沈丹丹，肖波，姜學(xué)美，張濤

（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶401121；2.重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶401121；3.重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司，重慶400061；4.福安藥業(yè)集團重慶禮邦藥物開發(fā)有限公司，重慶401121）

高效液相色譜法同時測定復(fù)方倍他米松注射液兩主成分含量

沈丹丹1，2，肖波3，姜學(xué)美1，2，張濤4

（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶401121；2.重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶401121；3.重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司，重慶400061；4.福安藥業(yè)集團重慶禮邦藥物開發(fā)有限公司，重慶401121）

目的建立同時測定復(fù)方倍他米松注射液中倍他米松磷酸鈉及二丙酸倍他米松含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法流動相為甲醇－乙腈－0.01 mol/L磷酸二氫銨（取磷酸二氫銨1.15 g，用水1 000 mL溶解后，加20%四丁基氫氧化銨28 mL，用磷酸調(diào)pH至7.0）溶液（34∶30∶36），檢測波長為242 nm，柱溫為35℃，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 L。結(jié)果倍他米松磷酸鈉及二丙酸倍他米松相鄰色譜峰之間的分離度大于1.5，質(zhì)量濃度分別在0.052 6～1.316 0 g/L(r＝0.999 9)和0.115 2～2.879 7 g/L(r＝1.000 0)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率分別為99.54%和99.78%，RSD分別為0.94%和0.70%（n＝9）；倍他米松磷酸鈉在光照條件下含量急劇下降。結(jié)論該方法可同時測定復(fù)方倍他米松注射液中倍他米松磷酸鈉、二丙酸倍他米松的含量，可用于其質(zhì)量控制。

復(fù)方倍他米松注射液；倍他米松磷酸鈉；二丙酸倍他米松；含量；高效液相色譜法

復(fù)方倍他米松注射液（商品名得寶松）是由先靈葆雅公司開發(fā)的一種倍他米松磷酸鈉（BSP）和二丙酸倍他米松（BD）的復(fù)方藥物劑型，具有抗炎、抗過敏和抗風(fēng)濕的功效[1]。原進口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)（JX20070074）中收載的含量測定方法[2]，分別采用不同色譜條件測定2種成分，以內(nèi)標(biāo)法計算，操作煩瑣，分析時間較長。也有采用同一色譜條件測定該2個主成分的含量，但以梯度洗脫，采用內(nèi)標(biāo)法計算含量[3]，操作程序仍比較復(fù)雜，且2個主成分色譜峰理論板數(shù)不高（BSP與BD分別為2 955和3 031）。本研究中建立了一種同時測定BSP及BD含量的色譜條件，以等度洗脫，按外標(biāo)法計算含量，更加快速、準(zhǔn)確、有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，以完善現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的不足，提升藥品檢驗的準(zhǔn)確性，同時為本品在生產(chǎn)、貯藏及運輸過程中把好技術(shù)關(guān)，更好地為藥品監(jiān)督服務(wù)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；K51502653型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

磷酸二氫氨、四丁基氫氧化銨為分析純，甲醇及乙腈為色譜純。BSP對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100180－201103，含量為98.7%）；BD對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100596－200601，含量為99.3%）；復(fù)方倍他米松注射液（上海先靈葆雅制藥有限公司，批號分別為3BBKAO8C03，4BBKAO6A01，5BBKAC3E01，含BD 6.43 g/L，含BSP 2.63 g/L）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇－乙腈－0.01 mol/L磷酸二氫銨（取磷酸二氫銨1.15 g，用水1 000 mL溶解后，加20%四丁基氫氧化銨28 mL，用磷酸調(diào)pH至7.0）溶液（34∶30∶36）；檢測波長：242 nm；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

精密量取本品5.0 mL，置50 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取BD對照品和BSP對照品適量，精密稱定，用流動相溶解并定量稀釋成每1 mL中約含BD 0.64 mg和BSP 0.26 mg的溶液，作為對照品混合溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗

空白輔料干擾試驗：按照處方配制混合輔料，精密量取輔料適量，按供試品溶液配制方法制成輔料溶液，精密量取續(xù)濾液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。在此條件下，溶劑空白、輔料空白不干擾BSP和BD的測定，理論板數(shù)均大于3 000，2個主峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，專屬性良好。

圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖

降解試驗：精密量取本品1.0 mL，置10 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，置水浴中80℃條件下放置3 h，取出放至室溫，加流動相至刻度，搖勻，即得80℃高溫降解供試品溶液。精密量取本品1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸1.0 mL，搖勻，室溫避光放置30 min后，加0.1 mol/L氫氧化鈉1.0 mL，加流動相4.0 mL，再加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得強酸降解供試品溶液。精密量取本品1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加0.1 mol/L氫氧化鈉1.0 mL，搖勻，室溫避光放置30 min后，加0.1 mol/L鹽酸1.0 mL，加流動相4.0 mL，再加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得強堿降解供試品溶液。精密量取本品1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加30%過氧化氫(H2O2)1.0 mL，室溫避光放置3 h后，加流動相4.0 mL，再加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得強氧化降解供試品溶液。精密量取本品1.0 mL，置10 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度。置光照箱中[照度為（3 500±500）lx]，放置16 h后取出，即得強光照射降解供試品溶液。分別精密吸取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。另以未降解供試品溶液作為對照品溶液評價質(zhì)量平衡，對上述供試品溶液分別采用二極管陣列檢測器（DAD檢測器）測試主峰的峰純度，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，主峰色譜峰純度因子均大于999，表明2個主峰為純物質(zhì)峰；質(zhì)量平衡在95%～105%范圍內(nèi)，產(chǎn)生的雜質(zhì)均能被有效檢出，方法專屬性強，可有效測定含量。

圖2 降解試驗高效液相色譜圖

2.3.2 精密度試驗

精密吸取對照品混合溶液10 μL，平行6份，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果BSP與BD的RSD分別為0.5%及0.3%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 定量限與檢測限確定

取BSP與BD對照品適量，精密稱定，用流動相溶解并定量稀釋成每1 mL約含BD 0.64 mg和BSP 0.26 mg的溶液，作為對照品貯備液。精密量取1.0 mL，用流動相逐級稀釋成系列濃度，吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以信噪比(S/N)＝3∶1計算檢測限，以S/N＝10∶1計算定量限。結(jié)果BSP與BD檢測限分別為0.32 ng和0.93 ng，定量限分別為0.56 ng和1.84 ng。

表1 強制降解試驗結(jié)果

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取2.2項下同一供試品溶液，分別于0，1，2，8，16 h時吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果BSP與BD峰面積的RSD分別為0.9%和0.6%（n＝6），表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 線性關(guān)系考察

稱取BD對照品約32 mg和BSP對照品約13 mg，精密稱定，置同一10 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液2.0 mL，置50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，作為對照品溶液1；精密量取對照品貯備液1.0，2.0，4.0 mL，分別置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，作為對照品溶液2，3，4。取對照品貯備液作為對照品溶液5。精密吸取對照品系列溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，BSP為A＝－23.035 37＋14 651.780 43 C（r＝0.999 9），表明BSP質(zhì)量濃度在0.115 2～2.879 7 g/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；BD為A＝183.147 04＋17 378.365 26 C（r＝1.000 0），表明BD質(zhì)量濃度在0.052 6～1.316 0 g/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.6 回收試驗

取BSP對照品和BD對照品適量，精密稱定，置同一50 mL容量瓶中，用流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含BD 0.64 mg和BSP 0.26 mg的溶液，作為對照品混合溶液。分別精密量取本品輔料空白溶液（批號為20150105）5 mL，平行9份，分別置50 mL容量瓶中，加入處方量80%，100%，120%的BSP和BD，分別用流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率。結(jié)果BSP與BD的平均回收率分別為99.54%和99.78%，RSD分別為0.94%和0.70%（n＝9）。見表2。

表2 回收試驗測定結(jié)果(n＝9)

2.3.7 重復(fù)性試驗

取本品6份，依法制配供試品溶液，進樣測定。結(jié)果BSP與BD平均含量分別為99.10%和102.09%，RSD分別為0.62%和0.44%（n＝6）。

2.3.8 耐用性試驗

色譜柱：選用Agilent Zorbax SB－C18柱及Phenomenex Luna C18柱對供試品溶液進行測定，其他條件保持不變、結(jié)果不同種類的色譜柱對分離度無明顯影響，表明本方法對色譜柱種類耐用性強。

表3 3批樣品影響因素試驗測定結(jié)果（%）

緩沖液pH：將緩沖液pH分別調(diào)至6.9，7.0，7.1，其他條件保持不變，取2.2項下供試品溶液10 μL注入液相色譜儀。結(jié)果緩沖液pH在6.9～7.1變化范圍內(nèi)，分離度均大于2.0，表明方法對緩沖液pH耐用性較強。

柱溫：將柱溫分別設(shè)定為30，35，40℃，其他條件保持不變，取2.2項下供試品溶液10 μL注入液相色譜儀。結(jié)果柱溫在30～40℃變化范圍內(nèi)，分離度均大于2.0，表明方法對柱溫耐用性強。

流速：將流速分別設(shè)定為0.8，1.0，1.2 mL/min，其他條件保持不變，取2.2項下供試品溶液10 μL注入液相色譜儀。結(jié)果流速在0.8～1.2 mL/min變化范圍內(nèi)，分離度均大于2.0，表明方法對流速耐用性強。

流動相比例：選用色譜柱Phenomenex Luna C18柱，改變流動相比例，其他條件保持不變，取2.2項下供試品溶液10 μL注入液相色譜儀。結(jié)果甲醇在±2%變化范圍內(nèi)，乙腈在±5%變化范圍內(nèi)，分離度均大于2.0，表明方法對流動相比例耐用性強。

2.3.9 影響因素試驗

取本品3批，分別于60℃恒溫干燥箱中放置5，10，30 d，作為高溫60℃破壞樣品；于40℃恒溫干燥箱中放置5，10，30 d，作為高溫40℃破壞樣品；于（4 500±500）lx光照箱中放置5，10，30 d，作為光照破壞樣品。將破壞后的樣品按2.2項下方法處理，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。與未經(jīng)破壞的含量測定結(jié)果比較，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，與0 d比較，光照條件下，隨著時間增加，BSP含量呈急劇下降趨勢。在高溫40℃，60℃條件下，隨著時間增加，各成分含量無明顯變化，說明BSP對光照不穩(wěn)定。

3 討論

3.1 流動相選擇

在200～400 nm波長范圍內(nèi)對BSP對照品、BD對照品分別進行紫外掃描，結(jié)果均在242 nm波長處有最大吸收，因此確定檢測波長為242 nm。由于BSP與BD極性相差較大，如乙腈比例低，則BD不能被有效洗脫；如增加乙腈比例，則BSP出峰時間又較快，不能達到與相鄰峰良好分離。參照國家食品藥品監(jiān)督管理總局標(biāo)準(zhǔn)含量測定色譜條件[4]，供試品中2個主峰與相鄰峰的分離度均符合要求，但流動相中加入的20%四丁基氫氧化銨用量比較大，流動相很容易有晶體析出，堵塞色譜柱，方法耐用性較差。因此，本研究確定的流動相中降低了20%四丁基氫氧化銨用量，將2個主峰均有效洗脫并能與相鄰峰達到良好分離，BSP與BD理論板數(shù)均達到10 000以上，能同時測定2個主成分的含量，方法耐用性好。

3.2 強降解試驗

本品對強酸強堿較為穩(wěn)定，在光照、強氧化及高溫條件下，雜質(zhì)增加較多；各降解雜質(zhì)與2個主峰達到有效分離。主峰色譜峰純度因子均大于999，表明2個主峰為純物質(zhì)峰；質(zhì)量平衡在95%～105%范圍內(nèi)，產(chǎn)生的雜質(zhì)均能被有效檢出，方法專屬性強，能有效測定含量。

3.3 影響因素分析

與0 d比較，在光照條件下，隨著時間增加，BSP含量呈急劇下降趨勢；在高溫40℃，60℃條件下，隨著時間增加，各成分含量無明顯變化，說明BSP對光照不穩(wěn)定。建議企業(yè)在研發(fā)、生產(chǎn)、運輸及貯藏過程中應(yīng)注意避光，保證產(chǎn)品質(zhì)量的有效性。

[1] 單敏，鄭方曄，李鋒武.RP－HPLC法測定復(fù)方倍他米松注射液有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志，2008，28（4）：624－626.

[2] JX20070074，復(fù)方倍他米松注射液進口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)[S].

[3] 金薇，汪潔.HPLC同時測定復(fù)方倍他米松注射液中倍他米松磷酸鈉和二丙酸倍他米松的含量[J].中國藥學(xué)雜志，2002，37（1）：48－50.

[4] YBH01252015，國家食品藥品監(jiān)督管理總局標(biāo)準(zhǔn)·復(fù)方倍他米松注射液[S].

Simultaneous Determination of Two Main Components in Compound Betamethasone Injection by HPLC

Shen Dandan1,2,Xiao Bo3,Jang Xuemei1,2,Zhang Tao4
(1.Chongqing Institute for Food and Drug Control,Chongqing,China401121;2.Chongqing Research Center for Drug Process and Quality Control Engineering,Chongqing,China401121;3.Chongqing Research Academy of Pharmaceutical Industry,Chongqing,China400061;4.Fuan Pharmaceutical Lybon Pharm－Tech Co.,Ltd.,Chongqing,China401121)

Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of betamethasone sodium phosphate and betamethasone dipropionate in Compound Betamethasone Injection.MethodsThe mobile phase was methanol－acetonitrile－0.01 mol/L ammonium dihydrogen phosphate(ammonium dihydrogen phosphate 1.15 g was dissolved in 1 000 mL water,28 mL 20%tetrabutylammonium hydroxide(TBAH)was added,and the pH was adjusted to 7 with phosphoric acid)(34∶30∶36),the detection wavelength was 242 nm,the column temperature was 35℃,the flow rate was 1.0 mL/min and the sample size was 10 μL.ResultsThe resolution among the adjacent chromatographic peaks of betamethasone sodium phosphate and betamethasone dipropionate was greater than 1.5.Betamethasonesodium phosphate and betamethasone dipropionate in the ranges of 0.052 6－1.316 0 g/L(r＝0.999 9),0.115 2－2.879 7 g/L(r＝1.000 0)showed a good linearity.The average recovery rates were 99.54%,99.78%,RSDs were 0.94%,0.70%(n＝9).The content of betamethasone sodium phosphate decreased sharply in the light conditions.ConclusionThe method can simultaneously determine the content of betamethasone sodium phosphate and betamethasone dipropionate in Compound Betamethasone Injection,which can be used for the quality control of the products.

Compound Betamethasone Injection;betamethasone sodium phosphate;betamethasone dipropionate;content;HPLC

R927.2

A

1006－4931(2017)21－0025－05

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.21.010

沈丹丹，女，碩士研究生，工程師，研究方向為藥物分析及藥劑學(xué)，（電子信箱）499258077＠qq.com。

張濤，男，碩士研究生，教授級高級工程師，研究方向為新藥開發(fā)，（電子信箱）zzhtao＠qq.com。

2017－06－06)

·臨床研究·