吳苗敏,蘆艷麗, 韓 璐

新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院(烏魯木齊830000)

·臨床報(bào)道·

新疆地區(qū)維漢民族多囊卵巢綜合征患者中醫(yī)證型分析及與CYP17候選基因多態(tài)性的相關(guān)性分析*

吳苗敏,蘆艷麗, 韓 璐Δ

新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院(烏魯木齊830000)

目的：探討新疆地區(qū)維漢民族多囊卵巢綜合征患者中醫(yī)證型分析及與CYP17基因多態(tài)性的相關(guān)性。方法：選擇多囊卵巢綜合征的患者360例，其中漢族260例，維吾爾族100例；記錄多囊卵巢綜合征患者與100例維族多囊卵巢綜合征患者的中醫(yī)證型分布狀況并進(jìn)行分析；對(duì)兩組患者CYP17、LH、IRS、HLA基因多態(tài)性進(jìn)行檢測并對(duì)比檢測結(jié)果。結(jié)果：維、漢民族中醫(yī)證型占比不同，漢族以脾虛痰濕所致痰濕凝滯多見，維吾爾族以腎虛肝郁所致肝郁化火多見。CYP17是多囊卵巢綜合征的易感基因之一；新疆地區(qū)維漢兩族的CYP17基因多態(tài)性無顯著差異。結(jié)論:新疆維漢兩族多囊卵巢綜合征患者應(yīng)根據(jù)不同的中醫(yī)證型辨證施治； CYP17對(duì)于多囊卵巢綜合征的診治有著重要的意義。

多囊卵巢綜合征會(huì)造成患者內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，嚴(yán)重威脅患者身心健康[1]。多囊卵巢綜合征屬于多基因相關(guān)的遺傳性疾病，因受到環(huán)境因素和多個(gè)致病基因共同的影響所致，但目前多囊卵巢綜合征確切的遺傳方式及其分子機(jī)制尚不明確[2]。Bachanek等對(duì)漢族多囊卵巢綜合征女性患者的研究結(jié)果顯示基因THADA、DENND1A和LHCGR均具有和多囊卵巢綜合征相關(guān)的SNP位點(diǎn)[3]。Ha等通過研究確定了LHCGR基因SNPrs13405728在我國寧夏回族女性多囊卵巢綜合征的作用[4]。本次研究主要研究了新疆地區(qū)維漢民族多囊卵巢綜合征患者的中醫(yī)證型及與CYP17基因多態(tài)性的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 納入研究2014年1月至2015年12月之間確診為多囊卵巢綜合征的患者360例，其中漢族260例，維吾爾族100例。所有納入研究的患者年齡均在26～35歲之間，平均年齡(30.31±5.11)歲，所有患者近3個(gè)月內(nèi)均未接受激素治療，均排除其他內(nèi)分泌疾病。

診斷標(biāo)準(zhǔn):多囊卵巢綜合征中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參考我國國家中醫(yī)臨床研究基地單病種多囊卵巢綜合征診療方案和臨床路徑診斷標(biāo)準(zhǔn)分型[5]。中醫(yī)證型根據(jù)中醫(yī)證候分級(jí)量化表進(jìn)行分型：脾虛痰濕者表現(xiàn)為面色晦暗、性欲淡漠、肢倦神疲、小便清長、大便溏薄、腰膝酸軟、舌淡苔白、脈沉細(xì)或沉遲，月經(jīng)停閉數(shù)月，婚久不孕等。腎虛肝郁者表現(xiàn)為心煩失眠、咽干口燥、行經(jīng)前胸脅不舒、乳房脹痛、精神抑郁、少腹脹痛、煩躁易怒、大便秘結(jié)、皮膚多毛與痤瘡、舌質(zhì)暗紅、舌苔薄白舌質(zhì)暗紅、脈弦，月經(jīng)期不固定且量多少不定，月經(jīng)色暗，久婚不孕[6]。

2 研究方法

2.1 兩組患者中醫(yī)證型對(duì)比：按照中醫(yī)辨證法記錄兩組患者不同的中醫(yī)證型的分布，并研究分析兩組的差異。

2.2 兩組患者CYP17基因多態(tài)性檢測：在月經(jīng)的第3天至第5天或者閉經(jīng)患者的任意時(shí)期抽取外周靜脈血，分離出血清后應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)患者的血清T進(jìn)行測定。PCR擴(kuò)增：將300微升全血抗凝處理后用于提取基因組DNA，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明。引物及GenBank序列合成如下所示，P1:5’-CATTCCCA CTCTG-GAGTC-3’,P2： 5’-AGGCTCTTGGGGTA CTTG-3’。擴(kuò)增CYP17基因包含有多態(tài)位點(diǎn)-34bp的一小段DNA,DNA片段大小為419bp。該反應(yīng)總體系為20微升，體系內(nèi)包含有引物、模板DNA、氯化鎂、4種脫氧核糖三磷酸和Taq DNA聚合酶。CYP17基因擴(kuò)增條件為5 min 94℃預(yù)變性、95℃ 1 min、61.7℃ 1 min、72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 1 min、延伸10 min。CYP17基因多態(tài)性檢測：將含有緩沖液、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、內(nèi)切酶MspA1I、乙酰基內(nèi)切酶MspA1I超純水的20微升MspA1I酶切總體系混合均勻后放置于37℃的恒溫水環(huán)境下消化4h。將酶切產(chǎn)物放置于含有溴化乙錠的20 g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，電流為70微安，電壓為100V，應(yīng)用紫外線透射儀進(jìn)行觀察并攝像保存?；蝾l率=該基因型頻數(shù)/總患者例數(shù)；等位基因頻率=每種等位基因出現(xiàn)的頻數(shù)/總等位基因數(shù)。

結(jié) 果

1 兩組多囊卵巢綜合征患者中醫(yī)證型分布狀況比較 本次調(diào)查結(jié)果顯示漢族和維吾爾族多囊卵巢綜合征患者中痰瘀互結(jié)證、腎虛血瘀證患者的例數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.414，P>0.05；χ2=2.162，P>0.05)；漢族多囊卵巢綜合征患者以脾虛痰濕所致痰濕凝滯多見(χ2=16.562，P<0.05)，維吾爾族多囊卵巢綜合征患者以腎虛肝郁所致肝郁化火多見(χ2=49.540，P<0.05),見表1。

表1 兩組多囊卵巢綜合征患者中醫(yī)證型分布狀況 (例)

2 兩組患者CYP17基因多態(tài)性比較 兩組患者CYP17基因頻率和等位基因頻率經(jīng)比較統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(χ2=0.003，P>0.05)。兩組多囊卵巢綜合征患者的CYP17 A2A2型的基因型間睪酮T水平均顯著高于A1A2型和A1A1型(P<0.05)；但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.050，P>0.05),見表2，表3。

表2 兩組患者CYP17基因頻率和等位基因頻率對(duì)比 (例)

注：組內(nèi)比較*P<0.05；組間比較P>0.05

表3 兩組CYP17 A2A2型的基因型間睪酮T水平對(duì)比 (μg/L)

注： 組間比較P>0.05

討 論

多囊卵巢綜合征是較為常見的婦科疾病，育齡婦女的患病率大約為5%～10%[7]。根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院的標(biāo)準(zhǔn)，多囊卵巢綜合征的發(fā)病率在6%～10%之間，根據(jù)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)則高達(dá)15%[8]。活質(zhì)量和身心健康。本論文主要探討分析了新疆地區(qū)維漢民族多囊卵巢綜合征患者中醫(yī)證型分析及與CYP17基因多態(tài)性的相關(guān)性。

1 新疆地區(qū)維漢民族多囊卵巢綜合征患者中醫(yī)證型分析 多囊卵巢綜合征的中醫(yī)辨證分型通常較為復(fù)雜，作為中醫(yī)學(xué)核心的內(nèi)容，辨證論治中的“證”的理論對(duì)于疾病的診斷和治療有著重要的意義[9]。中醫(yī)辨證論治認(rèn)為多囊卵巢綜合征的病機(jī)主要以肝、脾、腎功能失常為本，以痰濕阻滯、氣滯血瘀為標(biāo)[10]。脾虛則會(huì)造成痰濕內(nèi)生，阻滯氣機(jī)，導(dǎo)致多囊卵巢綜合征的發(fā)生；肝郁則氣郁血滯，血行受阻也會(huì)導(dǎo)致多囊卵巢綜合征的發(fā)生[11]。韓延華等在多囊卵巢綜合征的病位證候要素分布研究中發(fā)現(xiàn)腎發(fā)病的幾率最高，其次為肝，然后為脾，證明了多囊卵巢綜合征的病變臟腑主要為肝、脾、腎；在病性證候要素分布研究中，發(fā)病幾率最高的為氣虛，其次為痰濕，再次為血瘀，證明多囊卵巢綜合征的常見發(fā)病因素為氣虛、痰濕、血瘀[12]。多囊卵巢綜合征和肝郁導(dǎo)致的氣郁血滯以及痰濕導(dǎo)致的經(jīng)脈阻滯均有著一定的相關(guān)性。本次研究結(jié)果顯示維、漢民族中醫(yī)證型占比不同，漢族以脾虛痰濕所致痰濕凝滯多見，維吾爾族以腎虛肝郁所致肝郁化火多見。林琳等在研究中指出新疆漢族與維族的飲食習(xí)慣和多囊卵巢綜合征的發(fā)生有著一定的關(guān)聯(lián)性[13]。因此，對(duì)于多囊卵巢綜合征的治療除了考慮藥物之外，還需要對(duì)患者給于科學(xué)、合理的飲食指導(dǎo)。

2 新疆地區(qū)維漢民族多囊卵巢綜合征與CYP17等基因多態(tài)性的相關(guān)性 CYP17包括8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，位于人染色體的10q24.3區(qū)域，目前CYP17基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)主要有三個(gè)：CT突變位點(diǎn)(位于內(nèi)含子的5471堿基上)、CA(位于其編碼區(qū)5’上游的47堿基上)、T C(位于其編碼區(qū)5’的34堿基上)。T C多態(tài)位點(diǎn)也叫做rs743572位點(diǎn)，該多態(tài)性位點(diǎn)的存在會(huì)導(dǎo)致CYP17編碼區(qū)5’出現(xiàn)CCAACC啟動(dòng)子位點(diǎn)，該啟動(dòng)子位點(diǎn)的出現(xiàn)會(huì)改變CYP17基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響雌激素的水平，A2A2型基因或和多囊卵巢征雄性激素增高有關(guān)，且CYP17基因一直以來就被作為多囊卵巢綜合征發(fā)病相關(guān)的候選基因。本結(jié)果顯示100例維族多囊卵巢綜合征患者A1型為10%，A1A2基因型為56%，A2A2基因型為34%；260例漢族多囊卵巢綜合征患者A1A1基因型為10%，A1A2基因型為57.31%，A2A2基因型為32.70%；兩族各種基因型頻數(shù)分布沒有顯著差異。兩族多囊卵巢綜合征患者的A2A2基因型的血清T水平均顯著高于A1A1基因組和A1A2基因組，其原因或是因?yàn)镃YP17基因-34bp所處的TC堿基置換導(dǎo)致了該基因的表達(dá)出現(xiàn)異常，造成多囊卵巢綜合征高雄性激素血癥的形成，且含A2等位基因可能對(duì)CYP17基因翻譯有著一定的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)影響多囊卵巢綜合征患者體內(nèi)雄性激素水平(升高)，其機(jī)制是應(yīng)為CYP17基因5’端調(diào)節(jié)區(qū)含有4個(gè)CCACC Spl識(shí)別位點(diǎn)，由于調(diào)節(jié)區(qū)轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別組間數(shù)目和該基因啟動(dòng)子區(qū)域活性有一定的關(guān)聯(lián)性，而-34bp的處T C堿基置換導(dǎo)致新的splt識(shí)別組件(CCACT CCACC)的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致該區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性的升高，同時(shí)提升P450c17a酶的活性，促進(jìn)雄性激素合成的增多。本次研究結(jié)果顯示：兩組患者CYP17基因頻率和等位基因頻率經(jīng)比較無顯著差異；兩組多囊卵巢綜合征患者的CYP17 A2A2型型的T水平均顯著高于A1A2型和A1A1型，進(jìn)一步驗(yàn)證了以上機(jī)制。雖然本次研究結(jié)果顯示新疆地區(qū)維漢兩族的CYP17基因多態(tài)性無顯著差異，但由于多囊卵巢綜合征臨床表現(xiàn)通常存在多樣性，難以用某一種基因異常解釋其復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，另外研究結(jié)果是否受限于樣本量的選取，仍然有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，新疆維漢兩族多囊卵巢綜合征患者應(yīng)根據(jù)不同的中醫(yī)證型辨證施治； CYP17對(duì)于多囊卵巢綜合征的診治有著重要的意義，兩者皆有重要的研究價(jià)值。

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AnalysisofthecorrelationofTCMsyndromeandthecorrelationofCYP17genepolymorphismbetweenUighurethnicandtheHannationalityPCOSpatientsinXinjiangarea

Wu Miaomin,Lu Yanli,Han Lu .

Xinjiang Uygur Autonomous Region Traditional Chinese Medicine Institut (Urumqi 830000)

Objective:To analyze the correlation of TCM Syndrome and the correlation of CYP17 Gene polymorphism between Uighur ethnic PCOS patients and the Han nationality PCOS patients in Xinjiang area. Methods: 360 cases PCOS patients included 260 Han nationality and 100 Uygur nationality were chosen , the TCM syndrome type distribution were written and analyzed；To detect and compare the CYP17 Gene polymorphism of the patients in these two group . Results: There was difference of TCM Syndrome between the PCOS patients of Uygur ethnic group and Han nationality group, spleen deficiency caused by phlegm dampness phlegm dampness stagnation always happened in Han nationality group and pathogenic fire derived from stagnation of liver-QI caused by kidney deficiency and liver depression always happened in Uygur ethnic group. Conclusion:The PCOS patients of Uygur ethnic group and Han nationality group should be treated with different treatment of TCM Syndrome;There is important significant of CYP17 in the diagnosis and treatment of PCOS patients .

Stein-Leventhal syndrome TCM syndrome type CYP17 Gene polymorphism Correlation

*新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014211C097)

Δ通訊作者

多囊卵巢綜合征 中醫(yī)證型 CYP17 基因多態(tài)性 相關(guān)性

R711.75

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.10.001

(收稿：2017-03-10)