報, 2006, 37(2): 373- 377.

[5] 中華人民共和國環(huán)境保護部. 環(huán)境保護部和國土資源部發(fā)布全國土壤污染狀況調(diào)查公報. [2016-07- 10]. http://www.zhb.gov.cn/gkml/hbb/qt/201404/t20140417_270670.htm.

[6] Binelli A, Riva C, Cogni D, Provini A. Assessment of the genotoxic potential of benzo(a)pyrene andpp′-dichlorodiphenyldichloroethylene in Zebra mussel (Dreissenapolymorpha). Mutation Research, 2008, 649(1/2): 135- 145.

[7] Juhasz A L, Naidu R. Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons: a review of the microbial degradation of benzo[a]pyrene. International Biodeterioration & Biodegradation, 2000, 45(1/2): 57- 88.

[8] Tung E W Y, Philbrook N A, Belanger C L, Ansari S, Winn L M. Benzo[a]pyrene increases DNA double strand break repairinvitroandinvivo: a possible mechanism for benzo[a]pyrene-induced toxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2014, 760(3): 64- 69.

[9] Williams R, Hubberstey A V. Benzo(a)pyrene exposure causes adaptive changes in p53 and CYP1A gene expression in Brown bullhead (Ameiurusnebulosus). Aquatic Toxicology, 2014, 156: 201- 210.

[10] Hamdi H, Benzarti S, Manusad?ianas L, Aoyama I, Jedidi N. Bioaugmentation and biostimulation effects on PAH dissipation and soil ecotoxicity under controlled conditions. Soil Biology and Biochemistry, 2007, 39(8): 1926- 1935.

[11] Wei B G, Yang L S. A review of heavy metal contaminations in urban soils, urban road dusts and agricultural soils from China. Microchemical Journal, 2010, 94(2): 99- 107.

[12] Organization for Economic Cooperation and Development. No. 207: Earthworm, Acute Toxicity Tests. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, 1984.

[13] 王慧, 張玉龍, 黨秀麗, 任琳, 姬景紅, 虞娜. 土壤鎘、鋅污染對蚯蚓纖維素酶活性的影響. 生態(tài)環(huán)境, 2008, 17(2): 661- 665.

[14] 張薇, 宋玉芳, 劉淼, 孫鐵珩. 苯并(a)芘對蚯蚓細胞色素P450和抗氧化酶影響. 遼寧工程技術大學學報: 自然科學版, 2009, 28(5): 846- 848.

[15] 趙作媛. 鎘-菲復合污染對蚯蚓的急性毒性效應及抗氧化酶的影響[D]. 上海: 上海交通大學, 2007.

[16] 朱江. 鎘-菲復合污染對安德愛勝蚓(Eiseniaandrei)和白線蚓(Fridericiabulbosa)的生態(tài)毒理效應研究[D]. 上海: 上海交通大學, 2008.

[17] Marques C, Pereira R, Gon?alves F. Using earthworm avoidance behaviour to assess the toxicity of formulated herbicides and their active ingredients on natural soils. Journal of Soils and Sediments, 2009, 9(2): 137- 147.

[18] Wu S J, Wu E M, Qiu L Q, Zhong W H, Chen J M. Effects of phenanthrene on the mortality, growth, and anti-oxidant system of earthworms (Eiseniafetida) under laboratory conditions. Chemosphere, 2011, 83(4): 429- 434.

[19] Li L Z, Zhou D M, Peijnenburg W J G M, Wang P, Van Gestel C A M, Jin S Y, Wang Q Y. Uptake pathways and toxicity of Cd and Zn in the earthwormEiseniafetida. Soil Biology and Biochemistry, 2010, 42(7): 1045- 1050.

[20] 史志明. 菲在蚯蚓體內(nèi)的分布及其對蚯蚓抗氧化防御體系的影響[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學, 2013.

[21] Mekahlia M N, Tine S, Menasria T, Amieur H, Salhi H.Invitrobiomarker responses of earthwormLumbricusterrestrisexposed to herbicide sekator and phosphate fertilizer. Water, Air, & Soil Pollution, 2016, 227(1): 1- 8.

[22] Shi Z M, Xu L, Hu F. A hierarchic method for studying the distribution of phenanthrene inEiseniafetida. Pedosphere, 2014, 24(6): 743- 752.

[23] 趙詔, 夏菊, 陶麗丹, 肖歡, 徐水, 朱勇. 重金屬鎘對家蠶生長發(fā)育及體內(nèi)過氧化物酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響. 蠶業(yè)科學, 2014, 40(3): 462- 467.

[24] Gambi N, Pasteris A, Fabbri E. Acetylcholinesterase activity in the earthwormEiseniaandreiat different conditions of carbaryl exposure. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2007, 145(4): 678- 685.

[25] Rao J V, Shilpanjali D, Kavitha P, Madhavendra S S. Toxic effects of profenofos on tissue acetylcholinesterase and gill morphology in a euryhaline fish,Oreochromismossambicus. Archives of Toxicology, 2003, 77(4): 227- 232.

[26] Hayes J D, Flanagan J U, Jowsey I R. Glutathione transferases. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2005, 45: 51- 88.

[27] 宋長芹, 繆海飛, 朱斌, 佟少明, 李澤昀, 侯和勝. 植物谷胱甘肽-S-轉移酶在植物修復中的作用. 安徽農(nóng)學通報, 2010, 16(7): 56- 56, 110- 110.

[28] 張巖, 胡軍, 郭長虹, 徐香玲, 李集臨, 胡贊民. 植物谷胱甘肽-S-轉移酶的分子生物學研究進展. 哈爾濱師范大學自然科學學報, 2007, 23(4): 76- 79.

[29] Velki M, Hackenberger B K. Biomarker responses in earthwormEiseniaandreiexposed to pirimiphos-methyl and deltamethrin using different toxicity tests. Chemosphere, 2013, 90(3): 1216- 1226

[31] Li L Z, Zhou D M, Wang P, Luo X S. Subcellular distribution of Cd and Pb in earthwormEiseniafetidaas affected by Ca2+ions and Cd-Pb interaction. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2008, 71(3): 632- 637.

[32] Contreras-Ramos S M,lvarez-Bernal D, Dendooven L.Eiseniafetidaincreased removal of polycyclic aromatic hydrocarbons from soil. Environmental Pollution, 2006, 141(3): 396- 401.

[33] 段曉塵. 重金屬和有機污染物對赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)的生態(tài)毒理效應及機制差異[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學, 2015.

[34] Gao Y Z, Cao X Z, Kang F X, Cheng Z X. PAHs pass through the cell wall and partition into organelles of arbuscular mycorrhizal roots of ryegrass. Journal of Environmental Quality, 2011, 40(2): 653- 656.

[35] Xiong W G, Ding X Y, Zhang Y M, Sun Y X. Ecotoxicological effects of a veterinary food additive, copper sulphate, on antioxidant enzymes and mRNA expression in earthworms. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2014, 37(1): 134- 140.

[36] Mo X H, Qiao Y H, Sun Z J, Sun X F, Li Y. Molecular toxicity of earthworms induced by cadmium contaminated soil and biomarkers screening. Journal of Environmental Sciences, 2012, 24(8): 1504- 1510.

[37] Yu S, Lanno R P. Uptake kinetics and subcellular compartmentalization of cadmium in acclimated and unacclimated earthworms (Eiseniaandrei). Environmental Toxicology and Chemistry, 2010, 29(7): 1568- 1574.

[38] Mosleh Y Y, Paris-Palacios S, Arnoult F, Couderchet M, Biagianti-Risbourg S, Vernet G. Metallothionein induction in aquatic oligochaete tubifex tubifex exposed to herbicide isoproturon. Environmental Toxicology, 2004, 19(1): 88- 93.

[39] 高歡歡. 重金屬Cd和Zn長期脅迫下麥長管蚜Sitobionavenae防御機制的研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學, 2013.

[40] Tylko G, Banach Z, Borowska J, Niklińska M, Pyza E. Elemental changes in the brain, muscle, and gut cells of the housefly,Muscadomestica, exposed to heavy metals. Microscopy Research and Technique, 2005, 66(5): 239- 247.

[41] Stebbing A R D. Hormesis-The stimulation of growth by low levels of inhibitors. Science of the Total Environment, 1982, 22(3): 213- 234.

[42] Pickett C B, Lu A Y. Glutathione S-transferases: gene structure, regulation, and biological function. Annual Review of Biochemistry, 1989, 58: 743- 764.

[43] Schreck E, Geret F, Gontier L, Treilhou M. Neurotoxic effect and metabolic responses induced by a mixture of six pesticides on the earthwormAporrectodeacaliginosanocturna. Chemosphere, 2008, 71(10): 1832- 1839.

[44] Lei F, Zhang L, Zhang Y N, Zhang P, Jiang H Y. Inhibition and recovery of biomarkers of earthwormEiseniafetidaafter exposure to thiacloprid. Environmental Science and Pollution Research, 2015, 22(12): 9475- 9482.

EffectsofcadmiumonthedistributionandaccumulationofbenzoapyreneinsubcellularfractionsofEiseniafetida

ZHOU Lina, ZHOU Jing, LI Huixin, HU Feng, XU Li*

NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210000,China

This experiment explored the mechanism underlying benzo[a]pyrene (BaP) distribution in different subcellular fractions of the earthwormEiseniafetida(Fraction C: associated with the cytosol; Fractions D: associated with granules; and Fraction E: associated with tissue fragments and cell membranes) under conditions of contamination with both BaP and cadmium ions (Cd2+) at different concentrations. The results showed that Cd2+inhibited the accumulation of BaP in the earthworm, and that BaP was accumulated to the greatest extent in Fraction E, followed by Fraction C and Fraction D. With the addition of Cd2+, BaP concentrations in the three fractions initially decreased, but subsequently increased with the increasing concentration of Cd2+, whereas protein content and acetylcholinesterase (AChE) activity showed the opposite trend. In contrast, glutathione s-transferase (GST) activity initially decreased and then subsequently increased with increasing Cd2+concentration in Fraction C and E, whereas the activity gradually increased in Fraction D. Correlation analysis indicated that protein content showed a significant negative correlation with BaP concentration in Fraction C and E; AChE activity showed a significant negative correlation with BaP concentration in Fraction C; and GST activity showed a non-significant correlation with BaP concentration. Collectively, the results indicate that BaP mainly accumulated in Fraction E, and that the accumulation of BaP in Fraction C and E was correlated with the content of protein and activity of AChE, which was influenced by Cd2+. Furthermore, BaP concentration initially decreased, but subsequently increased, with the increasing concentration of Cd2+.

benzo[a]pyrene; cadmium;Eiseniafetida; subcellular fraction; combined pollution

國家自然科學基金(41371469);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費(201503121);江蘇省優(yōu)勢學科項目資助

2016- 07- 07; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡出版日期

日期:2017- 05- 27

*通訊作者Corresponding author.E-mail: xuli602@njau.edu.cn

10.5846/stxb201607071390

周麗娜,周靜,李輝信,胡鋒,徐莉.鎘對苯并(a)芘在蚯蚓亞細胞組分中分配積累的影響.生態(tài)學報,2017,37(19):6616- 6623.

Zhou L N, Zhou J, Li H X, Hu F, Xu L.Effects of cadmium on the distribution and accumulation of benzo[a]pyrene in subcellular fractions ofEiseniafetida.Acta Ecologica Sinica,2017,37(19):6616- 6623.