向星亮，王玄源，時慶欣

(湖北中醫(yī)藥大學藥學院，湖北 武漢 430069)

金姝娜

(華中科技大學同濟醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，湖北 武漢 430038)

宋成武，黃榮增

(湖北中醫(yī)藥大學藥學院，湖北 武漢 430069)

四川省遂寧和樂山地區(qū)姜黃中微量姜黃素含量的差異性研究

向星亮，王玄源，時慶欣

(湖北中醫(yī)藥大學藥學院，湖北 武漢 430069)

金姝娜

(華中科技大學同濟醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，湖北 武漢 430038)

宋成武，黃榮增

(湖北中醫(yī)藥大學藥學院，湖北 武漢 430069)

目的：對道地產地四川省兩個不同地區(qū)(遂寧和樂山)中藥材姜黃中的微量姜黃素類成分進行相對定量分析。方法：應用LC-QTRAP-MRM靶標性特征輪廓譜技術，根據(jù)已建立的姜黃素輪廓譜，對其中93種微量姜黃素類成分含量進行測定。結果：88種微量姜黃素類成分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，3種無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，2種化合物未被檢測到。結論：微量姜黃素中具有統(tǒng)計學差異的微量姜黃素類成分可為區(qū)分遂寧和樂山地區(qū)道地藥材姜黃提供理論依據(jù)；無統(tǒng)計學差異的3種成分可為遂寧和樂山地區(qū)微量姜黃素共有指標質量控制提供理論依據(jù)。

姜黃；液質聯(lián)用；微量姜黃素；質量控制

姜黃為姜科植物姜黃CurcumalongaL．的干燥根莖，是我國傳統(tǒng)的臨床常用中藥材，味辛苦，性溫，無毒，有行氣破瘀，通經(jīng)止痛之功效[1]。姜黃中的主要藥用活性成分為姜黃素類化合物，姜黃素具有調節(jié)血脂、抑制腫瘤、抑制病毒、消除炎癥、清除自由基、利膽等眾多藥理作用[2～4]，可用于眾多藥品和保健品。姜黃在我國種植廣泛，主要集中于四川、福建、湖南、廣東、云南、貴州以及臺灣等地。姜黃作為道地川藥，以四川遂寧市、樂山市等為道地產區(qū)，現(xiàn)代研究也已證明道地姜黃中的藥理活性成分顯著高于非道地藥材[5,6]。

姜黃中的姜黃素類成分主要為姜黃素(curcumin)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)、雙去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin)3種主要姜黃素[7,8]，目前姜黃藥材的質量控制方法中也以這3種主要姜黃素為標準[9]。研究表明，除了這3種主要姜黃素外，姜黃中還含有多種的微量姜黃素類化合物，而且目前眾多文獻表明這些微量姜黃素具有更好的生物活性[10,11]。本實驗通過項目前期已經(jīng)建立的基于LC-QTRAP-MRM靶標性特征輪廓譜技術[12]對四川省遂寧和樂山地區(qū)姜黃提取物中的93種微量姜黃素類成分的相對含量進行進行分析，為該地區(qū)中藥材姜黃質量控制提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃根莖于2011年8月購買自廣東肇慶宏志達農副產品有限公司，由湖北中醫(yī)藥大學生藥資源教研室鑒定。甲醇(色譜純，美國Fisher公司)，乙腈(色譜純，美國Fisher公司)，甲酸(分析純，國藥集團)，Millipore超純水。

1.2 儀器設備與軟件

液質聯(lián)用儀(質譜): AB Sciex 4000 QTRAP、液質聯(lián)用儀(液相): Shimadzu 30A系列、PeakView 1.2軟件、GraphPad Prism 6軟件。

1.3 方法

1.3.1樣品溶液的制備

將姜黃根莖研磨成細粉，精確稱取1g姜黃粉末，加入10mL濃度為80%的甲醇溶液，劇烈渦旋2分鐘，然后超聲處理5min。將超聲后的混合物離心，并小心地將上清液作為提取物吸出。再分別用50%濃度的甲醇溶液10mL和100%純甲醇溶液10mL重復上述過程提取，將3次的提取物混合，再加入非索非那定標準品(500ng/mL)作為內標物，搖勻后過微孔濾膜，得到樣品溶液。以上操作皆須避光操作，以免姜黃素光降解[13]。

1.3.2微量姜黃素含量測定

LC-QTRAP-MS/MS的質譜模式為電噴霧正離子模式，參數(shù)優(yōu)化如下：ion source temperature, 600℃; ion spray voltage, 4500V; curtain gas, 30psi; nebulizer gas (GS 1), 50psi; heater gas (GS 2), 50psi; declustering potential (DP), 80V; a collision cell exit potential, 10V; a dwell time, 8ms; CE, 35eV; CES, 10eV。

利用基于LC-QTRAP-MRM模式的姜黃素輪廓譜進行相對定量分析，其中每個特異的MRM離子對和保留時間代表了一種已鑒定的姜黃素類成分。將2個地區(qū)各3批樣品分別按上述方法制樣，平行進樣3次，得出峰面積數(shù)據(jù)。將樣品峰面積和內標物峰面積比值(Ag/As)作為相對含量進行平行比較。

2 結果

2.1 數(shù)理統(tǒng)計分析

將93種微量姜黃素類化合物的相對峰面積進行統(tǒng)計，有2種化合物未被檢測到；有56種化合物相對含量較低，平均相對峰面積小于1；有31種化合物相對含量中等，平均相對峰面積在1～50之間；有4種化合物相對含量較高，平均相對峰面積大于50。且同一地區(qū)的3批樣品的微量姜黃素類化合物相對峰面積較接近，含量差異不明顯；而不同地區(qū)間的微量姜黃素類化合物含量差異較大。

2.2 單因素方差分析

將所得6組相對峰面積數(shù)據(jù)運用GraphPad Prism 6軟件進行單因素方差分析，結果如表1、圖1。

表1 不同地區(qū)姜黃中微量姜黃素含量單因素方差分析結果

其中54號、60號、64號化合物P值分別為0.2853、0.0511、0.0644，表示此3種微量姜黃素在道地藥材中的含量無顯著性差異(P>0.05)；22號、40號化合物P值分別為0.0109、0.0261(0.05>P>0.01)；余下84種化合物P值都小于0.01，表示這些姜黃素在道地藥材中的含量存在統(tǒng)計學差異。

圖1 單因素方差分析P>0.01的5種姜黃素類成分相對含量分布

本實驗對6批分別來自四川遂寧和四川樂山的道地姜黃中的93種微量姜黃素類化合物進行了含量測定，結果表明此3種姜黃素類化合物：5-hydroxy-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)hept-1-en-3-one, methoxyphenyl)-1-(4-hydroxyphenyl)hept-1-en-3-one, 5-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy-5-methoxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)hept-1-en-3-one不存在統(tǒng)計學差異。此3種微量姜黃素類化合物結構如下圖2所示。

圖2 無統(tǒng)計學差異(P>0.05)的3種微量姜黃素類成分化學結構

3 討論

傳統(tǒng)的定性和定量分析方法如HPLC，在定性和定量分析微量化合物時存在分離度不好、靈敏度低、抗干擾能力差、樣品前處理較復雜等缺點，無法對如微量化合物進行有效的鑒定和分析[14]。而本實驗采用基于LC-QTRAP-MRM模式的姜黃素類成分特征輪廓譜進行相對定量分析，使用多重反應監(jiān)測(MRM)在同時選定母離子和子離子的情況下進行碰撞誘導，避免了其它離子的干擾，只對特征輪廓譜中的離子對進行質譜信號采集。LC-QTRAP-MRM模式具有高靈敏度，高選擇性和寬泛的線性范圍等優(yōu)點，故可高效地應用于微量化合物的含量測定[15,16]。

目前中藥質量控制方法主要集中在主要成分上，往往忽略了某些活性更好但含量很少的同類別微量化合物，姜黃中的微量姜黃素類成分已被證明具有更好的生物活性[17]。本實驗篩選的具有顯著差異的微量姜黃素類成分可為區(qū)分遂寧和樂山地區(qū)道地藥材姜黃提供理論依據(jù)；無統(tǒng)計學差異的3種成分可為遂寧和樂山地區(qū)微量姜黃素共有指標質量控制提供理論依據(jù)。同時，項目后期將會繼續(xù)分離本實驗中篩選出的微量姜黃素類成分，以期用于不同地區(qū)微量姜黃素類成分的絕對定量分析。

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2017-09-11

國家自然科學基金青年基金項目(81603331)。

向星亮(1995-)，男，碩士生，主要方向為中藥藥效物質篩選及作用機理研究。通信作者：宋成武，songchengwu2000@163.com；黃榮增，hrz0909@163.com。

[引著格式]向星亮，王玄源，時慶欣，等. 四川省遂寧和樂山地區(qū)姜黃中微量姜黃素含量的差異性研究[J].長江大學學報(自科版), 2017,14(20):1～4.

R917；R284

A

1673-1409(2017)20-0001-04

[編輯] 一凡