秦小云， 李桂成， 張慶金， 蔡科軍， 謝正軼， 覃淑云， 朱 琳， 夏春波

大鼠側(cè)腦室注射Nesfatin-1對糖脂代謝的影響及其與下丘腦AMPK表達(dá)的關(guān)系

秦小云1， 李桂成1， 張慶金1， 蔡科軍1， 謝正軼1， 覃淑云1， 朱 琳2， 夏春波2

目的探討側(cè)腦室注射攝食抑制因子Nesfatin-1對糖脂代謝的影響及其與下丘腦AMPK表達(dá)的關(guān)系。方法借助腦立體定位技術(shù)將Nesfatin-1(1-82)重組蛋白注射至大鼠側(cè)腦室(實(shí)驗(yàn)組)，設(shè)注射等體積人工腦脊液的假手術(shù)組和未施加任何干擾因素的對照組，大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)4 w后，全自動生化分析儀檢測血糖血脂水平變化，RT-PCR法檢測大鼠下丘腦組織AMPK mRNA表達(dá)，Western blotting法檢測大鼠下丘腦組織AMPKα及磷酸化AMPKα(pAMPKα)的表達(dá)。結(jié)果(1)生化檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠FPG和TG與對照組比較均顯著下降(P<0.05)，但TC、HDL和LDL水平未見明顯變化(P>0.05)；(2)RT-PCR及Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組的AMPK mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，假手術(shù)組的AMPK mRNA及蛋白表達(dá)水平與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論Nesfatin-1可能在糖脂代謝神經(jīng)調(diào)節(jié)過程中具有重要作用，其機(jī)制可能與下丘腦AMPK表達(dá)水平有關(guān)。

Nesfatin-1； 糖脂代謝； AMPK； 下丘腦

內(nèi)臟功能受神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，下丘腦是能量平衡的調(diào)節(jié)中樞，存在對多種能量改變的感受器，可以接收外周神經(jīng)、激素及營養(yǎng)的信號，通過交感/副交感神經(jīng)來調(diào)節(jié)攝食與能量代謝[1,2]。Nesfatin-1是核組蛋白2(nucleobindin-2，NUCB2)N端由82個(gè)氨基酸組成的肽段，在攝食、肥胖和能量代謝調(diào)節(jié)過程中具有重要作用[3]。腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)在真核細(xì)胞中廣泛存在，大量證據(jù)表明存在于下丘腦區(qū)域的AMPK介導(dǎo)著攝食及能量調(diào)節(jié)的信號分子作用，但AMPK與Nesfatin-1之間的關(guān)系尚未清楚。

為闡明腦內(nèi)Nesfatin-1在糖脂代謝調(diào)節(jié)中的作用及其與下丘腦AMPK的關(guān)系，本研究擬借助腦立體定位技術(shù)將Nesfatin-1注射至大鼠側(cè)腦,檢測血糖血脂水平變化以及下丘腦AMPK表達(dá)水平;探討Nesfatin-1調(diào)節(jié)糖脂代謝的下丘腦機(jī)制;為糖脂代謝神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和實(shí)驗(yàn)試劑 腦立體定位儀(日本SR-6)，全自動生化分析儀(德國Erba XL-600)，熒光定量PCR儀(美國ABI)，凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD)，微量進(jìn)樣器(上海高鴿)。大鼠Nesfatin-1購自 Phoneix公司，血糖血脂試劑盒購自桂林優(yōu)利特公司，BCA試劑盒購自北京雷根公司，蛋白Marker購自Fermentas公司，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒均購自中杉金橋公司。AMPK抗體購自proteintech公司，熒光定量PCR試劑盒購自Solarbio公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組 雄性Spraque-Dawley(SD)大鼠45只，體重250～300 g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、假手術(shù)組和正常對照組，均由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK桂2007-0001。實(shí)驗(yàn)組(n=15)參照大鼠腦立體定位圖譜，經(jīng)10%水合氯醛麻醉(4 ml/kg，腹腔注射)后固定在腦立體定位儀上，參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行側(cè)腦室置管和注射Nesfatin-1(0.25 μg/h，持續(xù)6 h)，注射坐標(biāo)(前囟后1.2 mm、右側(cè)旁開2.0 mm、進(jìn)針3.6 mm)。假手術(shù)組(n=15)注射等體積的人工腦脊液(NaCl 126 mmol/L；CaCl22.0 mmol/L；H2O 2.0 mmol/L；MgCl23.5 mmol/L；MgSO41.0 mmol/L；NaHCO326.0 mmol/L；NaH2PO41.25 mmol/L；葡萄糖10.0 mmol/L；pH 7.35～7.45)。對照組(n=15)未施加任何干擾因素。

1.3 大鼠血糖血脂水平檢測和組織標(biāo)本處理 大鼠右側(cè)側(cè)腦室注射Nesfatin-1后繼續(xù)飼養(yǎng)4 w，先行水合氯醛麻醉，將大鼠固定后用1 ml注射器在大鼠胸骨左緣心臟搏動最強(qiáng)點(diǎn)垂直進(jìn)針進(jìn)行心臟采血，分離血漿，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測大鼠空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL)。心臟采血后立即斷頭取腦，剝開顱骨，分離下丘腦，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR法檢測大鼠下丘腦組織AMPK mRNA表達(dá) 在液氮中將下丘腦組織研磨成粉末，采用Trizol法提取組織總RNA，依次加入氯仿、異丙醇使RNA沉淀，經(jīng)洗滌后加入無RNase水溶解，測完濃度后備用。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板熒光定量PCR 法檢測各組樣本的AMPK mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃，10 min；變性95 ℃，15 s，退火58 ℃，25 s，延伸72 ℃，30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)立3個(gè)平行孔，另行溶解曲線分析，證明無非特異性擴(kuò)增。通過軟件分析得到各組樣品的CT 值，以2-ΔΔ CT值表示各組的相對表達(dá)量。AMPK(110 bp)上游引物5’-TCTGAGGGGCACCAAGAAAC-3’，下游引物5’-GTGGGTGTTGACGGAGAAGAG-3’；內(nèi)參β-actin(150 bp)上游引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’。

1.5 Western blotting法檢測大鼠下丘腦組織AMPKα及磷酸化AMPKα(pAMPKα)的表達(dá)水平 在液氮中將下丘腦組織研磨成粉末，每20 mg組織加100微升裂解液。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為90 mA，1.5 h，將PVDF膜放入AMPK一抗中，4 ℃過夜，加二抗，室溫孵育1 h。按照ECL發(fā)光試劑盒說明書，使PVDF膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)對蛋白條帶光密度測定并分析。AMPK蛋白的灰度值除以內(nèi)參基因β-actin的灰度值，所得比值代表樣品中AMPK蛋白的相對含量。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠血糖血脂水平 大鼠右側(cè)側(cè)腦室注射Nesfatin-1(1-82)重組蛋白，繼續(xù)飼養(yǎng)4 w后，全自動生化分析儀檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠FPG和TG與對照組比較均顯著下降(P<0.05)，但TC、HDL和LDL水平未見明顯變化(P>0.05)，假手術(shù)組與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)(見表1)。

2.2 大鼠下丘腦組織AMPK表達(dá)水平 大鼠右側(cè)側(cè)腦室注射Nesfatin-1(1-82)重組蛋白4 w后，采用熒光定量PCR法對大鼠下丘腦組織進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，AMPK基因融解曲線顯示為單一銳峰，未見非特異性產(chǎn)物，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組的AMPK mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)(見圖1)。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AMPKα亞基大小為63 kD，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組AMPKα和pAMPKα表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)(見圖2、圖3)。假手術(shù)組的AMPK mRNA及蛋白表達(dá)水平與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠血糖血脂水平

與對照組比較*P<0.05

圖1 大鼠下丘腦組織AMPK mRNA表達(dá)

圖2 大鼠下丘腦組織AMPK蛋白表達(dá)

圖3 大鼠下丘腦組織AMPK蛋白表達(dá)水平結(jié)果分析

3 討 論

糖脂代謝受神經(jīng)系統(tǒng)的整體調(diào)節(jié)，是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[5～7]，比如，低血糖時(shí)，可通過增加內(nèi)臟交感神經(jīng)活性使肝糖生成增多，而胰島素分泌減少，胰高血糖素分泌增多[8]。近年來，下丘腦對內(nèi)臟功能的調(diào)節(jié)一直受到關(guān)注[9]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以通過下丘腦- 垂體- 腎上腺皮質(zhì)軸(HPA軸)來調(diào)控外周器官功能活動，老年抑郁癥患者HPA軸激素水平升高與腦垂體、腎上腺體積增大有關(guān)[10]，大腦海馬對HPA軸的調(diào)節(jié)與下丘腦中的室旁核(PVN)有直接關(guān)系，也可通過前腦終紋床核(BNST)等核團(tuán)來影響PVN活性[11]。

Nesfatin-1是位于NUCB2 N端的肽段，大鼠腦室內(nèi)輸注Nesfatin-1有明顯的抑制攝食作用，其中間片段(M30，24-53殘基)可能是Nesfatin-1產(chǎn)生攝食抑制作用的關(guān)鍵區(qū)域[3]。外周的攝食信號也可導(dǎo)致下丘腦Nesfatin-1表達(dá)水平的變化，Nesfatin-1表達(dá)升高與進(jìn)食量減少以及體重降低有關(guān)[12]。吳靜等[13]通過側(cè)腦室置管的方法，將射1、5和50 pmol的nesfatin-1注射至側(cè)腦室，結(jié)果顯示，nesfatin-1可呈劑量和時(shí)間依賴性的抑制大鼠胃酸分泌，并且組胺信號通路可能參與了上述過程。另有研究[4]顯示，中樞Nesfatin-1(1-82)短期灌注可增加了大鼠機(jī)體胰島素敏感性(IS)，并抑制了肝糖異生。本研究利用腦立體定位技術(shù)，將Nesfatin-1(1-82)重組蛋白緩慢注射至大鼠側(cè)腦室，4 w后生化檢測結(jié)果顯示，大鼠空腹血糖(FPG)和TG明顯降低，TC、HDL和LDL未見明顯變化，提示腦內(nèi)Nesfatin-1可能在糖脂代謝調(diào)節(jié)中具有重要作用。下丘腦Nesfatin-1調(diào)節(jié)內(nèi)臟功能的信號通路，有研究顯示，Nesfatin-1基因敲除可增強(qiáng)與mTOR-STAT3信號通路抑制相關(guān)的大鼠肝臟糖異生[14]。另有報(bào)道，Nesfatin-1可能是通過POMC途徑起作用的[3,15]，而可能與瘦素信號傳導(dǎo)通路無關(guān)[3,16]。AMPK在能量代謝調(diào)節(jié)中有重要作用，主要在骨骼肌、肝、胰、脂肪組織以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，其主要作用是根據(jù)機(jī)體的需要來調(diào)節(jié)產(chǎn)能及耗能代謝。下丘腦AMPK是各種調(diào)控?cái)z食行為信號通路的中介，攝食抑制因素可抑制下丘腦AMPK的活性，進(jìn)而可減少食物的攝入[17]。

本研究結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射Nesfatin-1引起的血糖血脂水平降低可能與下丘腦AMPK mRNA及蛋白表達(dá)水平下降有關(guān)，推測下丘腦AMPK與Nesfatin-1調(diào)節(jié)攝食和能量代謝關(guān)系密切，但其確切機(jī)制尚需深入研究，如下丘腦信號傳導(dǎo)通路以及內(nèi)臟交感、副交感神經(jīng)的作用等。另有報(bào)道[18]，NUCB2/Nesfatin-1在飲食誘導(dǎo)肥胖(DIO)大鼠下丘腦的表達(dá)水平明顯降低，其可能在糖脂代謝神經(jīng)調(diào)節(jié)中具有重要作用。

綜上所述，本研究通過側(cè)腦室注射Nesfatin-1進(jìn)一步證實(shí)了其在糖脂代謝調(diào)節(jié)中的作用，其機(jī)制可能與下丘腦AMPK表達(dá)水平有關(guān)，闡明這一機(jī)制可為攝食與物質(zhì)代謝的神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制研究提供依據(jù)。

[1]Stefanidis A,Wiedmann NM,Adler ES,et al.Hypothalamic control of adipose tissue[J].Best Pract Res Clin Endocrinol Metab,2014,28(5):685-701.

[2]Morgan DA,Mcdaniel LN,Yin T,et al.Regulation of glucose tolerance and sympathetic activity by MC4R signaling in the lateral hypothalamus[J].Diabetes,2015,64(6):1976-1987.

[3]Oh-IS,Shimizu H,Satoh T,et al.Identification of Nesfatin-1 as a satiety molecule in the hypothalamus[J].Nature,2006,443(7112):709-712.

[4]葉 菲,朱 偉,楊剛毅,等.腦室內(nèi)灌注重組蛋白Nesfatin-1(1-82)對大鼠糖脂代謝和相關(guān)酶的影響[J].中國糖尿病雜志,2013,21(6):540-543.

[5]Xia C,Zhu L,Shao W,et al.The Effect of Hippocampal cognitive impairment and XIAP on glucose and lipids metabolism in rats[J].Cell Physiol Biochem,2016,38(2):609-618.

[6]Farr S,Taher J,Adeli K.Central nervous system regulation of intestinal lipid and lipoprotein metabolism[J].Curr Opin Lipidol,2016,27(1):1-7.

[7]Folgueira C,Beiroa D,Callon A,et al.Uroguanylin action in the brain reduces weight gain in obese mice via different efferent autonomic pathways[J].Diabetes,2016,65(2):421-432.

[8]Stockhorst U,Steingraber HJ,Scherbaum WA.Classically conditioned responses following repeated insulin and glucose administration in humans[J].Behav Brain Res,2000,110(1/2):143-159.

[9]Bouret SG,Draper SJ,Simerly RB.Trophic action of leptin on hypothalamic neurons that regulate feeding[J].Science,2004,304(5667):108-110.

[10]李 卓,張海三,李 杰,等.老年抑郁癥患者下丘腦-垂體-腎上腺軸功能和垂體、腎上腺體積的變化[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2016,32(14):2329-2332.

[11]Mueller NK,Dolgas CM,Herman JP.Stressor-selective role of the ventral subiculum in regulation of neuroendocrine stress responses[J].Endocrinology,2004,145(8):3763-3768.

[12]吳 博,劉重斌,董繆武,等.重復(fù)性饑餓/再投喂對大鼠下丘腦NUCB 2表達(dá)影響[J].中國公共衛(wèi)生,2010,26(3):313-314.

[13]吳 靜,賈方圓,謝碧云,等.側(cè)腦室注射nesfatin-1 抑制大鼠胃酸分泌[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2013,33(5):552-556.

[14]Wu D,Yang M,Chen Y,et al.Hypothalamic nesfatin-1/NUCB2 knockdown augments hepatic glucon eogenesis that is correlated with inhibition of mTOR-STAT3 signaling pathway in rats[J].Diabetes,2014,63(4):1234-1247.

[15]Shimizu H,Oh iS,Hashimoto K,et al.Peripheral administration of Nesfatin-1 reduces food intake in mice:the leptin-independent mechanism[J].Endocrinology,2009,150(2):662-671.

[16]Stengel A,Goebel M,Tache Y.Nesfatin-1:a novel inhibitory regulator of food intake and body weight[J].Obes Rev,2011,12(4):261-271.

[17]Lee WJ,Song KH,Koh EH,et al.Alpha-lipoic acid increases insulin sensitivity by activating AMPK in skeletal muscle[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,332(3):885-891.

[18]秦小云,王伯鈞,伍善廣,等.NUCB2/Nesfatin-1 在DIO 大鼠下丘腦中的表達(dá)[J].中國臨床解剖學(xué)雜志,2014,32(6):704-707.

TheeffectofinjectingNesfatin-1intoLateralventricleonglucolipidmetabolismanditsconnectionwithAMPKexpressionofhypothalamusinrats

QINXiaoyun,LIGuicheng,ZHANGQingjin,etal.

(DepartmentofAnatomy,SchoolofMedical,TechnologyandScienceofGuangxiUniversity,Liuzhou545006,China)

ObjectiveTo investigate the effect of injecting the feeding inhibitory factor Nesfatin-1 into Lateral ventricle on glucolipid metabolism and its connection with AMPK expression of hypothalamus in rats.MethodsWith the help of the brain stereotaxic instrument,Nesfatin-1(1-82) recombinant protein (experimental group) and equal artificial cerebrospinal fluid (sham-operated group) were injected into the lateral ventricle of rats,the control group did not exert any interference.4 weeks later,testing the level of blood glucolipid by automatic biochemical analyzer and detecting the expression of AMPK mRNA,AMPKα and pAMPKα in hypothalamus through RT-PCR and Western blotting.Results(1)According to the results of biochemical tests,compared to the control group,the level of FPG and TG in experimental group were significantly decreased (P<0.05),while the level of TC,HDL and LDL were not significant change (P>0.05);(2)According to the results of RT-PCR and Western blotting,compared to control group,the expression of AMPK mRNA and protein level in experimental group were significantly lower (P<0.05) and shown no significant difference (P>0.05) with sham-operated group.ConclusionNesfatin-1 may play an important role in the process of neuroregulation on glucolipid metabolism,the mechanism may be related to the AMPK expression level of hypothalamus.

Nesfatin-1; Glycolipid metabolism; AMP-activated protein kinase; Hypothalamus

R742

A

1003-2754(2017)10-0901-04

2017-08-10；

2017-10-05

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2015GXNSFAA414002)；廣西腦與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究課題(No.16-380-63)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81260137)

(1.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，廣西 柳州 545005；2.桂林醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，廣西 桂林 541004)

夏春波，E-mail：xiachunbo910@163.com