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        補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷大鼠線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1及細胞色素C表達的影響*

        2017-11-01 07:33:48王士雷孔憲剛藏圓圓
        陜西中醫(yī) 2017年10期
        關鍵詞:補陽腦缺血海馬

        韋 辰,王士雷,孔憲剛,藏圓圓,李 瑜△

        1.青島大學附屬醫(yī)院麻醉科(青島266000),2.山東省濟寧市人民醫(yī)院麻醉科(濟寧272001)

        ·實驗研究·

        補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷大鼠線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1及細胞色素C表達的影響*

        韋 辰1,王士雷1,孔憲剛2,藏圓圓1,李 瑜1△

        1.青島大學附屬醫(yī)院麻醉科(青島266000),2.山東省濟寧市人民醫(yī)院麻醉科(濟寧272001)

        目的:觀察補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷大鼠線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1及細胞色素C表達的影響。方法:將45只健康SD大鼠分為正常對照組、模型對照組、補陽還五湯組各15只,模型對照組以及補陽還五湯組給予Bannister's頸動脈引流法以建立大鼠缺血再灌注腦損傷的動物模型,補陽還五湯組于造模造模后腹腔給藥補陽還五湯0.4ml/(kg·d) 1次,共用藥7d,其余兩組給予使用方式、劑量及使用頻率和補陽還五湯組相同至實驗結束。比較各組大鼠情況、神經(jīng)功能缺損評分、海馬神經(jīng)細胞凋亡率、Drp1,F(xiàn)is1和cyt-c的表達水平、Ca2+熒光強度、鈣調神經(jīng)磷酸酶活性比較。結果:治療后,與正常對照組相比,模型對照組及補陽還五湯組Drp1、Fis1及cyt-c表達水平較高(P<0.05),神經(jīng)功能評分較高(P<0.05),海馬神經(jīng)元細胞凋亡率較高(P<0.05),Ca2+濃度及鈣調神經(jīng)磷酸酶活性較高(P<0.05);與模型對照組相比,補陽還五湯組Drp1、Fis1及cyt-c表達水平較低(P<0.05),神經(jīng)功能評分較低(P<0.05),海馬神經(jīng)細胞凋亡率較低(P<0.05),Ca2+濃度及鈣調神經(jīng)磷酸酶活性較低(P<0.05)。結論:補陽還五湯可在一定程度上下調缺血再灌注腦損傷大鼠Drp1、Fis1、cyt-c的表達水平以及海馬神經(jīng)細胞凋亡率,抑制線粒體分裂減輕大鼠海馬神經(jīng)元缺氧復氧損傷,緩解腦缺血進一步損傷,有望為臨床治療方面提供新的干預方法。

        心腦血管疾病是威脅人類健康的重要疾病[1-2],本病的發(fā)病率、死亡率以及致殘率均呈逐年升高趨勢。研究發(fā)現(xiàn),腦組織對缺血缺氧較為敏感,一般缺血再灌注患者多存在加重腦功能損傷[3],使患者學習記憶功能下降,為本人及其家庭以及社會帶來沉重的經(jīng)濟、心理負擔。臨床處理缺血后再灌注損傷,一般應用多種藥物進行預處理以及后處理。綜合近年來腦缺血再灌注損傷方面的臨床研究發(fā)現(xiàn),中醫(yī)藥治療缺血再灌注腦損傷中獲得一定的進展。補陽還五湯是治療缺血性腦血管疾病和其后遺癥的理想中藥制劑,由黃芪、當歸尾、川芎、赤芍、桃仁、紅花以及地龍等中藥組成,具有補氣活血、通絡祛瘀之功效,在機體代謝過程中能夠產(chǎn)生自由基和脂類過氧化物[4],改善微循環(huán),加速腦缺血損傷修復。有研究顯示,補陽還五湯能夠擴張血管,使心率及血壓水平降低,減緩心肌細胞代謝,使心肌細胞氧耗水平降低[5],線粒體ATP儲存量降低,以緩解缺血再灌注腦損傷。此外,海馬區(qū)腦組織是缺氧缺血反應較為敏感區(qū)域,線粒體分裂相關蛋白Drpl及Fisl的共定位結合能夠促進線粒體分裂,使腦損傷加重[6]。臨床針對本方面的報道較少,因此本文利用缺血再灌注腦損傷模型大鼠,以探究補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷大鼠線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1及細胞色素C表達的影響。

        材料與方法

        1 材 料 補陽還五湯(由黃芪、赤芍各30 g,當歸尾15 g,川芎、桃仁、紅花、地龍各10 g組成,上藥水煎煮過濾取上清液,調藥濃度至200%,采用高壓滅菌于4℃環(huán)境內(nèi)保存待用,取汁50ml),藥物及煎煮設備由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑室提供;注射用異戊巴比妥鈉,規(guī)格:每支0.25 g,批號:20160112,上海新亞藥業(yè)有限公司;10%甲醛溶液、4%多聚甲醛、4%甲醇、10%水合氯醛、胰酶、蘇木素以及伊紅染料等由西恩(大連)生物技術有限公司提供;DMEM F12 10 X 500 ml,上海意杰生物科技有限公司;碘化丙啶及Annexin-V,北京泰澤瑞達科技有限公司;Fluo3-AM以及Pluronic F127,西寶生物科技(上海)股份有限公司。

        美國Buxco公司的FinePointe小動物通用呼吸機,北京拜安吉科技有限公司;小動物行為活動記錄系統(tǒng),香港友誠生物科技有限公司;HM525冰凍切片機,北京華興科儀科技發(fā)展有限公司;Storm多功能圖像分析儀,通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展(上海)有限公司(GE);MIA-V型生物顯微圖像分析系統(tǒng),杭州萬深檢測科技有限公司;Apogee A50 Micro流式細胞儀,香港伯齊科技有限公司;鼠抗Drpl單克隆抗體一抗、鼠抗Cyt C單克隆抗體一抗、鼠抗Cyt C單克隆抗體一抗,北京百奧萊博科技有限公司;尼康 Nikon C1Si激光共聚焦顯微鏡,上海衡浩儀器有限公司;Annexin V-FITC Apoptosis Detection試劑盒,北京永泰興成商貿(mào)有限公司。

        2 實驗方法

        2.1 實驗分組:選擇45只健康SD大鼠SPF級,體重(300±35) g,大鼠由南京君科生物工程有限公司提供,貨號:J007。醫(yī)動字第19~2050號。動物許可證號:SYXK(京)2017-0113。將45只大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組及補陽還五湯組,每組各15只。分籠飼養(yǎng),大鼠使用的籠具、飼料及墊料等均高壓消毒,能夠正常自由飲水,標準飼料喂養(yǎng),大鼠應用物品每隔3 d進行消毒。實驗室溫度維持于21℃~23℃,適應性喂養(yǎng)1周。

        2.2 模型建立:所有大鼠造模前均接受10 h禁食水。模型對照組及補陽還五湯組采用Bannister's頸動脈引流法[7],腦缺血再灌注模型制作方式如下:健康Wistar大鼠仰面固定于手術臺上,予以3%注射用異戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射實施麻醉,肝素100 U/kg尾靜脈注射抗凝,行氣管插管,小動物呼吸機輔助呼吸,以60 次/min,潮氣量15 ml/kg,將兩側頸總動脈及右側頸淺靜脈進行分離,夾閉左側頸總動脈并結扎右側頸總動脈近心端與右側頸淺靜脈遠心端,將右側頸總動脈和頸淺靜脈間采用導管搭橋,令基底動脈的血流從右側頸內(nèi)動脈以及頸總動脈逆流至頸靜脈形成腦缺血,潮氣量降低為10 ml/kg,15 min后打開夾閉的頸總動脈,將右側頸總動脈回流切斷,如此反復缺血再灌注3次,最后回復血供,縫合皮膚。正常對照組只分離動脈但不插線。蘇醒后根據(jù)Longa’s 的5級標準評分標準對神經(jīng)功能進行評分,選擇1~3分的大鼠進行實驗。

        2.3 給藥方法:模型建立成功后,補陽還五湯組予以腹腔注射補陽還五湯1 ml /100(mg·d),共用藥7 d,其余兩組均給予等量0.9%氯化鈉,使用方法、劑量及使用頻率和補陽還五湯組完全相同至實驗結束。每日喂養(yǎng)全價飼料,自由飲水,保證充足飲水,維持每日人工排尿3次。

        3 觀察指標 研究期間,觀察并記錄大鼠活動、飲食飲水以及毛色情況,測量體質量。

        所有受試大鼠均于用藥第7日進行神經(jīng)功能缺損評分,參考Garcia標準[7]對大鼠自發(fā)性活動、四肢運動對稱、前腳伸展、攀登、對雙側軀干的接觸反應以及觸須反應進行評定,各項評分1~3分,總評分最低分3分,最高分18分。

        10%水合氯醛(3.5ml/100g)腹腔注射麻醉后,心臟灌注生理鹽水及4%多聚甲醛,灌注完畢后在0℃下迅速斷頭取腦,獲取海馬組織,加入0.5%的胰酶在37℃下恒溫水浴消化20 min,消化完全后置入10%血清DMEM-F12培養(yǎng)基內(nèi)終止消化,將海馬組織消化懸液過濾并于1200r/min-1離心15 min,棄上清液洗滌,將其置于4%甲醛溶液內(nèi)固定保存,便于免疫組化檢測以及細胞凋亡檢測。采用Western blot法檢測線粒體分裂相關1(Drp1)、線粒體分裂蛋白1(Fis1)以及細胞色素c (cyt-c)表達水平。消化、離心收集神經(jīng)元細胞,并稀釋為1×106/L細胞懸液,與碘化丙啶及Annexin-V混合,震蕩室溫避光孵育15 min,應用流式細胞儀以及統(tǒng)計分析軟件檢測細胞凋亡率;采用24孔板爬片培養(yǎng)的神經(jīng)元,利用Hank沖洗液沖洗3~5遍,置入Fluo3-AM以及Pluronic F127工作液體避光染色45 min,利用Hank沖洗液沖洗3~5遍,4%多聚甲醇固定,甘油防淬滅封片后,采用激光共聚焦顯微鏡檢測Ca2+熒光強度為Ca2+濃度;進行細胞刮除、離心收集神經(jīng)元后,裂解細胞并提取蛋白,應用BCA法檢測蛋白濃度,并應用CaN detection試劑盒檢測鈣調神經(jīng)磷酸酶活性。

        結 果

        1 各組大鼠情況 實驗過程中嚴格遵守無菌操作,正常對照組大鼠毛色光亮,活動正常,能夠正常飲水飲食,前腿伸展情況良好,四肢能夠正常爬行,平均體重為(310.45±36.54)g;模型對照組大鼠毛色暗,活動度顯著降低,進食困難,肢體行動極度無力甚至不能運動,四肢攀爬困難,反應弛緩,平均體重為(252.53±27.39)g;補陽還五湯組造模期間大鼠毛色暗,但應用補陽還五湯皮下注射后,部分大鼠毛色恢復光亮,癥狀有所緩解,活動正常,飲食飲水正常,肢體行動活動較模型對照組好轉,四肢能夠正常攀爬,反應較模型組迅速,平均體重為(281.39±33.70) g。

        2 各組大鼠海馬神經(jīng)原相關蛋白表達水平比較 治療后,與正常對照組相比,模型對照組及補陽還五湯組Drp1、Fis1及cyt-c表達水平較高(P<0.05);與模型對照組相比,補陽還五湯組Drp1、Fis1及cyt-c表達水平較低(P<0.05),見表1。

        表1 各組大鼠海馬神經(jīng)原相關蛋白表達水平比較

        注:與正常對照組比較,*P<0.05;與模型對照組比較,#P<0.05

        3 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 正常對照組神經(jīng)功能評分為0,模型對照組為(1.89±0.24)分,補陽還五湯組為(1.07±0.16)分, 治療后,與正常對照組相比,模型對照組以及補陽還五湯組神經(jīng)功能評分較高(P<0.05);與模型對照組相比,補陽還五湯組神經(jīng)功能評分較低(P<0.05)。

        4 各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡率比較 治療后,與正常對照組細胞凋亡率(2.30±0.35)%相比,模型對照組細胞凋亡率(50.39±7.08)%及補陽還五湯組海馬神經(jīng)元細胞凋亡率(29.39±4.02)%較高(P<0.05);與模型對照組相比,補陽還五湯組海馬神經(jīng)細胞凋亡率較低(P<0.05)。

        5 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元各指標比較 治療后,與正常對照組相比,模型對照組及補陽還五湯Ca2+濃度及鈣調神經(jīng)磷酸酶活性較高(P<0.05);與模型對照組相比,補陽還五湯組Ca2+濃度及鈣調神經(jīng)磷酸酶活性較低(P<0.05),見表2。

        表2 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元各指標比較

        注:與正常對照組比較,*P<0.05;與模型對照組比較,#P<0.05

        討 論

        心血管病發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加,其中發(fā)病最高的即為缺血性腦血管病[8]。腦缺血發(fā)生時腦組織內(nèi)生物電發(fā)生改變,產(chǎn)生病理性慢波并經(jīng)過一定時間發(fā)生再灌注,慢波持續(xù)并加重,隨缺血損傷時間不斷延長,興奮性遞質水平下降[9],缺血期的可逆性損傷經(jīng)恢復血流后加重或轉化,出現(xiàn)不可逆損傷,即腦缺血再灌注損傷[10]。腦缺血所引起的腦功能損傷對患者生活質量及其家庭造成惡劣影響。為此尋求改善腦缺血再灌注的治療藥物是當前醫(yī)學界的關鍵課題之一,補陽還五湯是一種具有補氣活血、通經(jīng)活絡作用的湯劑,已有研究證實,補陽還五湯中黃芪能夠擴張血管、降低血壓[11];川芎能夠活血行氣、祛風之痛,其所含主要成分生物堿川芎嗪能通過誘導血栓素A2樣物質從而抑制血小板聚集[12];當歸、赤芍、桃仁、紅花以及地龍等藥物均能夠改善微循環(huán),抑制血小板聚集。

        現(xiàn)代研究顯示,海馬腦區(qū)是腦缺血再灌注的選擇性易損區(qū),細胞凋亡是一個持續(xù)動態(tài)變化過程[13],同時伴有大鼠海馬皮層及海馬神經(jīng)細胞核固縮、退化、變形、壞死甚至消失,使海馬細胞排列不規(guī)則存在凹陷,海馬神經(jīng)元細胞凋亡率增高[14]。此外鈣超載是誘發(fā)腦缺血再灌注損傷的關鍵機制之一,鈣調神經(jīng)磷酸酶活性和細胞內(nèi)鈣離子的濃度具有緊密聯(lián)系,能夠直接或間接激活線粒體分裂相關蛋白Drpl(Drp1),以促進Drp1由細胞質轉位至線粒體外膜,并與Fis1相結合誘發(fā)線粒體分裂。自1850年人類發(fā)現(xiàn)線粒體,對其結構和認識不斷進展,現(xiàn)今我們對線粒體的定義已不是靜止而是不斷融合-分裂的動態(tài)網(wǎng)狀系統(tǒng)亞細胞結構,能夠維持線粒體膜電位,對心肌纖維具有重要的影響作用[15]。現(xiàn)代研究顯示,線粒體參與線粒體生物再生、細胞氧化代謝、細胞壞死以及凋亡等多種細胞的生理過程,其中Drp1是加速細胞分裂的主要蛋白,分布于細胞漿內(nèi),是街道線粒體分裂的主要分子,其表達水平較高能夠誘發(fā)線粒體網(wǎng)狀結構受損。曾有研究顯示,線粒體動力相關蛋白Drpl水平升高,線粒體的分裂加速,網(wǎng)狀結構受損從而抑制線粒體動力相關蛋白,加速線粒體融合以及延長網(wǎng)狀結構,加速線粒體損傷的修復。細胞色素c (cyt-c)是一種重要的水溶性氧化還原血紅蛋白,是電子呼吸鏈重要的成員,分布于原核生物以及真核生物細胞的線粒體內(nèi)膜內(nèi),是參與氧化還原反應電子傳遞中的重要物質。近年來曾有研究人員對cyt-c進行研究發(fā)現(xiàn),以cyt-c為代表的氧化還原蛋白質和酶的直接電化學不僅與機體內(nèi)在的熱力學以及動力學性質具有緊密聯(lián)系,還能夠加速電極物質和具有高催化、傳感性的生物大分子結合作用,是機體物質代謝及能量轉換的關鍵環(huán)節(jié)。我們研究顯示,治療后,與正常對照組相比,模型對照組及補陽還五湯組Drp1、Fis1及cyt-c表達水平,神經(jīng)功能評分,海馬神經(jīng)元細胞凋亡率,Ca2+濃度及鈣調神經(jīng)磷酸酶活性較高;與模型對照組相比,補陽還五湯組Drp1、Fis1及cyt-c表達水平,神經(jīng)功能評分,海馬神經(jīng)元細胞凋亡率,Ca2+濃度及鈣調神經(jīng)磷酸酶活性較低。提示補陽還五湯通過抑制Drp1、Fis1及cyt-c表達發(fā)揮了對腦缺血再灌注大鼠的腦保護作用,降低海馬神經(jīng)元細胞凋亡率,可能是補陽還五湯防止缺血性腦血管疾病的主要機制之一。

        綜上所述:補陽還五湯可在一定程度上下調缺血再灌注腦損傷大鼠Drp1、Fis1、cyt-c的表達水平以及海馬神經(jīng)細胞凋亡率,抑制線粒體分裂減輕大鼠海馬神經(jīng)元缺氧復氧損傷,緩解腦缺血進一步損傷,有望為臨床治療方面提供新的干預方法。

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        *國家自然科學基金資助項目(81371448)

        △通訊作者

        腦缺血/中西醫(yī)結合療法 補陽還五湯 再灌注損傷 線粒體分裂蛋白1 線粒體分裂基因動態(tài)相關蛋白 細胞色素C 動物,實驗

        R743.31

        A

        10.3969/j.issn.1000-7369.2017.10.080

        (收稿:2017-04-28)

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