韋 辰，王士雷，孔憲剛，藏圓圓，李 瑜△

1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科(青島266000)，2.山東省濟(jì)寧市人民醫(yī)院麻醉科(濟(jì)寧272001)

·實(shí)驗(yàn)研究·

補(bǔ)陽還五湯對腦缺血再灌注損傷大鼠線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1及細(xì)胞色素C表達(dá)的影響*

韋 辰1，王士雷1，孔憲剛2，藏圓圓1，李 瑜1△

1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科(青島266000)，2.山東省濟(jì)寧市人民醫(yī)院麻醉科(濟(jì)寧272001)

目的：觀察補(bǔ)陽還五湯對腦缺血再灌注損傷大鼠線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1及細(xì)胞色素C表達(dá)的影響。方法：將45只健康SD大鼠分為正常對照組、模型對照組、補(bǔ)陽還五湯組各15只，模型對照組以及補(bǔ)陽還五湯組給予Bannister's頸動脈引流法以建立大鼠缺血再灌注腦損傷的動物模型，補(bǔ)陽還五湯組于造模造模后腹腔給藥補(bǔ)陽還五湯0.4ml/(kg·d) 1次，共用藥7d，其余兩組給予使用方式、劑量及使用頻率和補(bǔ)陽還五湯組相同至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。比較各組大鼠情況、神經(jīng)功能缺損評分、海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、Drp1，F(xiàn)is1和cyt-c的表達(dá)水平、Ca2+熒光強(qiáng)度、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性比較。結(jié)果：治療后，與正常對照組相比，模型對照組及補(bǔ)陽還五湯組Drp1、Fis1及cyt-c表達(dá)水平較高(P<0.05)，神經(jīng)功能評分較高(P<0.05)，海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率較高(P<0.05)，Ca2+濃度及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性較高(P<0.05)；與模型對照組相比，補(bǔ)陽還五湯組Drp1、Fis1及cyt-c表達(dá)水平較低(P<0.05)，神經(jīng)功能評分較低(P<0.05)，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較低(P<0.05)，Ca2+濃度及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性較低(P<0.05)。結(jié)論：補(bǔ)陽還五湯可在一定程度上下調(diào)缺血再灌注腦損傷大鼠Drp1、Fis1、cyt-c的表達(dá)水平以及海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，抑制線粒體分裂減輕大鼠海馬神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷，緩解腦缺血進(jìn)一步損傷，有望為臨床治療方面提供新的干預(yù)方法。

心腦血管疾病是威脅人類健康的重要疾病[1-2]，本病的發(fā)病率、死亡率以及致殘率均呈逐年升高趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，腦組織對缺血缺氧較為敏感，一般缺血再灌注患者多存在加重腦功能損傷[3]，使患者學(xué)習(xí)記憶功能下降，為本人及其家庭以及社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)、心理負(fù)擔(dān)。臨床處理缺血后再灌注損傷，一般應(yīng)用多種藥物進(jìn)行預(yù)處理以及后處理。綜合近年來腦缺血再灌注損傷方面的臨床研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥治療缺血再灌注腦損傷中獲得一定的進(jìn)展。補(bǔ)陽還五湯是治療缺血性腦血管疾病和其后遺癥的理想中藥制劑，由黃芪、當(dāng)歸尾、川芎、赤芍、桃仁、紅花以及地龍等中藥組成，具有補(bǔ)氣活血、通絡(luò)祛瘀之功效，在機(jī)體代謝過程中能夠產(chǎn)生自由基和脂類過氧化物[4]，改善微循環(huán)，加速腦缺血損傷修復(fù)。有研究顯示，補(bǔ)陽還五湯能夠擴(kuò)張血管，使心率及血壓水平降低，減緩心肌細(xì)胞代謝，使心肌細(xì)胞氧耗水平降低[5]，線粒體ATP儲存量降低，以緩解缺血再灌注腦損傷。此外，海馬區(qū)腦組織是缺氧缺血反應(yīng)較為敏感區(qū)域，線粒體分裂相關(guān)蛋白Drpl及Fisl的共定位結(jié)合能夠促進(jìn)線粒體分裂，使腦損傷加重[6]。臨床針對本方面的報(bào)道較少，因此本文利用缺血再灌注腦損傷模型大鼠，以探究補(bǔ)陽還五湯對腦缺血再灌注損傷大鼠線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1及細(xì)胞色素C表達(dá)的影響。

材料與方法

1 材 料 補(bǔ)陽還五湯(由黃芪、赤芍各30 g，當(dāng)歸尾15 g，川芎、桃仁、紅花、地龍各10 g組成，上藥水煎煮過濾取上清液，調(diào)藥濃度至200%，采用高壓滅菌于4℃環(huán)境內(nèi)保存待用，取汁50ml)，藥物及煎煮設(shè)備由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑室提供；注射用異戊巴比妥鈉，規(guī)格：每支0.25 g，批號：20160112，上海新亞藥業(yè)有限公司；10%甲醛溶液、4%多聚甲醛、4%甲醇、10%水合氯醛、胰酶、蘇木素以及伊紅染料等由西恩(大連)生物技術(shù)有限公司提供；DMEM F12 10 X 500 ml，上海意杰生物科技有限公司；碘化丙啶及Annexin-V，北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司；Fluo3-AM以及Pluronic F127，西寶生物科技(上海)股份有限公司。

美國Buxco公司的FinePointe小動物通用呼吸機(jī)，北京拜安吉科技有限公司；小動物行為活動記錄系統(tǒng)，香港友誠生物科技有限公司；HM525冰凍切片機(jī)，北京華興科儀科技發(fā)展有限公司；Storm多功能圖像分析儀，通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展(上海)有限公司(GE)；MIA-V型生物顯微圖像分析系統(tǒng)，杭州萬深檢測科技有限公司；Apogee A50 Micro流式細(xì)胞儀，香港伯齊科技有限公司；鼠抗Drpl單克隆抗體一抗、鼠抗Cyt C單克隆抗體一抗、鼠抗Cyt C單克隆抗體一抗，北京百奧萊博科技有限公司；尼康 Nikon C1Si激光共聚焦顯微鏡，上海衡浩儀器有限公司；Annexin V-FITC Apoptosis Detection試劑盒，北京永泰興成商貿(mào)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組：選擇45只健康SD大鼠SPF級，體重(300±35) g，大鼠由南京君科生物工程有限公司提供，貨號：J007。醫(yī)動字第19～2050號。動物許可證號：SYXK(京)2017-0113。將45只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組及補(bǔ)陽還五湯組，每組各15只。分籠飼養(yǎng)，大鼠使用的籠具、飼料及墊料等均高壓消毒，能夠正常自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，大鼠應(yīng)用物品每隔3 d進(jìn)行消毒。實(shí)驗(yàn)室溫度維持于21℃～23℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2.2 模型建立：所有大鼠造模前均接受10 h禁食水。模型對照組及補(bǔ)陽還五湯組采用Bannister's頸動脈引流法[7]，腦缺血再灌注模型制作方式如下：健康Wistar大鼠仰面固定于手術(shù)臺上，予以3%注射用異戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射實(shí)施麻醉，肝素100 U/kg尾靜脈注射抗凝，行氣管插管，小動物呼吸機(jī)輔助呼吸，以60 次/min，潮氣量15 ml/kg，將兩側(cè)頸總動脈及右側(cè)頸淺靜脈進(jìn)行分離，夾閉左側(cè)頸總動脈并結(jié)扎右側(cè)頸總動脈近心端與右側(cè)頸淺靜脈遠(yuǎn)心端，將右側(cè)頸總動脈和頸淺靜脈間采用導(dǎo)管搭橋，令基底動脈的血流從右側(cè)頸內(nèi)動脈以及頸總動脈逆流至頸靜脈形成腦缺血，潮氣量降低為10 ml/kg，15 min后打開夾閉的頸總動脈，將右側(cè)頸總動脈回流切斷，如此反復(fù)缺血再灌注3次，最后回復(fù)血供，縫合皮膚。正常對照組只分離動脈但不插線。蘇醒后根據(jù)Longa’s 的5級標(biāo)準(zhǔn)評分標(biāo)準(zhǔn)對神經(jīng)功能進(jìn)行評分，選擇1～3分的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 給藥方法：模型建立成功后，補(bǔ)陽還五湯組予以腹腔注射補(bǔ)陽還五湯1 ml /100(mg·d)，共用藥7 d，其余兩組均給予等量0.9%氯化鈉，使用方法、劑量及使用頻率和補(bǔ)陽還五湯組完全相同至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每日喂養(yǎng)全價飼料，自由飲水，保證充足飲水，維持每日人工排尿3次。

3 觀察指標(biāo) 研究期間，觀察并記錄大鼠活動、飲食飲水以及毛色情況，測量體質(zhì)量。

所有受試大鼠均于用藥第7日進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，參考Garcia標(biāo)準(zhǔn)[7]對大鼠自發(fā)性活動、四肢運(yùn)動對稱、前腳伸展、攀登、對雙側(cè)軀干的接觸反應(yīng)以及觸須反應(yīng)進(jìn)行評定，各項(xiàng)評分1～3分，總評分最低分3分，最高分18分。

10%水合氯醛(3.5ml/100g)腹腔注射麻醉后，心臟灌注生理鹽水及4%多聚甲醛，灌注完畢后在0℃下迅速斷頭取腦，獲取海馬組織，加入0.5%的胰酶在37℃下恒溫水浴消化20 min，消化完全后置入10%血清DMEM-F12培養(yǎng)基內(nèi)終止消化，將海馬組織消化懸液過濾并于1200r/min-1離心15 min，棄上清液洗滌，將其置于4%甲醛溶液內(nèi)固定保存，便于免疫組化檢測以及細(xì)胞凋亡檢測。采用Western blot法檢測線粒體分裂相關(guān)1(Drp1)、線粒體分裂蛋白1(Fis1)以及細(xì)胞色素c (cyt-c)表達(dá)水平。消化、離心收集神經(jīng)元細(xì)胞，并稀釋為1×106/L細(xì)胞懸液，與碘化丙啶及Annexin-V混合，震蕩室溫避光孵育15 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀以及統(tǒng)計(jì)分析軟件檢測細(xì)胞凋亡率；采用24孔板爬片培養(yǎng)的神經(jīng)元，利用Hank沖洗液沖洗3～5遍，置入Fluo3-AM以及Pluronic F127工作液體避光染色45 min，利用Hank沖洗液沖洗3～5遍，4%多聚甲醇固定，甘油防淬滅封片后，采用激光共聚焦顯微鏡檢測Ca2+熒光強(qiáng)度為Ca2+濃度；進(jìn)行細(xì)胞刮除、離心收集神經(jīng)元后，裂解細(xì)胞并提取蛋白，應(yīng)用BCA法檢測蛋白濃度，并應(yīng)用CaN detection試劑盒檢測鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性。

結(jié) 果

1 各組大鼠情況 實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，正常對照組大鼠毛色光亮，活動正常，能夠正常飲水飲食，前腿伸展情況良好，四肢能夠正常爬行，平均體重為(310.45±36.54)g；模型對照組大鼠毛色暗，活動度顯著降低，進(jìn)食困難，肢體行動極度無力甚至不能運(yùn)動，四肢攀爬困難，反應(yīng)弛緩，平均體重為(252.53±27.39)g；補(bǔ)陽還五湯組造模期間大鼠毛色暗，但應(yīng)用補(bǔ)陽還五湯皮下注射后，部分大鼠毛色恢復(fù)光亮，癥狀有所緩解，活動正常，飲食飲水正常，肢體行動活動較模型對照組好轉(zhuǎn)，四肢能夠正常攀爬，反應(yīng)較模型組迅速，平均體重為(281.39±33.70) g。

2 各組大鼠海馬神經(jīng)原相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 治療后，與正常對照組相比，模型對照組及補(bǔ)陽還五湯組Drp1、Fis1及cyt-c表達(dá)水平較高(P<0.05)；與模型對照組相比，補(bǔ)陽還五湯組Drp1、Fis1及cyt-c表達(dá)水平較低(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠海馬神經(jīng)原相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05

3 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 正常對照組神經(jīng)功能評分為0，模型對照組為(1.89±0.24)分，補(bǔ)陽還五湯組為(1.07±0.16)分， 治療后，與正常對照組相比，模型對照組以及補(bǔ)陽還五湯組神經(jīng)功能評分較高(P<0.05)；與模型對照組相比，補(bǔ)陽還五湯組神經(jīng)功能評分較低(P<0.05)。

4 各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較 治療后，與正常對照組細(xì)胞凋亡率(2.30±0.35)%相比，模型對照組細(xì)胞凋亡率(50.39±7.08)%及補(bǔ)陽還五湯組海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率(29.39±4.02)%較高(P<0.05)；與模型對照組相比，補(bǔ)陽還五湯組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較低(P<0.05)。

5 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元各指標(biāo)比較 治療后，與正常對照組相比，模型對照組及補(bǔ)陽還五湯Ca2+濃度及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性較高(P<0.05)；與模型對照組相比，補(bǔ)陽還五湯組Ca2+濃度及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性較低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元各指標(biāo)比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05

討 論

心血管病發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加，其中發(fā)病最高的即為缺血性腦血管病[8]。腦缺血發(fā)生時腦組織內(nèi)生物電發(fā)生改變，產(chǎn)生病理性慢波并經(jīng)過一定時間發(fā)生再灌注，慢波持續(xù)并加重，隨缺血損傷時間不斷延長，興奮性遞質(zhì)水平下降[9]，缺血期的可逆性損傷經(jīng)恢復(fù)血流后加重或轉(zhuǎn)化，出現(xiàn)不可逆損傷，即腦缺血再灌注損傷[10]。腦缺血所引起的腦功能損傷對患者生活質(zhì)量及其家庭造成惡劣影響。為此尋求改善腦缺血再灌注的治療藥物是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界的關(guān)鍵課題之一，補(bǔ)陽還五湯是一種具有補(bǔ)氣活血、通經(jīng)活絡(luò)作用的湯劑，已有研究證實(shí)，補(bǔ)陽還五湯中黃芪能夠擴(kuò)張血管、降低血壓[11]；川芎能夠活血行氣、祛風(fēng)之痛，其所含主要成分生物堿川芎嗪能通過誘導(dǎo)血栓素A2樣物質(zhì)從而抑制血小板聚集[12]；當(dāng)歸、赤芍、桃仁、紅花以及地龍等藥物均能夠改善微循環(huán)，抑制血小板聚集。

現(xiàn)代研究顯示，海馬腦區(qū)是腦缺血再灌注的選擇性易損區(qū)，細(xì)胞凋亡是一個持續(xù)動態(tài)變化過程[13]，同時伴有大鼠海馬皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞核固縮、退化、變形、壞死甚至消失，使海馬細(xì)胞排列不規(guī)則存在凹陷，海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率增高[14]。此外鈣超載是誘發(fā)腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度具有緊密聯(lián)系，能夠直接或間接激活線粒體分裂相關(guān)蛋白Drpl(Drp1)，以促進(jìn)Drp1由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，并與Fis1相結(jié)合誘發(fā)線粒體分裂。自1850年人類發(fā)現(xiàn)線粒體，對其結(jié)構(gòu)和認(rèn)識不斷進(jìn)展，現(xiàn)今我們對線粒體的定義已不是靜止而是不斷融合-分裂的動態(tài)網(wǎng)狀系統(tǒng)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能夠維持線粒體膜電位，對心肌纖維具有重要的影響作用[15]?，F(xiàn)代研究顯示，線粒體參與線粒體生物再生、細(xì)胞氧化代謝、細(xì)胞壞死以及凋亡等多種細(xì)胞的生理過程，其中Drp1是加速細(xì)胞分裂的主要蛋白，分布于細(xì)胞漿內(nèi)，是街道線粒體分裂的主要分子，其表達(dá)水平較高能夠誘發(fā)線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受損。曾有研究顯示，線粒體動力相關(guān)蛋白Drpl水平升高，線粒體的分裂加速，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受損從而抑制線粒體動力相關(guān)蛋白，加速線粒體融合以及延長網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，加速線粒體損傷的修復(fù)。細(xì)胞色素c (cyt-c)是一種重要的水溶性氧化還原血紅蛋白，是電子呼吸鏈重要的成員，分布于原核生物以及真核生物細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜內(nèi)，是參與氧化還原反應(yīng)電子傳遞中的重要物質(zhì)。近年來曾有研究人員對cyt-c進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，以cyt-c為代表的氧化還原蛋白質(zhì)和酶的直接電化學(xué)不僅與機(jī)體內(nèi)在的熱力學(xué)以及動力學(xué)性質(zhì)具有緊密聯(lián)系，還能夠加速電極物質(zhì)和具有高催化、傳感性的生物大分子結(jié)合作用，是機(jī)體物質(zhì)代謝及能量轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們研究顯示，治療后，與正常對照組相比，模型對照組及補(bǔ)陽還五湯組Drp1、Fis1及cyt-c表達(dá)水平，神經(jīng)功能評分，海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率，Ca2+濃度及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性較高；與模型對照組相比，補(bǔ)陽還五湯組Drp1、Fis1及cyt-c表達(dá)水平，神經(jīng)功能評分，海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率，Ca2+濃度及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性較低。提示補(bǔ)陽還五湯通過抑制Drp1、Fis1及cyt-c表達(dá)發(fā)揮了對腦缺血再灌注大鼠的腦保護(hù)作用，降低海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率，可能是補(bǔ)陽還五湯防止缺血性腦血管疾病的主要機(jī)制之一。

綜上所述：補(bǔ)陽還五湯可在一定程度上下調(diào)缺血再灌注腦損傷大鼠Drp1、Fis1、cyt-c的表達(dá)水平以及海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，抑制線粒體分裂減輕大鼠海馬神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷，緩解腦缺血進(jìn)一步損傷，有望為臨床治療方面提供新的干預(yù)方法。

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*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371448)

△通訊作者

腦缺血/中西醫(yī)結(jié)合療法 補(bǔ)陽還五湯 再灌注損傷 線粒體分裂蛋白1 線粒體分裂基因動態(tài)相關(guān)蛋白 細(xì)胞色素C 動物，實(shí)驗(yàn)

R743.31

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.10.080

(收稿：2017-04-28)