黃茸茸，盧萬鵬，馬鳳余

（安徽新華學院 藥學院，安徽 合肥 230088）

決明子乙酸乙酯提取物對肝纖維化小鼠脂質過氧化水平的影響

黃茸茸，盧萬鵬，馬鳳余

（安徽新華學院 藥學院，安徽 合肥 230088）

目的：研究決明子乙酸乙酯提取物對肝纖維化小鼠脂質過氧化水平的影響.方法：采用腹腔注射0.1%的CCl4花生油溶液建立小鼠肝纖維化模型，采用試劑盒測定血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）的含量；采用分光光度法測定肝組織中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶(SOD)的活性.結果：結果表明，決明子乙酸乙酯提取物低劑量（0.10g/kg）組、中劑量（0.15g/kg）組能減少小鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）的含量，并可減少肝臟中丙二醛（MDA）含量，抑制肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)的活性.結論：決明子乙酸乙酯提取物對肝纖維化小鼠有一定的保護作用，其作用機制可能與抑制脂質過氧化有關.

決明子乙酸乙酯提取物；脂質過氧化；丙二醛；超氧化物歧化酶；肝纖維化

隨著生活節(jié)奏的加快，長期不健康的飲食與作息習慣、工作壓力、食品安全等因素容易造成對肝臟的損傷，而長期的慢性肝病則可能容易導致肝纖維化的產生.肝纖維化是指由各種致病因子所導致的肝臟內部結締組織異常增生，是各種慢性肝病最重要的病理特征，因其可能引發(fā)肝硬化及誘發(fā)原發(fā)性肝癌，肝纖維化的防治目前已成為國內外研究的熱點.目前治療肝臟病變的藥物多以化學藥物為主，由于毒性和副作用較大等原因，對中草藥防治肝纖維化的研究開發(fā)顯得十分迫切.

決明子為豆科植物決明或小決明干燥成熟的種子，性甘、苦、咸，微寒，歸肝、腎、大腸經，具有清熱明目，潤腸通便，保肝護肝等功效，是衛(wèi)生部首批公布的藥食兩用中藥品種之一[1].現(xiàn)代研究主要在決明子有效成分的提取工藝、成分鑒別以及決明子醇提物的肝保護等方面有相關探討，但對決明子的乙酸乙酯提取物對肝臟的保護作用卻未見有報道.本實驗采用CCl4腹腔注射所致小鼠肝纖維化病理模型，研究決明子乙酸乙酯提取物對小鼠肝纖維化的干預作用，并探討其可能的作用機理，將為決明子的開發(fā)利用與臨床治療提供實驗參考.

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑

決明子，藥用，亳州寶豐生物科技有限公司提供；乙醇，分析純，天津市百世化工有限公司；乙酸乙酯，分析純，天津市百世化工有限公司；四氯化碳（CCl4），分析純，天津市百世化工有限公司；花生油，山東魯花壓榨花生油；三氯乙酸，天津天力化學試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，中國天津市巴斯夫化工有限公司；磷酸二氫鈉，分析純，無錫市展望化工試劑有限公司；無水磷酸氫二鈉，分析純，無錫市展望化工試劑有限公司；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供.

1.2 實驗動物

昆明種小鼠，清潔級，雌雄各半，體重20～22g，由省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(皖)：2016-002.

1.3 實驗儀器

RE 52-99旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；FAIO04型電子天平，上海天平儀器廠；HH恒溫水浴鍋，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；1510酶標儀，賽墨飛世爾科技（中國）有限公司；118B型搖擺式中藥粉粹機，瑞安市永歷制藥機械有限公司；LG10-2.4A型超速離心機，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；TGL-16H高速低溫離心機，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；GKC型可控硅恒溫水浴鍋，珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司

2 實驗方法

2.1 決明子乙酸乙酯提取物的制備[2]

將決明子種子粉碎后，取240克，以固體：液體=1:6用95%的乙醇浸泡1小時，60℃加熱回流2小時.然后停止加熱，過濾，并保存濾液.濾渣再加95%乙醇以固體：液體=1:6 60℃加熱回流1.5小時，然后合并濾液，濾液用旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮干燥.提取液真空干燥并溶于水中（加熱溶解）用乙酸乙酯溶劑萃取，分別用乙酸乙酯萃取3-4次合并濾液，使用旋轉蒸發(fā)儀濃縮得乙酸乙酯提取物部分.決明子乙酸乙酯提取物用PH梯度萃取法分離總蒽醌得到三種蒽醌衍生物，之后用Borntrhger顯色反應和紫外分光光度法鑒定得出三種蒽醌衍生物分別為大黃素，大黃酸，蘆薈大黃素.

2.2 實驗分組及給藥

實驗小鼠，共60只，雌雄各半；隨機分為5組，每組12只，分別為空白對照組、肝纖維化模型組、決明子乙酸乙酯提取物低劑量組（0.10g/kg）、決明子乙酸乙酯提取物中劑量組（0.15g/kg）、決明子乙酸乙酯提取物高劑量組（0.20g/kg）.決明子乙酸乙酯提取物低、中、高三劑量組每天灌胃給藥一次，共14天.空白組與肝纖維化模型組每天用等容量生理鹽水灌胃.

2.3 小鼠肝纖維化模型制備[3-5]

給藥結束后，除了空白對照組，肝纖維化模型組、決明子乙酸乙酯提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠分別腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液0.2mL/10g，每周兩次，共6周.空白對照組不作處理.6周后，隨機取小鼠解剖HE染色觀察其肝纖維化以判斷造模情況.

2.4 指標檢測

眼球取血，血液樣本放入高速冷凍離心機中，4℃，10000rpm，10min，取上清液，得血清備用.

頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟剪碎并稱取肝臟，在每克肝臟中加入0.05mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液10mL，于研缽內冰浴研磨成勻漿，再定容至10mL刻度離心管中得到肝臟勻漿備用.

2.4.1 丙二醛（MDA）含量的測定[5-8]

取肝臟勻漿2mL加入8mL 10%三氯乙酸（TCA）繼續(xù)研磨均勻.勻漿在高速冷凍離心機4℃，4000rpm，10min，上清液即為MDA提取液.

取10ml刻度試管2支，一支加入上清液3mL，另一支加水3mL(空白)，各加入0.5%的硫代巴比妥酸（TBA）溶液 3ml，搖勻，在沸水浴中煮沸 10min(從溶液中出現(xiàn)小氣泡時開始計時)，立即浸入冷水中冷卻.如有存在沉淀，應離心處理.以空白作參比，在分光光度計450nm、532nm、600nm下測定樣品的吸光度值(用1cm光徑的比色杯).

實驗結果根據下列公式計算：

式中各因子代表內容如下：

OD532、OD600、OD450：450nm、532nm、600nm波長下的吸光度

C(μmol·L-1)：提取液中 MDA 的濃度(μmol·L-1)

V：提取液的總體積(ml)

W：肝臟鮮重(g)

2.4.2 超氧岐化酶（SOD）活性測定[9-10]

取肝臟勻漿至5mL的離心管中，放入高速冷凍離心機中，10000r/min，4℃離心 40min，上清液即為超氧岐化酶（SOD）粗提液.

取8個洗凈干燥好的燒杯編號，按表1順序加入試劑及酶液，反應系統(tǒng)總體積為3mL.其中4-8號杯中的酶液量和磷酸鈉緩沖液量可根據試驗材料中酶液濃度和酶的活力進行調整.

表1 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定（單位：ml）

表中試液：

（1）0.1 mol/L pH7.0 磷 酸 鈉（Na2HPO4-NaH2PO4）緩沖液

（2）0.02 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸鈉緩沖液

（3）6.5×10-4mol/L氯化硝基四氮唑藍(NBT)溶液

（4）含1.0μmol/L EDTA的2×10-5mol/L核黃素溶液

（5）0.05mol/L pH7.5磷酸鈉緩沖液

全部加入各試劑后，混勻充分，取1號燒杯作為空白對照置于黑暗處，，比色時調零用.其余7個微燒杯均置于25℃，光強為4500Lux的光照箱內照光15min，然后遮光反應終止.在560nm波長下用1號杯調零，測定各杯光密度值.以2、3號杯液光密度的平均值作為抑制氯化硝基四氮唑藍（NBT）光還原率100%，根據其他光密度計算出不同酶液量的各反應系統(tǒng)中抑制NBT光還原的相對百分率.以抑制NBT光還原相對百分率為縱坐標，以酶液用量為橫坐標，做出二者相關曲線.

超氧岐化酶（SOD）活力按下式計算：

式中各因子代表內容如下：

A：酶活力值（酶活力單位：U/g（FW）·h）；

V：酶提取液總體積（mL）；

B：一個酶活力單位的酶液量（μL）；

W：肝臟重（g）；

T：反應時間（min）；

1000：1mL=1000μL；

60：1h=60min.

2.4.3 血清檢測

用酶聯(lián)免疫試劑盒分別檢測血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）的含量.

2.5 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 決明子乙酸乙酯提取物對肝組織丙二醛(MDA)、超氧岐化酶(SOD)的影響

由表2所示，與空白對照組比較，肝纖維化模型組呈顯著化差異，說明肝纖維化模型造模成功.與模型組比較，決明子乙酸乙酯提取物低、中、高三劑量組均能明顯降低小鼠肝臟中丙二醛 (MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性，說明其可抑制脂質過氧化水平.

表2 決明子乙酸乙酯提取物對肝組織丙二醛(MDA)、超氧岐化酶(SOD)的影響（±s,n=12）

表2 決明子乙酸乙酯提取物對肝組織丙二醛(MDA)、超氧岐化酶(SOD)的影響（±s,n=12）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

丙二醛（M D A）含量μ m o l·g-1 F W組別 劑量（g/k g）超氧岐化酶(S O D)酶活力U/g（F W）·h空白對照組 - 0.7 3 2 1 7 9.2 7肝纖維化模型組 - 3.4 1△△ 1 5 9.5 8△△低劑量組 0.1 0.8 6 1** 1 8 1.1 1**中劑量組 0.1 5 0.9 8 1** 1 8 5.3 5**高劑量組 0.2 1.2 0 7* 1 7 1.2 1*

3.2 決明子乙酸乙酯提取物對小鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）含量的影響

由表3所示，與空白對照組比較，肝纖維化模型組呈顯著性差異.與肝纖維化模型組比較，決明子乙酸乙酯提取物低劑量組和中劑量組可明顯降低小鼠血清中的谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）含量，說明其對肝臟具有一定的保護作用.

表3 決明子乙酸乙酯提取物對小鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）含量的影響（X±S,n=12）

4 討論

四氯化碳(CCl4)腹腔注射法致肝損傷是一種較為經典的肝臟病理模型，其主要作用機制是四氯化碳(CCl4)進入機體內會在肝細胞色素P-450酶的作用下產生大量可損傷肝細胞膜的自由基，自由基與肝細胞內大分子物質發(fā)生共價結合，從而導致肝纖維化.本實驗采用小鼠腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液造模，結果顯示模型組與空白組比較有顯著性差異，造模成功且穩(wěn)定性好.

脂質過氧化的最終產物是丙二醛（MDA），其可嚴重破壞細胞膜，其含量的高低可反應出氧化的損傷程度大小[11]；超氧化物歧化酶（SOD）是存在于細胞內自由基清除的主要抗氧化酶，其可抑制脂質過氧化反應，從而起到細胞膜保護的作用.本實驗采用分光光度法測定肝臟中丙二醛含量，采用氯化硝基四氮唑藍（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活力.實驗結果顯示，決明子乙酸乙酯提取物高劑量（0.2g/kg）、中劑量（0.15g/kg）和低劑量（0.1g/kg）均能明顯降低肝臟中丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶活力，具有較好的抑制脂質過氧化作用.

血清中反映肝細胞損傷的指標主要包括血清酶類及血清鐵等，其中以血清酶檢測最為常用，如谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ- 谷氨酰轉肽酶（γ-GT）等.臨床表明，各種酶試驗中，以谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）能敏感地提示肝細胞損傷及其損傷程度.ALT、AST、ALP在血清中含量越高，則肝臟損傷的程度越高.本實驗研究顯示，決明子乙酸乙酯提取物中劑量（0.15g/kg）、低劑量（0.1g/kg）組能夠明顯降低血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）的含量，說明其對肝損傷具有較好的保護作用.而決明子乙酸乙酯提取物高劑量（0.2g/kg）組的數(shù)據顯示其可加劇肝臟的損傷，后期實驗將進一步研究分析其原因.

綜上所述，決明子乙酸乙酯提取物對小鼠肝臟纖維化具有一定的保護作用，其機制可能與決明子

抑制脂質過氧化有關.根據本實驗結果可得出給藥劑量在0.1g/kg至0.15g/kg能夠安全有效地抑制小鼠肝纖維化，具有較好的肝臟保護作用.

〔1〕徐義龍.決明子化學成分及炮制對其影響研究[D].中國中醫(yī)科學院,2014.1-13.

〔2〕晉亞楠.決明子治療糖尿病并發(fā)癥的活性及氧化應激機制研究[D].西南大學,2012.5-32.

〔3〕朱安妮,李蕊,劉三海,等.四氯化碳誘導小鼠急性肝損傷模型的建立和優(yōu)化[J].中國肝臟病雜志(電子版),2014,1(06):27-31.

〔4〕鄺滿元,劉映霞,李映菊.肝纖維化動物模型造模方法的研究進展 [J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2008,9(08):1768-1770.

〔5〕王金娥,姜慧杰.制備不同種類肝纖維化及肝硬化動物模型研究進展[J].實用肝臟病雜志,2011,52(01):68-71.

〔6〕張秋萍,吳霞紅,鄭劍恒，等.生物樣本中丙二醛測定方法的研究進展[J].理化檢驗(化學分冊),2016,2(08):979-985.

〔7〕趙穎,朱寶亮,李冬芹，等.熒光光譜法測定大鼠肝組織中丙二醛含量的方法改進[J].中國老年學雜志,2015,24(15):4165-4166.

〔8〕劉仲奇,胡永芳.脂質過氧化產物—丙二醛的簡便測定[J].甘肅中醫(yī)學院學報,2001,18(3):13-15.

〔9〕曲敏,秦麗楠,劉羽佳等.兩種檢測 SOD 酶活性方法的比較 [J].食品安全質量檢測學報,2014,5(10):3318-3323.

〔10〕王志鑫，孔維寶.大蒜超氧化物歧化酶(SOD)的提取及分離純化方法研究綜述[J].甘肅農業(yè)科技,2010,3(10):47-49.

〔11〕周琪，梁運祥.動物肝組織中丙二醛含量測定方法的改進[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(1):224-225.

R285.5

A

1673-260X（2017）10-0072-04

2017-06-25

2015年安徽新華學院校級自然科研項目（2015zr009）