周艷華，范安然，黃文竹

（1．貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴陽(yáng) 貴州 550004）

抗凍保護(hù)劑中蔗糖濃度決定卵母細(xì)胞脫除抗凍保護(hù)劑的方法

周艷華1，范安然1，黃文竹2

（1．貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴陽(yáng) 貴州 550004）

本研究實(shí)驗(yàn)一采用三種添加不同濃度蔗糖的預(yù)處理液（S1，S2，S3）分別處理小鼠卵母細(xì)胞20mim，以PBS溶液或0.5mol/L蔗糖溶液脫除抗凍保護(hù)劑，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞的存活率.S1液為含10%v/v的PBS溶液；S2液在S1液的基礎(chǔ)上蔗糖濃度添加至0.034mol/L；S3液在S1液的基礎(chǔ)上蔗糖濃度添加至0.38mol/L.結(jié)果顯示：以PBS液直接脫除抗凍保護(hù)劑，S1，S2，S3組卵母細(xì)胞的存活率分別為0，20%，54%.以0.5mol/L的蔗糖溶液脫除抗凍保護(hù)劑，S1，S2，S3組卵母細(xì)胞存活率分別為43%，50%，75%.實(shí)驗(yàn)二所有卵母細(xì)胞以 S1液預(yù)處理 3min，然后分別以 ES1，ES2，ES3液處理 30s，采用 PBS，0.25mol/L或 0.5 mol/L蔗糖溶液脫除抗凍保護(hù)劑.ES1液為40%v/v的EG溶液中添加了0.3mol/L的蔗糖；ES2液的蔗糖濃度為0.5mol/L；ES3液的蔗糖濃度為0.8mol/L.結(jié)果顯示，隨著蔗糖濃度的提高，卵母細(xì)胞以PBS脫除抗凍保護(hù)劑的存活率顯著提高（ES3組57%vs ES1組3%）.該研究表明，預(yù)處理液或玻璃化液中添加蔗糖，均能影響卵母細(xì)胞脫除抗凍保護(hù)劑的方法.結(jié)論，在卵母細(xì)胞冷凍實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)根據(jù)冷凍液的成分設(shè)計(jì)相應(yīng)的抗凍保護(hù)劑脫除方法.

卵母細(xì)胞；抗凍保護(hù)劑；蔗糖濃度；抗凍保護(hù)劑脫除

從1985年Rall等發(fā)明玻璃化冷凍以來(lái)[1]，該技術(shù)已在小鼠，牛，人等卵母細(xì)胞和胚胎冷凍上廣泛應(yīng)用.隨著對(duì)玻璃化冷凍原理的研究，玻璃化液也有了較大的改進(jìn).其中的主要成分有滲透性抗凍保護(hù)劑和非滲透性抗凍保護(hù)劑.滲透性抗凍保護(hù)劑有二甲基亞砜，乙二醇，丙二醇，丙三醇等；非滲透性抗凍保護(hù)劑有聚蔗糖，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖等大分子物質(zhì).非滲透性抗凍保護(hù)劑中使用較多的是蔗糖，其不僅在冷凍液中有添加，在解凍液中也是非常必要的添加成分.解凍液中添加蔗糖的作用主要是利用蔗糖在細(xì)胞外產(chǎn)生較高的滲透壓，防止解凍時(shí)水分過(guò)度滲入細(xì)胞造成細(xì)胞崩解；冷凍液中添加蔗糖一是增加溶液的粘稠度，有利于溶液玻璃化的形成；二是使細(xì)胞保持收縮的狀態(tài)，防止抗凍保護(hù)劑過(guò)多的滲入細(xì)胞.在諸多的研究中，冷凍方法多種多樣，解凍方法也多種多樣.多數(shù)研究者分開(kāi)來(lái)探討抗凍保護(hù)劑的添加和脫除方案對(duì)卵母細(xì)胞存活率的影響.作者認(rèn)為，抗凍保護(hù)劑的添加程序決定了其脫除程序.當(dāng)抗凍保護(hù)劑中含有不同濃度的蔗糖時(shí)，溶液的滲透壓不同，進(jìn)而影響細(xì)胞的收縮程度，影響抗凍保護(hù)劑滲入胞內(nèi)的量.所以本研究設(shè)計(jì)了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，分別在預(yù)處理液和玻璃化液中添加不同濃度的蔗糖，比較了蔗糖濃度對(duì)卵母細(xì)胞脫除抗凍保護(hù)劑后存活率的影響.由于抗凍保護(hù)劑具有一定的毒性，所以脫除抗凍保護(hù)劑又稱為脫毒.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠卵母細(xì)胞的獲?。哼x擇4—6周齡雌性昆明白小鼠，腹腔注射PMSG（寧波激素廠生產(chǎn)）10U/只，48h后腹腔注射hCG（寧波激素廠生產(chǎn)）10U/只，14h后頸椎脫臼處死小鼠，暴露腹腔剪取輸卵管.用剝卵針剝開(kāi)輸卵管壺腹部，收取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，采用0.03%透明質(zhì)酸酶37℃消化2min，將脫去卵丘顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞收集到PBS（Gibco，2012050）溶液中待用.

1.2 預(yù)處理液和玻璃化液的配制

預(yù)處理液和玻璃化液均以PBS液為基礎(chǔ)液，在其中加入不同濃度的乙二醇（EG）和蔗糖（sucrose）.

?

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)一，選擇排出第一極體形狀規(guī)則的卵母細(xì)胞隨機(jī)分為6組，每組10枚，各組卵母細(xì)胞分別用S1，S2或S3液處理20min，然后分別用PBS或0.5mol/L的蔗糖溶液脫毒，統(tǒng)計(jì)各組脫除抗凍保護(hù)劑后卵母細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

實(shí)驗(yàn)二，卵母細(xì)胞隨機(jī)分為9組，每組卵母細(xì)胞經(jīng)S1液預(yù)處理 3min，分別以 ES1，ES2或 ES3液處理 30s，以PBS，0.25mol/L或0.50mol/L的蔗糖溶液脫毒，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

使用spss統(tǒng)計(jì)軟件（spss18）對(duì)卵母細(xì)胞存活率進(jìn)行ANOVA單因素方差分析和Duncan’s檢驗(yàn)方法判斷不同處理組之間的差異顯著性，P＜0.05時(shí)即認(rèn)為差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 預(yù)處理液中添加不同濃度蔗糖對(duì)卵母細(xì)胞脫毒后存活率的影響

注：同一列上標(biāo)不同字母表示差異顯著（P＜0.05）.

2.2 玻璃化液中添加不同濃度蔗糖對(duì)卵母細(xì)胞脫毒后存活率的影響

注：同一列上標(biāo)不同字母表示差異顯著（P＜0.05）.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所用到的S1液為含10%v/v EG的PBS溶液，是玻璃化冷凍中常用的預(yù)處理液，有研究表明，在該溶液中達(dá)到平衡時(shí)小鼠卵母細(xì)胞體積是初始體積的1.1倍[2].S2液是在S1液的基礎(chǔ)上添加了一定量的蔗糖，該濃度下達(dá)到平衡時(shí)卵母細(xì)胞體積等于初始體積；S3液在S1液的基礎(chǔ)上將蔗糖濃度提高至0.38mol/L，該濃度下達(dá)到平衡時(shí)卵母細(xì)胞體積約為初始體積的1/2.為了減少聚蔗糖（Ficoll）的干擾，ES1，ES2，ES3 液除未添加聚蔗糖（Ficoll）外，其組成與其他研究者常用的玻璃化液相同[3].Wang等采用EG作為抗凍保護(hù)劑，認(rèn)為4步添加法結(jié)合2步脫除法可以降低牛卵母細(xì)胞經(jīng)受的滲透壓損傷，與1步添加和1步脫除方法相比獲得了較高的存活率和囊胚率[4].Kobayashi等玻璃化冷凍豬胚胎，對(duì)2步法脫毒和1步法脫毒進(jìn)行比較，結(jié)果表明2步法脫毒后可以獲得85%的胚胎存活率，而1步脫毒組僅有40%的存活率[5].這些研究多數(shù)認(rèn)為分步脫毒法可以降低細(xì)胞脫毒時(shí)的滲透壓損傷，從而獲得較高的存活率.事實(shí)上，抗凍保護(hù)劑的脫除程序與抗凍保護(hù)劑的添加程序是密切相關(guān)的，針對(duì)特定的抗凍保護(hù)劑添加過(guò)程應(yīng)該采取對(duì)應(yīng)的脫毒步驟[6].實(shí)際應(yīng)用中遵循“越簡(jiǎn)單越實(shí)用”的原則.抗凍保護(hù)劑的脫除過(guò)程越簡(jiǎn)單，越易于實(shí)際操作.脫毒時(shí)需要多高濃度的蔗糖取決于抗凍保護(hù)劑添加過(guò)程中有多少抗凍保護(hù)劑滲入到胞內(nèi).冷凍液中添加蔗糖可以增加玻璃化液的粘稠度，有利于玻璃化的形成；同時(shí)蔗糖可以使細(xì)胞收縮，減少抗凍保護(hù)劑過(guò)度滲入胞內(nèi).但是抗凍保護(hù)劑中添加過(guò)高濃度的蔗糖會(huì)占據(jù)溶液較大的體積，導(dǎo)致溶液中滲透性抗凍保護(hù)劑的相對(duì)濃度升高，增加溶液毒性.本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)表明，玻璃化液中添加0.8mol/L的蔗糖相對(duì)于0.5mol/L蔗糖添加組，牛囊胚冷凍存活率顯著降低，19%vs83%（數(shù)據(jù)未發(fā)表）.本實(shí)驗(yàn)中，在設(shè)計(jì)的蔗糖濃度范圍內(nèi)，隨著蔗糖濃度的增加，以PBS或蔗糖溶液脫毒后卵母細(xì)胞存活率均有所升高.理想情況下，最簡(jiǎn)單的脫毒方法是采用PBS直接脫毒.通過(guò)本實(shí)驗(yàn)證明，抗凍保護(hù)劑中添加一定濃度的蔗糖可以降低卵母細(xì)胞脫毒時(shí)的滲透壓損傷，增加卵母細(xì)胞存活率，預(yù)示采用PBS直接脫毒的解凍方法具有可行性.

〔1〕Rall,W.F.and G.M.Fahy,Ice-free cryopreservation of mouse embryos at-196 C by vitrification.1985.

〔2〕Pedro P B,Yokoyama E,Zhu S E,et al.Permeability of mouse oocytes and embryos at various developmental stages to five cryoprotectants[J].Journal of Reproduction&Development,2005,51(2):235.

〔3〕Jin B,Mochida K,Ogura A,et al.Equilibrium vitrification of mouse embryos at various developmental stages[J].Molecular Reproduction&Development,2012,79(11):785–794.

〔4〕Wang,X.,Al Naib,A.,Sun,DW.,et al.,Membrane permeability characteristics of bovine oocytes and development of a step-wise cryoprotectant adding and diluting protocol.Cryobiology,2010.61(1):58-65.

R714；S814.48

A

1673-260X（2017）10-0081-02

2017-07-12

貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2017-16)

黃文竹（1983-），女，博士，講師，貴州醫(yī)科大學(xué)，研究方向：生物信息學(xué)，E-mail：2008elite@163．com