林伯理
(信豐縣人民醫(yī)院,江西 贛州 341600)
心外膜脂肪細(xì)胞核因子(NF)-κB信號(hào)途徑抑制在抗動(dòng)脈粥樣硬化中的作用分析
林伯理
(信豐縣人民醫(yī)院,江西 贛州 341600)
目的 分析在抵抗動(dòng)脈粥樣硬化過程中,心外膜脂肪細(xì)胞核因子(NF)-κB信號(hào)途徑的抑制。方法 建立泡沫模型之后,采用油紅染色O來判斷模型是否建立成功,將其分成空白組,siRNA干擾組,轉(zhuǎn)染試劑組,高脂組,高脂+SRT1720+siRNA干擾組,高脂+SRT1720組,分析其蛋白表達(dá)的分析均采用Western的方式。結(jié)果 模型被成功建立之后,從SIRT1蛋白表達(dá)量來看,高脂+SRT1720組相對(duì)于高脂組升高明顯,其下游的靶向分子腫瘤壞死因子(TNF)-α蛋白表達(dá)量及(NF)-κB下降顯著。SIRT1蛋白表達(dá)量高脂+SRT1720+siRNA干擾組比高脂+SRT1720組相比下降量更為顯著,其下游的靶向分子腫瘤壞死因子(TNF)-α蛋白表達(dá)量及(NF)-κB升高更為顯著。結(jié)論 泡沫細(xì)胞模型中(NF)-κB的信號(hào)通路上游是SIRT1,其作用為抑制心外膜脂肪細(xì)胞核因子(NF)-κB炎癥信號(hào)途徑,調(diào)節(jié)并參與幫助泡沫細(xì)胞的移除,從動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊當(dāng)中。此種方式可以提供新的手段在預(yù)防及治療動(dòng)脈粥樣硬化上,為廣大臨床患者獲得更高的治療途徑。
心外膜脂肪細(xì)胞核因子(NF)-κB信號(hào)途徑;抵抗動(dòng)脈粥樣硬化;作用分析
血管壁的纖維化與脂質(zhì)沉積是發(fā)生在大動(dòng)脈的一種慢性的炎癥性的疾病,稱為動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)[1]。有相關(guān)研究證明,其特征為由泡沫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞衍生而來),積蓄在血管內(nèi)壁中,由纖維細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞聚集、血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、鈣化以及纖維化等多種復(fù)雜的過程構(gòu)成,出現(xiàn)管壁缺血缺氧、管腔狹窄等,以斑塊形成為最終結(jié)果[2]。本研究旨在分析心外膜脂肪細(xì)胞核因子(NF)-κB信號(hào)途徑的抑制,其在調(diào)節(jié)AS的發(fā)展形成的作用分析,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1 儀器試劑 由上海光密儀器有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為GFM-550熒光顯微鏡、由普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司提供型號(hào)為PUZS-300的全自動(dòng)生化分析儀。美國SCIENCELL公司購置人單核細(xì)胞株,SIRT1、胎牛血清、RPMI1640型號(hào)細(xì)胞培養(yǎng)基均于澳大利亞Gibco公司。腫瘤壞死因子(TNF)-α與(NF)-κB購置于澳大利亞Gibco公司。
1.2 泡沫細(xì)胞模型的建立與染色 RPMI1640型號(hào)細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清培養(yǎng)。放置12 h于37℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中,加入青霉素100 mg/mL與鏈霉素100 U/mL,誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞。調(diào)整濃度為1×106個(gè)/mL,接種數(shù)對(duì)長期細(xì)胞與6孔板上面加入軟質(zhì)酸鈉調(diào)整濃度共育24 h,最終建立出泡沫細(xì)胞的模型。將誘導(dǎo)完成的巨噬細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞玻片,以4%多聚甲醛固定后,行油紅O染色。
1.3 分組 分為空白組,siRNA干擾組,轉(zhuǎn)染試劑組,高脂組,高脂+SRT1720+siRNA干擾組,高脂+SRT1720組。常規(guī)培養(yǎng)為空白組;空白組+5μL轉(zhuǎn)染試劑為轉(zhuǎn)染試劑組;轉(zhuǎn)染試劑組+6μmol/L的SIRT1干擾為siRNA干擾組;空白組+0.08 g/L的ox-LDL+0.2 mmol/L軟脂酸鈉為高脂組;高脂+SRT1720+6μmol/L的SIRT1干擾siRNA為高脂+SRT1720+siRNA干擾組。siRNA的干擾過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
1.4 蛋白表達(dá)及印記分析 采用4℃磷酸鹽沖洗細(xì)胞1 min/次,2次/d。細(xì)胞冰上裂解、離心30 min后吸取上清液測(cè)定蛋白濃度。采用電化學(xué)發(fā)光法,進(jìn)行系統(tǒng)分析。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)計(jì)量資料采用“x±s”表示,組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(n)表示,計(jì)數(shù)資料組間率(%)的比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 泡沫細(xì)胞膜型建立 在誘導(dǎo)下的細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化,大部分細(xì)胞分化良好出現(xiàn)偽足呈梭形貼近壁生長,則提示以分化稱為巨噬細(xì)胞。由于ox-LDL及軟脂酸鈉的共同作用,細(xì)胞質(zhì)顯現(xiàn)紅色脂質(zhì)顆粒,與泡沫細(xì)胞特點(diǎn)形態(tài)一致,提示模型建立成功。見圖1、圖2。
圖1 泡沫細(xì)胞(箭頭處為典型改變,×200)
圖2 巨噬細(xì)胞(×200)
2.2 (NF)-κB信號(hào)途徑及Western印記的結(jié)果 高脂+SRT1720組相對(duì)于高脂組升高明顯,其下游的靶向分子腫瘤壞死因子(TNF)-α蛋白表達(dá)量及(NF)-κB下降顯著。SIRT1蛋白表達(dá)量高脂+SRT1720+siRNA干擾組比高脂+SRT1720組相比下降量更為顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
表1 5組的(NF)-κB信號(hào)途徑及Western印記的結(jié)果
動(dòng)脈粥樣硬化,急性發(fā)病或者其并發(fā)癥是致死的重要因素,且隨著我國生活水平的不斷提高,油脂攝入過剩,此病發(fā)病也隨之升高[3]。導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的生物學(xué)特征即是血管內(nèi)斑塊的形成與破裂,由于斑塊內(nèi)部的機(jī)構(gòu)、血流等至其不穩(wěn)定時(shí)出現(xiàn)。其急性并發(fā)癥的發(fā)生、損傷及早期過程均有炎癥的信號(hào)通路參與此類過程[4]。(NF)-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子存在于細(xì)胞內(nèi)部,可能是AS發(fā)生發(fā)展的主要因素之一。在斑塊血管內(nèi)壁細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞均可以參與(NF)-κB的激活。其存在于靜息的細(xì)胞漿液中以非活性的形式存在,當(dāng)動(dòng)脈發(fā)生硬化時(shí),(NF)-κB細(xì)胞被刺激以激活,作用于靶向基因,使炎性因子釋放于表達(dá),可以促進(jìn)其增值于遷移,而促成了AS的發(fā)生發(fā)展。AS的血管內(nèi)壁(NF)-κB存在于內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、泡沫細(xì)胞中,而可見輕微(NF)-κB活化存在于無動(dòng)脈硬化的斑塊當(dāng)中[5]。有文獻(xiàn)表明在AS的發(fā)展發(fā)生前期,部分損傷及內(nèi)皮層相對(duì)完整的時(shí)候均可見活化的(NF)-κB[6]。有研究文獻(xiàn)證實(shí)AS患者心臟外膜的脂肪當(dāng)中(NF)-κB的表達(dá)情況有明顯的增高,其炎性反應(yīng)通過巨噬細(xì)胞表面的受體與結(jié)合,利用(NF)-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中(NF)-κB亞基可使斑塊明顯的被縮小,以減少其泡沫細(xì)胞的含量,其通過(NF)-κB信號(hào)通路的調(diào)控,使炎癥信號(hào)存在于泡沫細(xì)胞中受到一定的調(diào)節(jié)作用,可使AS斑塊消退。從本研究中可明顯看出,模型被成功建立之后,從SIRT1蛋白表達(dá)量來看,高脂+SRT1720組相對(duì)于高脂組升高明顯,其下游的靶向分子腫瘤壞死因子(TNF)-α蛋白表達(dá)量及(NF)-κB顯著下降[8]。SIRT1蛋白表達(dá)量高脂+SRT1720+siRNA干擾組比高脂+SRT1720組相比下降量更為顯著,其下游的靶向分子腫瘤壞死因子(TNF)-α蛋白表達(dá)量及(NF)-κB升高更為顯著。
綜上所述,泡沫細(xì)胞模型中(NF)-κB的信號(hào)通路上游是SIRT1,其作用為抑制心外膜脂肪細(xì)胞核因子(NF)-κB炎癥信號(hào)途徑,調(diào)節(jié)并參與幫助泡沫細(xì)胞的移除,為廣大臨床患者獲得更高的治療途徑。
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10.3969/j.issn.1009-4393.2017.30.060