林伯理

（信豐縣人民醫(yī)院，江西 贛州 341600）

心外膜脂肪細(xì)胞核因子（NF）-κB信號途徑抑制在抗動脈粥樣硬化中的作用分析

林伯理

（信豐縣人民醫(yī)院，江西 贛州 341600）

目的 分析在抵抗動脈粥樣硬化過程中，心外膜脂肪細(xì)胞核因子（NF）-κB信號途徑的抑制。方法 建立泡沫模型之后，采用油紅染色O來判斷模型是否建立成功，將其分成空白組，siRNA干擾組，轉(zhuǎn)染試劑組，高脂組，高脂+SRT1720+siRNA干擾組，高脂+SRT1720組，分析其蛋白表達(dá)的分析均采用Western的方式。結(jié)果 模型被成功建立之后，從SIRT1蛋白表達(dá)量來看，高脂+SRT1720組相對于高脂組升高明顯，其下游的靶向分子腫瘤壞死因子（TNF）-α蛋白表達(dá)量及（NF）-κB下降顯著。SIRT1蛋白表達(dá)量高脂+SRT1720+siRNA干擾組比高脂+SRT1720組相比下降量更為顯著，其下游的靶向分子腫瘤壞死因子（TNF）-α蛋白表達(dá)量及（NF）-κB升高更為顯著。結(jié)論 泡沫細(xì)胞模型中（NF）-κB的信號通路上游是SIRT1，其作用為抑制心外膜脂肪細(xì)胞核因子（NF）-κB炎癥信號途徑，調(diào)節(jié)并參與幫助泡沫細(xì)胞的移除，從動脈粥樣硬化的斑塊當(dāng)中。此種方式可以提供新的手段在預(yù)防及治療動脈粥樣硬化上，為廣大臨床患者獲得更高的治療途徑。

心外膜脂肪細(xì)胞核因子（NF）-κB信號途徑；抵抗動脈粥樣硬化；作用分析

血管壁的纖維化與脂質(zhì)沉積是發(fā)生在大動脈的一種慢性的炎癥性的疾病，稱為動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）[1]。有相關(guān)研究證明，其特征為由泡沫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞衍生而來），積蓄在血管內(nèi)壁中，由纖維細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞聚集、血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、鈣化以及纖維化等多種復(fù)雜的過程構(gòu)成，出現(xiàn)管壁缺血缺氧、管腔狹窄等，以斑塊形成為最終結(jié)果[2]。本研究旨在分析心外膜脂肪細(xì)胞核因子（NF）-κB信號途徑的抑制，其在調(diào)節(jié)AS的發(fā)展形成的作用分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器試劑 由上海光密儀器有限公司生產(chǎn)的型號為GFM-550熒光顯微鏡、由普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司提供型號為PUZS-300的全自動生化分析儀。美國SCIENCELL公司購置人單核細(xì)胞株，SIRT1、胎牛血清、RPMI1640型號細(xì)胞培養(yǎng)基均于澳大利亞Gibco公司。腫瘤壞死因子（TNF）-α與（NF）-κB購置于澳大利亞Gibco公司。

1.2 泡沫細(xì)胞模型的建立與染色 RPMI1640型號細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清培養(yǎng)。放置12 h于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，加入青霉素100 mg/mL與鏈霉素100 U/mL，誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞。調(diào)整濃度為1×106個/mL，接種數(shù)對長期細(xì)胞與6孔板上面加入軟質(zhì)酸鈉調(diào)整濃度共育24 h，最終建立出泡沫細(xì)胞的模型。將誘導(dǎo)完成的巨噬細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞玻片，以4%多聚甲醛固定后，行油紅O染色。

1.3 分組 分為空白組，siRNA干擾組，轉(zhuǎn)染試劑組，高脂組，高脂+SRT1720+siRNA干擾組，高脂+SRT1720組。常規(guī)培養(yǎng)為空白組；空白組+5μL轉(zhuǎn)染試劑為轉(zhuǎn)染試劑組；轉(zhuǎn)染試劑組+6μmol/L的SIRT1干擾為siRNA干擾組；空白組+0.08 g/L的ox-LDL+0.2 mmol/L軟脂酸鈉為高脂組；高脂+SRT1720+6μmol/L的SIRT1干擾siRNA為高脂+SRT1720+siRNA干擾組。siRNA的干擾過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4 蛋白表達(dá)及印記分析 采用4℃磷酸鹽沖洗細(xì)胞1 min/次，2次/d。細(xì)胞冰上裂解、離心30 min后吸取上清液測定蛋白濃度。采用電化學(xué)發(fā)光法，進(jìn)行系統(tǒng)分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 泡沫細(xì)胞膜型建立 在誘導(dǎo)下的細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化，大部分細(xì)胞分化良好出現(xiàn)偽足呈梭形貼近壁生長，則提示以分化稱為巨噬細(xì)胞。由于ox-LDL及軟脂酸鈉的共同作用，細(xì)胞質(zhì)顯現(xiàn)紅色脂質(zhì)顆粒，與泡沫細(xì)胞特點形態(tài)一致，提示模型建立成功。見圖1、圖2。

圖1 泡沫細(xì)胞（箭頭處為典型改變，×200）

圖2 巨噬細(xì)胞（×200）

2.2 （NF）-κB信號途徑及Western印記的結(jié)果 高脂+SRT1720組相對于高脂組升高明顯，其下游的靶向分子腫瘤壞死因子（TNF）-α蛋白表達(dá)量及（NF）-κB下降顯著。SIRT1蛋白表達(dá)量高脂+SRT1720+siRNA干擾組比高脂+SRT1720組相比下降量更為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 5組的（NF）-κB信號途徑及Western印記的結(jié)果

3 討論

動脈粥樣硬化，急性發(fā)病或者其并發(fā)癥是致死的重要因素，且隨著我國生活水平的不斷提高，油脂攝入過剩，此病發(fā)病也隨之升高[3]。導(dǎo)致動脈硬化的生物學(xué)特征即是血管內(nèi)斑塊的形成與破裂，由于斑塊內(nèi)部的機(jī)構(gòu)、血流等至其不穩(wěn)定時出現(xiàn)。其急性并發(fā)癥的發(fā)生、損傷及早期過程均有炎癥的信號通路參與此類過程[4]。（NF）-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子存在于細(xì)胞內(nèi)部，可能是AS發(fā)生發(fā)展的主要因素之一。在斑塊血管內(nèi)壁細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞均可以參與（NF）-κB的激活。其存在于靜息的細(xì)胞漿液中以非活性的形式存在，當(dāng)動脈發(fā)生硬化時，（NF）-κB細(xì)胞被刺激以激活，作用于靶向基因，使炎性因子釋放于表達(dá)，可以促進(jìn)其增值于遷移，而促成了AS的發(fā)生發(fā)展。AS的血管內(nèi)壁（NF）-κB存在于內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、泡沫細(xì)胞中，而可見輕微（NF）-κB活化存在于無動脈硬化的斑塊當(dāng)中[5]。有文獻(xiàn)表明在AS的發(fā)展發(fā)生前期，部分損傷及內(nèi)皮層相對完整的時候均可見活化的（NF）-κB[6]。有研究文獻(xiàn)證實AS患者心臟外膜的脂肪當(dāng)中（NF）-κB的表達(dá)情況有明顯的增高，其炎性反應(yīng)通過巨噬細(xì)胞表面的受體與結(jié)合，利用（NF）-κB信號傳導(dǎo)途徑參與[7]。動物實驗中（NF）-κB亞基可使斑塊明顯的被縮小，以減少其泡沫細(xì)胞的含量，其通過（NF）-κB信號通路的調(diào)控，使炎癥信號存在于泡沫細(xì)胞中受到一定的調(diào)節(jié)作用，可使AS斑塊消退。從本研究中可明顯看出，模型被成功建立之后，從SIRT1蛋白表達(dá)量來看，高脂+SRT1720組相對于高脂組升高明顯，其下游的靶向分子腫瘤壞死因子（TNF）-α蛋白表達(dá)量及（NF）-κB顯著下降[8]。SIRT1蛋白表達(dá)量高脂+SRT1720+siRNA干擾組比高脂+SRT1720組相比下降量更為顯著，其下游的靶向分子腫瘤壞死因子（TNF）-α蛋白表達(dá)量及（NF）-κB升高更為顯著。

綜上所述，泡沫細(xì)胞模型中（NF）-κB的信號通路上游是SIRT1，其作用為抑制心外膜脂肪細(xì)胞核因子（NF）-κB炎癥信號途徑，調(diào)節(jié)并參與幫助泡沫細(xì)胞的移除，為廣大臨床患者獲得更高的治療途徑。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2017.30.060