郭靜

(荊州市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 荊州 434100)

那他霉素單獨(dú)與聯(lián)合氟康唑或伊曲康唑的體外抗念珠菌效應(yīng)

郭靜

(荊州市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 荊州 434100)

目的：測定臨床分離的念珠菌對抗真菌藥物那他霉素(natamycin，NAT)的敏感性，并研究NAT分別和氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LU)、伊曲康唑(itraconazole， ITC)聯(lián)合抗念珠菌效應(yīng)。方法：參考美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical Laboratory Standard Institute, CLSI)M27-A3方案測定NAT、FLU和ITC 對40株念珠菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，同時以棋盤法測定NTA分別和FLU或ITC 聯(lián)合抗真菌作用。結(jié)果：微量液基稀釋法測得NAT、FLU和ITC對白念珠菌(15株)MIC范圍分別為：2.0～4.0、2～64μg/mL和2～16μg/mL；對克柔念珠菌(5株)MIC范圍分別為：2.0～4.0、16～64μg/mL和0.5～2μg/mL；對光滑珠菌(10株)MIC范圍分別為：1.0～4.0、4～32μg/mL和1～4μg/mL；對熱帶念珠菌(10株)MIC范圍分別為：2.0、1～4μg/mL和0.5～2μg/mL。NAT與FLU在體外聯(lián)合應(yīng)用時，對67%(10/15)的白念珠菌、40%(4/10)的光滑念珠菌和對50%(5/10)的熱帶念珠菌變現(xiàn)為協(xié)同作用；NAT與ITC在聯(lián)合應(yīng)用時，對33%(5/15)的白念珠菌、20%(1/5)的克柔念珠菌和60%(6/10)的光滑念珠菌和對40%(4/10)的熱帶念珠菌變現(xiàn)為協(xié)同作用；NAT與FLU或ITC在體外聯(lián)合應(yīng)用時，對所有菌株均無拮抗作用。結(jié)論：念珠菌在體外對NAT敏感，當(dāng)NAT與FLU或ITC聯(lián)合時，對部分念珠菌有聯(lián)合效應(yīng)，無拮抗效應(yīng)。

念珠菌；那他霉素；體外聯(lián)合藥敏

粘膜念珠菌病主要見于婦女外陰陰道(VVC)和免疫功能受損患者的口腔、咽喉粘膜。霉菌性陰道炎是婦科常見病和多發(fā)病，有學(xué)者研究，近年來霉菌性陰道炎感染率呈逐年增加趨勢。其主要臨床表現(xiàn)為陰道白帶多，呈豆腐渣樣，外陰瘙癢及灼痛等，嚴(yán)重影響女性生活及健康。常見的誘發(fā)因素有糖尿病、應(yīng)用免疫抑制劑及廣譜抗生素等，治療效果欠佳，復(fù)發(fā)率高[1]。白念珠菌是主要的病原菌，目前可以應(yīng)用治療的抗真菌藥物有氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)LU)、伊曲康唑(Itraconazole, ITC)、制霉菌素等，近年來還發(fā)展問世了伏立康唑、卡泊芬凈以及脂質(zhì)劑型的兩性霉素B。盡管抗真菌藥物的發(fā)展十分迅速，VVC的藥物治療效果仍不盡理想，復(fù)發(fā)率高。而復(fù)發(fā)性霉菌性陰道炎在西醫(yī)臨床學(xué)中是指婦女外陰陰道被念珠菌感染，即外陰陰道念珠菌病。一般臨床表現(xiàn)為外陰瘙癢、有疼痛感、白帶增多、濃稠等[2]。一般取樣病原學(xué)檢查可得出念珠菌陽性，經(jīng)過治療一段時間后，再次出現(xiàn)上述癥狀和病原學(xué)檢查結(jié)果為陽性，則可診斷為復(fù)發(fā)性霉菌性陰道炎。1 年內(nèi)復(fù)發(fā)次數(shù)為4 次或者超過4 次以上的患者則為復(fù)發(fā)性外陰陰道念珠菌病。由于抗生素長期應(yīng)用容易產(chǎn)生依賴性，同時，抗生素耐藥菌譜的增加使得陰道炎的治療更加難以徹底，容易復(fù)發(fā)。近年來，唑類藥物交叉耐藥的白念珠菌和對FLU不敏感的非白念珠菌感染率增加，導(dǎo)致臨床治療效果下降。那他霉素(Natamycin，NAT)是一種多烯烴大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌藥物，對曲霉、鐮刀菌和念珠菌都有較好的抗菌效果。5% NTA滴眼液廣泛用于角膜真菌感染，少量的NAT也可以作為食物防腐劑。目前，僅有少量文獻(xiàn)報道利用低濃度NTA治療口腔念珠菌病，體外藥敏實(shí)驗研究也很少。為開發(fā)新型治療粘膜念珠菌病的治療方案，以便為臨床上更好的治療粘膜念珠菌病提供理論基礎(chǔ)，我們參照美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical Laboratory Standard Institute, CLSI)頒布的M27-A3方案，以微量液基稀釋法測定[3]40株從粘膜念珠菌病患者分離的念珠菌對NTA、FLU和ITC敏感性。在此基礎(chǔ)上，我們嘗試聯(lián)合應(yīng)用NTA與FLU或ITC，觀察體外聯(lián)合效應(yīng)，希望對該類菌所致感染的抗真菌治療可以提供一定幫助。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗菌株

40株臨床分離株均保藏于我院化驗室微生物恒溫培養(yǎng)箱，每株菌均經(jīng)過CHROMagar顯示培養(yǎng)基和API-20C-AUX進(jìn)行鑒定。在試驗前均在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)斜面上活化(35℃，7d)，以保證受試真菌的活力與純度[3]。

1.2 抗真菌藥物

ITC(西安楊森制藥有限公司，批號國藥準(zhǔn)字H20020367)，NTA(Sigma Chemical Co，St. Louis，批號：P9703，純度：>95%)和FLU(廣東彼得藥物有限公司，批號國藥準(zhǔn)字H20059399)。將脂溶性藥物(ITC和NTA)以分析純度的DMSO溶解成儲存液，濃度均為1600μg/mL。用無菌用水將FLU制成濃度為1280μg/mL的儲存液，存于-30℃冰箱備用。

1.3 微量液基稀釋法

參考美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所(Clinical Laboratory Standard Institute, CLSI)M27-A3方案，近平滑念珠菌ATCC22019作為試驗的質(zhì)控菌株。實(shí)驗用培養(yǎng)基經(jīng)三氮嗎啡啉丙磺酸鈉(MOPS)緩沖后調(diào)pH值為7.0的RPMI1640液體培養(yǎng)基，過濾滅菌。將受試的念珠菌接種在PDA上，置于35℃培養(yǎng)2d后用無菌生理鹽水收集孢子，以血細(xì)胞計數(shù)板調(diào)整孢子量為(1～3)×106CFU/mL。然后以RPMI1640液體培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋1000倍，致接種終濃度為(1～3)×103CFU/mL。將含有倍比稀釋到2倍于最終濃度受試藥物的藥敏試驗用96孔板每孔中加入100μL稀釋藥物和100μL菌懸液。同時設(shè)立生長對照(無藥物孔)和陰性對照(無菌孔)，于35℃孵育48h。然后肉眼觀察判讀結(jié)果，NTA的最低抑菌濃度(MIC)定義為肉眼觀察到的無真菌生長的最低藥物濃度。FLU和ITC的MIC定義為肉眼觀察到的與生長對照相比50%抑制的最低藥物濃度。所有藥敏試驗均重復(fù)操作2遍[4]。

1.4 聯(lián)合藥敏

藥物聯(lián)合采用棋盤法，即在96孔板中分別加入不同濃度的兩種藥物。自左向右1～8列為聯(lián)合用藥區(qū)，每孔加入藥物倍比稀釋液各50μL。第1～8列為NTA，藥物終濃度為8～0.06μg/mL，每列濃度一致。與ITC或FLU聯(lián)合時，第1～8行分別加入藥物至終濃度分別為(4～0.03)μg/mL、(64～0.25)μg/mL，每行濃度一致。第9、10列為單獨(dú)用藥區(qū)，藥物終濃度梯度同聯(lián)合區(qū)。同時設(shè)立生長對照和空白對照。接種時除陰性對照孔外其余各孔均加入100μL的2倍終濃度的菌懸液，35℃孵育48h后觀察結(jié)果。分?jǐn)?shù)抑菌濃度(FIC)的判定：與生長對照孔相比，生長100%抑制所對應(yīng)的最低藥物濃度，包括各藥物單獨(dú)和聯(lián)合時的MIC值。聯(lián)合用藥時各藥物的MIC值分別除以單獨(dú)用藥時MIC值的商的和，即分?jǐn)?shù)抑制濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)=MIC A聯(lián)合/MIC A單獨(dú)+MIC B聯(lián)合/MIC B單獨(dú)。相互作用解釋為：FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.54為拮抗。所有藥敏試驗均重復(fù)操作2遍[5]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

通過每種藥物對不同菌株的MIC值求出能夠抑制50%菌株的MIC值(MIC50)和抑制90%菌株的MIC值 (MIC90)。

2 結(jié)果

2.1 微量液基稀釋法測定結(jié)果

NAT、FLU和ITC對白念珠菌MIC范圍分別為：2～4、2～64μg/mL和2～16μg/mL；對克柔念珠菌MIC范圍分別為：2～4、16～64μg/mL和0.5～2μg/mL；對光滑珠菌MIC范圍分別為：1～4、4～32μg/mL和1～4μg/mL；對熱帶念珠菌MIC范圍分別為：2、1～4μg/mL和0.5～2μg/mL。各藥MIC50、MIC90見表1。

2.2 聯(lián)合藥敏

NAT與FLU在體外聯(lián)合應(yīng)用時，對67%(10/15)的白念珠菌、40%(4/10)的光滑念珠菌和對50%(5/10)的熱帶念珠菌變現(xiàn)為協(xié)同作用；NAT與ITC在聯(lián)合應(yīng)用時，對33%(5/15)的白念珠菌、20%(1/5)的克柔念珠菌和60%(6/10)的光滑念珠菌和對40%(4/10)的熱帶念珠菌變現(xiàn)為協(xié)同作用；NAT與FLU或ITC在體外聯(lián)合應(yīng)用時，對所有菌株均無拮抗作用。數(shù)據(jù)見表1。

表1 NTA與FLU或ITC體外聯(lián)合抗念珠菌藥敏結(jié)果

注：NTA，那他霉素；FLU，氟康唑；ITC，伊曲康唑；MIC，最低抑菌濃度；FICI，部分抑制濃度指數(shù)(≤0.5協(xié)同，>0.5和≤4.0無關(guān)，>4拮抗)。

3 討論

粘膜念珠菌病是指由念珠菌所致的感染，主要包括口腔念珠菌病和VVC，前者主要見于免疫力受損患者或者免疫力低下的嬰幼兒。而VVC則主要見于青春期后女性，此類病主要由白念珠菌引起。由于FLU水溶性好，毒副作用低，因此是這類疾病主要的治療藥物，但是隨著FLU的應(yīng)用增加，臨床上出現(xiàn)大量對FLU耐藥的白念珠菌，甚至出現(xiàn)對唑類交叉耐藥的白念珠菌。此外，非白念珠菌如光滑念珠菌、克柔念珠菌的臨床感染率也在逐漸增加，使得臨床治療變得棘手。

NTA作為多烯類抗真菌藥物，可以由Streptomyces natalensis等鏈霉菌發(fā)酵生成獲得。NTA分子量大、溶解度低，不易被人體吸收，無任何潛在過敏性。其作用機(jī)制是通過和細(xì)胞膜中的甾醇，尤其是麥角固醇形成一種復(fù)合物，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變進(jìn)而殺死真菌細(xì)胞。通過微量液基稀釋法，我們觀察到NTA對白念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌的MIC范圍分別為2.0～4、2.0～4、1～4μg/mL和2μg/mL。說明其在體外對念珠菌有一定的活性，可以作為局部治療粘膜念珠菌病的有效藥物。目前，不同機(jī)制的抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用已是臨床真菌病治療的重要發(fā)展趨勢，即通過聯(lián)合應(yīng)用不同抗真菌藥物，從而降低藥物的使用劑量，進(jìn)而減輕毒副作用而不降低療效。臨床上，5%NTA滴眼液可聯(lián)合FLU用于治療角膜真菌感染，能夠取得較好的臨床效果。因此，我們檢測NTA和ITC或FLU對念珠菌的聯(lián)合效應(yīng)。

唑類藥物FLU由于其較好的水溶性，毒副作用小而廣泛用于粘膜念珠菌病的治療，然而隨著耐藥菌株的出現(xiàn)和臨床治療耐藥率、復(fù)發(fā)率的增加，單獨(dú)應(yīng)用FLU治療已經(jīng)不能滿足臨床需求。ITC由于其高親脂性和親角質(zhì)性，廣泛應(yīng)用于皮膚、皮下組織以及富含脂質(zhì)組織的真菌感染。當(dāng)NTA與FLU聯(lián)合時，對67%(10/15)的白念珠菌、40%(4/10)的光滑念珠菌和對50%(5/10)的熱帶念珠菌變現(xiàn)為協(xié)同作用，能夠有效的降低FLU和NTA的MIC值(表1)，提示可以聯(lián)合用于粘膜念珠菌病的治療。NAT與ITC在聯(lián)合應(yīng)用時，對33%(5/15)的白念珠菌、20%(1/5)的克柔念珠菌和60%(6/10)的光滑念珠菌和對40%(4/10)的熱帶念珠菌表現(xiàn)為協(xié)同作用。NAT與FLU或ITC在體外聯(lián)合應(yīng)用時，對所有菌株均無拮抗作用。

總之，我們在本試驗中通過微量液基稀釋法測得NTA對念珠菌屬具有一定的體外殺菌活性，而且NAT與ITC或FLU聯(lián)合應(yīng)用時對部分念珠菌有聯(lián)合效應(yīng)，這些數(shù)據(jù)資料能為臨床治療提供一定的幫助。但是，體外藥敏結(jié)果與臨床藥物治療效果之間的一致性仍需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗和臨床實(shí)踐來證實(shí)。

[1]李曉梅，宋立峰，李紅艷，等.中藥組方聯(lián)合達(dá)克寧栓治療復(fù)發(fā)性霉菌性陰道炎的臨床研究[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015, 10(1):59～61.

[2] 卞雪.克霉唑陰道片聯(lián)合應(yīng)用氟康唑治療復(fù)發(fā)性霉菌性陰道炎的療效觀察[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué), 2015(19): 131～132.

[3] 陳淳，陳啟紅，孫毅，等.低濃度他克莫司與抗真菌藥物聯(lián)合的體外抗真菌效應(yīng)[J].中國真菌學(xué)雜志, 2015, 10(4):207～209.

[4] 劉偉，喬建軍，萬結(jié)，等.耐伊曲康唑煙曲霉臨床分離株對四種抗真菌藥物的敏感性測定[J].中華皮膚科雜志, 2007, 40(12):722～724.

[5] 王玉連，張璐璐，秦玉璘，等.利福噴丁對氟康唑體外抗耐藥白念珠菌的增效作用[J].中國真菌學(xué)雜志, 2016, 11(3):156～159.

2017-06-21

郭靜(1983-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作，49750726@qq.com。。

[引著格式]郭靜.那他霉素單獨(dú)與聯(lián)合氟康唑或伊曲康唑的體外抗念珠菌效應(yīng)[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版), 2017,14(20):44～47.

R711.31

A

1673-1409(2017)20-0044-04

[編輯] 何勇