郭曉寧 王俊平 孫 燕 張玉婷 馬 躍

咖啡對小鼠精子質量的急性影響

郭曉寧1王俊平2孫 燕2張玉婷1馬 躍2

目的 探討咖啡對小鼠精子質量的急性影響。方法 健康雄性昆明種小鼠40只，隨機分為對照組和咖啡低、中、高劑量組，每天分別予10 ml/kg 0.9%氯化鈉注射液、7.5 mg/kg、15 mg/kg和30 mg/kg咖啡灌胃；7 d后處死小鼠，檢測各組小鼠的體重變化、臟器系數；顯微鏡下計數小鼠的精子數量、精子活動率、精子存活率、精子畸形率。結果 低、中、高劑量組小鼠體重、肝臟系數、睪丸系數、附睪系數、精子活動率、精子存活率、精子畸形率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。但中、高劑量組小鼠的精子數量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 咖啡對小鼠存活、活性和形態(tài)無明顯影響，但大量攝入可致小鼠精子數量減少。

咖啡；精子；臟器系數；精液質量；急性

隨著我國生育政策的放開，人們生活水平的提高，優(yōu)生優(yōu)育越來越得到重視。飲食與人類健康息息相關，尤其對優(yōu)生優(yōu)育的影響引起人們的廣泛關注?？Х纫蚱淞己玫目诟泻吞嵘裥涯X作用廣為人們喜愛，是世界上廣泛飲用的飲品之一，其主要成分是咖啡因，具有諸多對身體有益的生理功能，如提神醒腦、抗憂郁、控制體重、預防癌癥等[1]，能刺激中樞神經系統(tǒng)、心臟和呼吸系統(tǒng)。但是，有關咖啡對生殖功能的影響尚未見報道。本試驗以健康雄性昆明小鼠為研究對象，通過灌胃不同劑量的咖啡，觀察小鼠體重變化，計算肝臟、睪丸和附睪的臟器系數，同時觀察比較精子數量、存活率、活動率及精子形態(tài)的改變，評價咖啡對小鼠精子質量的急性影響，初步探討咖啡對小鼠是否具有生殖毒性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 選擇 7～8周齡健康的 SPF級昆明種雄性小鼠40只，體重29～36 g，購自沈陽醫(yī)學院實驗動物中心。按體重隨機分成 4個組別，即對照組10只、咖啡低劑量組10只、咖啡中劑量組10只和咖啡高劑量組10只。

1.2 主要儀器與試劑 MoticBA310-motic advanced 3.2顯微成像系統(tǒng)（motic）；HH?S112恒溫水浴箱（江蘇省醫(yī)療器械）；JJ2000Y型電子天平（常熟市雙杰測試儀器）。市售雀巢咖啡（東莞雀巢有限公司生產，批號：20160423），ART-1006精子沖洗培養(yǎng)液（Sage In-Vitro Fertilization，Inc.生產，批號：16190191），1%伊紅溶液。

1.3 方法 咖啡濃度的設定參照成年人每天1杯咖啡的量，設定灌胃小鼠的低劑量為7.5 mg/kg，中劑量為15 mg/kg，高劑量為30 mg/kg。對照組為10 ml/kg的0.9%氯化鈉注射液。每天定時給對照組小鼠0.3 ml 0.9%氯化鈉注射液灌胃，給低、中、高劑量組小鼠分別以0.3 ml不同濃度的咖啡灌胃，連續(xù)灌胃7 d，7d后處死，檢測相關指標。

1.4 體重變化測定 分別稱量每只小鼠灌胃前的體重和灌胃7 d后的體重，體重變化（g）=灌胃后體重（g）－灌胃前體重（g）。

1.5 臟器系數測定 將小鼠摘眼球取血并脫臼處死，分離其肝臟、附睪和睪丸，分別稱重，計算各臟器系數。臟器系數=臟器濕重（g）/小鼠體重（g）×100%。

1.6 精液質量分析 將分離的左側附睪用眼科剪橫切一次，縱切兩次，放入EP管（0.2 ml精子緩沖液），放入37 ℃恒溫箱30 min，待精子自由游出。

1.6.1 精子活動率和精子存活率 22 ℃室溫下，取10 μl新鮮制備的精子懸液滴于血細胞計數板上，測量精子活率，10min內結束。將精子活動分為四級：Ⅰ級快速、直線的前向運動，Ⅱ級慢速或遲鈍的直線或非直線前向運動，Ⅲ級不向前的運動，Ⅳ級不活動。精子活動率（%）=（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）精子數/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ）精子數×100%。精子存活率（%）=（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ）精子數/檢查的精子數×100%。

1.6.2 精子計數 取精子懸液65 ℃水浴孵育10 min后，取10 μl于血細胞計數板計數池內，根據紅細胞計數法，計數精子數，換算成精子相對密度進行比較。

1.6.3 精子畸形率 參考范瑞泉等[2]改良的方法，將剩余的精子懸液加入適量1%伊紅溶液，混勻染色20 min后，取1滴于潔凈玻片，均勻推片，空氣中自然干燥，用中性樹脂封片，制成精液樣本片。在高倍鏡下觀察精子形態(tài)，記錄畸形的精子數量，計算畸形率。精子畸形大致可分為卷曲、大頭、雙頭、雙尾、無鉤、香蕉形等[3]。有頭無尾、輪廓不清、重疊和明顯被剪碎的精子不計。精子畸形率（%）=畸形的精子數/檢查的精子數×100%。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數據，計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體重變化比較 各組小鼠灌胃前后體重的變化如表 1所示，隨著實驗的進行，體重逐漸增加，咖啡低、中、高劑量組的小鼠體重增加值略低于對照組，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠灌胃前后的體重變化情況(g,±s)

表1 各組小鼠灌胃前后的體重變化情況(g,±s)

組別 只數 灌胃前 灌胃7 d 體重變化低劑量組 10 32.87±3.87 34.37±4.19 1.50±1.06中劑量組 10 32.27±7.30 33.91±7.70 1.64±1.27高劑量組 10 30.38±6.18 31.72±6.06 1.34±1.08對照組 10 30.34±5.93 32.18±6.59 1.84±1.24

2.2 臟器系數、睪丸系數和附睪系數比較 與對照組相比，咖啡低、中、高劑量組的小鼠肝臟系數均有不同的降低，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。低、中、高劑量組小鼠的睪丸系數和附睪系數與對照組相比持平或略有增大，無劑量-效應關系，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠的臟器系數比較(%,±s)

表2 各組小鼠的臟器系數比較(%,±s)

對照組 10 6.72±1.56 0.53±0.17 0.08±0.03組別 只數 肝臟系數 睪丸系數 附睪系數低劑量組 10 5.74±1.26 0.66±0.11 0.10±0.03中劑量組 10 6.64±1.73 0.52±0.10 0.08±0.02高劑量組 10 5.82±2.04 0.52±0.12 0.10±0.04

2.3 精液質量評價 ①精子相對密度：與對照組相比，咖啡中、高劑量組精子相對密度明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但不存在明顯的劑量-效應關系。低劑量組精子相對密度與對照組相差不大，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。②精子存活率：與對照組相比，咖啡低劑量組精子存活率有增高趨勢，中、高劑量組精子存活率略有降低，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。③精子活動率和畸形率：咖啡低、中、高劑量組精子活動率和畸形率均與對照組相近，無劑量-效應關系，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表 3。鏡下檢測可見多種類型的精子形態(tài)異常，如卷曲、小頭、無定型、雙尾和雙頭畸形等（圖1）。

表3 各組小鼠的精液質量評價(±s)

表3 各組小鼠的精液質量評價(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 只數精子存活率(%)精子活動率(%)精子相對密度精子畸形率(%)對照組 10 412.50±151.53 67.99±7.99 68.25±75.78 5.76±4.50低劑量組 10 433.50±170.15 73.33±5.99 68.48±63.56 6.49±3.33中劑量組 10 244.25±77.19*63.17±15.91 66.03±13.59 6.02±8.23高劑量組 10 221.00±137.37*67.98±9.91 64.56±16.72 5.44±2.12

圖1 小鼠多種類型的精子形態(tài)（400×）

3 討論

體重是動物實驗中一項重要的非特異性指標，體重的變化可以綜合地反映動物機體的中毒效應[4]。本實驗對照組和咖啡各劑量組小鼠均正常生長，且活動狀態(tài)良好，體重自然增長，咖啡低、中、高劑量組的小鼠體重增長均略低于對照組，差異不顯著。短期灌胃咖啡未引起小鼠體重明顯變化，可繼續(xù)進行亞急性或長期試驗研究。

臟器系數的變化通?？梢暂^好地反映藥物對該臟器的影響或者初步的毒性判斷，也可以作為尋找毒物作用靶器官的重要線索[5]。經過咖啡連續(xù)灌胃7d后，咖啡低、中、高劑量組的小鼠肝臟系數、睪丸系數、附睪系數與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義，說明短期攝入咖啡對臟器影響不明顯。

精液質量是評價雄性生育能力的最直觀、最重要的指標，主要通過精子數量、精子活動率等參數來進行評估。精子數量減少、活動率下降以及畸形率升高往往會導致精子的受精能力下降，從而導致男性不育。本研究咖啡中、高劑量組與對照組比較，小鼠精子相對密度明顯減少，即精子數量減少差異顯著。表明咖啡對小鼠的精子數量有影響，連續(xù)7 d攝入咖啡大于15 mg/kg即可導致小鼠精子數量明顯減少，但是其活動率、存活率和畸形率未受影響。精子數量減少，運動能力強的精子也相對減少。小鼠精子數量質量的降低，會減少精子到達并且進入卵子的機率，影響受精率，進而可能導致生殖率降低。而低劑量組小鼠精子數量和存活率大于對照組，其他指標兩者也無顯著差異，所以短期少量攝入咖啡對精子質量基本無影響，甚至有積極作用。

綜上，短期過量攝入咖啡能明顯減少小鼠精子數量，對精子存活率、活動率和畸形率影響不大?？Х瓤赡軐е戮嘿|量下降，對人類生殖健康的影響值得密切關注，并進一步研究。

[1]羅妙莎,董蕾,郭曉燕.咖啡與肝臟疾病[J].胃腸病學和肝病學雜志,2016,25(3):340-343.

[2]范瑞泉,魏青,丘欽英,等.小鼠精子畸形試驗改良法與傳統(tǒng)法效果比較[J].華南預防醫(yī)學,2004,30(2):51-52.

[3]申涌,劉詠梅.枸杞多糖對甲醛所致雄性小鼠生殖毒性的拮抗作用[J].貴州醫(yī)科大學學報,2017,42(4):440-443.

[4]田永剛,張迎梅.低劑量三聚氰胺對小鼠精子質量影響的研究[J].四川動物,2010,29(3):466-468.

[5]孫建新,安娟,連軍.影響實驗動物臟器重量及臟器系數因素分析[J].實驗動物科學,2009,26(1):49-51.

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.10.009

1沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院，遼寧沈陽 110024

2沈陽醫(yī)學院，遼寧沈陽 110034

沈陽市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研項目[沈衛(wèi)辦（2015）478號]

郭曉寧，碩士，主管藥師。主要從事臨床藥學工作

王俊平，教授，博士。E-mail：greennasi@yahoo.com