崔 宏， 楊楠木， 賀 濤， 萬百順， 韓 風(fēng)

河南省腫瘤醫(yī)院 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰腺外科，河南 鄭州 450052

miR-101-3p靶向調(diào)控SOX9影響肝癌細(xì)胞增殖凋亡的研究

崔 宏， 楊楠木， 賀 濤， 萬百順， 韓 風(fēng)

河南省腫瘤醫(yī)院 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰腺外科，河南 鄭州 450052

目的探討miR-101-3p對肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及其對靶基因性別決定區(qū)Y框蛋白9(sex determining region Y-box 9, SOX9)的調(diào)控作用。方法肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-101-3p模擬物(miR-101-3p mimics組)、模擬物陰性對照(mimics control組)、SOX9小干擾RNA(SOX9 siRNA組)、siRNA對照(siRNA control組)，同時以只加入轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞為對照組，RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-101-3p水平，噻唑藍(lán)(MTT)檢測細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，Western blotting檢測細(xì)胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、SOX9表達(dá)，靶基因預(yù)測庫預(yù)測miR-101-3p靶基因，熒光素酶報告基因鑒定靶基因。結(jié)果miR-101-3p mimics能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞中miR-101-3p表達(dá)，SOX9 siRNA能夠抑制肝癌細(xì)胞中SOX9的表達(dá)。miR-101-3p mimics組細(xì)胞凋亡率高達(dá)(35.69±5.27)%，細(xì)胞存活率只有(76.34±4.63)%，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3表達(dá)增多。靶基因預(yù)測庫和雙熒光素酶報告基因預(yù)測并鑒定miR-101-3p的靶基因是SOX9。miR-101-3p mimics能夠抑制SOX9 mRNA和蛋白表達(dá)。SOX9 siRNA組細(xì)胞中SOX9蛋白表達(dá)下降，Cleaved Caspase-3蛋白水平升高，細(xì)胞凋亡率高達(dá)(29.58±2.58)%，而細(xì)胞存活率只有(69.47±5.26)%。結(jié)論miR-101-3p能夠負(fù)調(diào)控靶基因SOX9，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞增殖。

肝癌；凋亡；增殖；miR-101-3p；性別決定區(qū)Y框蛋白9

肝癌的發(fā)病率在全部惡性腫瘤中位居第二位[1]，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。miRNA是一種非編碼的小分子RNA，能夠通過堿基互補的方式調(diào)控靶基的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程[2-4]。miRNA與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。miR-145、miR-22、miR-375等能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，抑制癌細(xì)胞的增殖，在癌癥組織中表達(dá)下調(diào)[5-7]。近年來研究[8]表明，miR-101-3p在肺癌、肝癌等癌組織中均表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-101-3p能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖。本研究旨在明確miR-101-3p對肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及其對靶基因的調(diào)控作用，以肝癌細(xì)胞為研究對象，通過細(xì)胞實驗在體外探討miR-101-3p的作用，以期為治療肝癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料肝癌細(xì)胞HepG2購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院；RNA提取試劑盒購自美國Sigma；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白濃度檢測試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自上海貝博生物；性別決定區(qū)Y框蛋白9(sex determining region Y-box 9, SOX9)單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Cleaved Caspase-3)單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單克隆抗體均購自美國Abcam；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)、噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)、碘化丙啶(propidium iodide, PI)、膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)均購自碧云天公司；NanoDropTMOne紫外分光光度計、MultiskanTMGO酶標(biāo)儀、AttuneNxT流式細(xì)胞儀均購自美國Thermo公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)參照參考文獻(xiàn)[9]，從液氮罐中取出肝癌細(xì)胞后，放在37 ℃水浴中使細(xì)胞在1 min內(nèi)融化后，加入5 ml含有100 g/L胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻后，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放在37 ℃，飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞融合度達(dá)90%時，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入2.5 g/L的胰蛋白酶在37 ℃消化細(xì)胞2 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，800 r/min(r=8 cm)離心5 min后，棄上清，用3 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，按照1∶2的比例接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前1 h將細(xì)胞培養(yǎng)液換成不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-101-3p模擬物(miR-101-3p mimics)、模擬物陰性對照(mimics control)、SOX9小干擾RNA(SOX9 siRNA)、siRNA對照(siRNA control)轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中，依次命名為miR-101-3p mimics組、mimics control組、SOX9 siRNA組、siRNA control組。同時設(shè)置只加入轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞為對照組，轉(zhuǎn)染48 h后，用于后續(xù)實驗研究。

1.4RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-101-3p表達(dá)水平取對照組、miR-101-3p mimics組、mimics control組的細(xì)胞，按照細(xì)胞RNA提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞中的RNA，保存于-80 ℃。用紫外分光光度計檢測提取的RNA樣品濃度，按照RT-PCR試劑盒說明書檢測miR-101-3p表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法對miR-101-3p進(jìn)行定量分析。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性12 s，62 ℃退火延伸40 s，共計40個循環(huán)。miR-101-3p上游引物為5′-ACGGGCGAGCTCAGTACTGTG-3′，下游引物為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGCTA-3′。GAPDH上游引物為5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物為5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

1.5MTT檢測細(xì)胞增殖取轉(zhuǎn)染后48 h的對照組、miR-101-3p mimics組、mimics control組細(xì)胞，接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔中加入4 000個細(xì)胞，每組設(shè)置6個復(fù)孔，同時設(shè)置空白組，空白組中不加入細(xì)胞只加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，每孔中加入20 μl的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，棄上清，每孔中加入150 μl的DMSO溶液，孵育20 min，觀察結(jié)晶物完全溶解后，酶標(biāo)儀檢測492 nm的吸光度，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(轉(zhuǎn)染組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)×100%。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取轉(zhuǎn)染后48 h的對照組、miR-101-3p mimics組、mimics control組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，收集僅1×106個細(xì)胞，用冰預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入400 μl的結(jié)合緩沖液混合后，加入PI和膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)各5 μl，在避光條件下孵育反應(yīng)20 min后，加入200 μl的結(jié)合緩沖液混合后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7Westernblotting檢測細(xì)胞中CleavedCaspase-3表達(dá)水平取轉(zhuǎn)染后48 h的對照組、miR-101-3p mimics組、mimics control組細(xì)胞，收集細(xì)胞，按照細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中蛋白，BCA定量檢測試劑盒檢測蛋白樣品的濃度。將蛋白樣品與5×的Loading buffer以1∶4的比例混合后煮沸5 min，加入到聚丙烯酰氨凝膠電泳上樣孔中，每孔加入40 μl的變性蛋白樣品。80 V電壓電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠時，將電壓調(diào)整到120 V直至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠，90 V電壓在4 ℃轉(zhuǎn)膜90 min，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。50 g/L脫脂奶粉在37 ℃孵育90 min，在4 ℃與1∶800稀釋的一抗反應(yīng)過夜后，在37 ℃與1∶1 000稀釋的二抗反應(yīng)90 min后，滴加顯色液，以GAPDH為內(nèi)參，分析目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.8靶基因預(yù)測根據(jù)靶基因預(yù)測軟件The miRBase、TargetScan、PicTar預(yù)測結(jié)果顯示，miR-101-3p的靶基因可能為SOX9，對miR-101-3p和SOX9堿基互補區(qū)進(jìn)行突變，構(gòu)建熒光素酶報告載體，將突變后的SOX9命名為突變型(wt)，把沒有突變的SOX9命名為野生型(mut)，將這兩種載體與miR-101-3p mimics、mimics control共同轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.9SOX9對細(xì)胞增殖凋亡影響取對照組、SOX9 siRNA組、siRNA control組轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，MTT檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，Western blotting檢測細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、SOX9表達(dá)水平，步驟參照材料與方法1.5、1.6、1.7正文。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-101-3p表達(dá)水平對照組、mimics control組、miR-101-3p mimics組細(xì)胞中miR-101-3p的表達(dá)水平依次為：1.00±0.08、0.99±0.09、2.25±0.21(見圖1)。miR-101-3p mimics組細(xì)胞中miR-101-3p水平升高，說明miR-101-3p mimics能夠成功過表達(dá)miR-101-3p。

2.2miR-101-3p對細(xì)胞增殖凋亡影響miR-101-3p mimics組細(xì)胞凋亡率高達(dá)(35.69±5.27)%，而對照組凋亡率僅有(8.96±1.03)%，而miR-101-3p mimics組細(xì)胞存活率降低至(76.34±4.63)%。miR-101-3p mimics組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平也明顯升高。提示miR-101-3p mimics能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡(見圖2、表1)。

注：1：對照組；2：mimics control組；3：miR-101-3p mimics組；與1相比，aP<0.01。

注：1：對照組；2：mimics control組；3：miR-101-3p mimics組。

表1 細(xì)胞存活率、凋亡率及Cleaved Caspase-3相對表達(dá)水平

注：與對照組相比，aP<0.01。

2.3靶基因預(yù)測結(jié)果從圖3A中可以看出，miR-101-3p靶基因可能為SOX9，熒光素酶鑒定結(jié)果見圖3B，miR-101-3p mimics和wt共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性降低，提示miR-101-3p的靶基因是SOX9。

2.4miR-101-3p對細(xì)胞中SOX9表達(dá)影響miR-101-3p mimics組細(xì)胞中SOX9 mRNA和蛋白水平的表達(dá)均受到抑制作用(見圖4)。說明促進(jìn)miR-101-3p表達(dá)能夠抑制SOX9基因水平和蛋白水平的表達(dá)，miR-101-3p負(fù)調(diào)控靶基因SOX9的表達(dá)。

2.5SOX9對細(xì)胞增殖凋亡影響檢測干擾SOX9對肝癌細(xì)胞增殖凋亡影響，如圖5所示，SOX9 siRNA組細(xì)胞凋亡率達(dá)(29.58±2.58)%，而細(xì)胞存活率只有(69.47±5.26)%，并且SOX9 siRNA能夠促進(jìn)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3的表達(dá)(見表2)。提示干擾SOX9表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

注：與wt相比，bP<0.01。

3 討論

miRNA是一種廣泛存在于生命體內(nèi)的非編碼RNA，參與生命體胚胎發(fā)育、組織器官形成、心血管系統(tǒng)維持、免疫功能調(diào)節(jié)等過程[10]。miRNA與動脈粥樣硬化、腦血管疾病、癌癥等疾病的發(fā)生也有密切關(guān)系。朱利楠[11]研究結(jié)果表明，miR-27a在食管鱗癌表達(dá)下調(diào)，能夠通過作用于靶基因KRAS而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，作用機制與抑癌基因相似。Li等[12]在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)，miR-7和miR-218表達(dá)下調(diào)，能夠通過負(fù)調(diào)控HoxB3基因的表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的生長。雒喜忠等[13]在肝癌中發(fā)現(xiàn)，miR-15b-5p、miR-21-5p、miR-338-5p表達(dá)水平升高，是潛在的腫瘤標(biāo)志物。之前的研究[14]表明，miR-101-3p在肺癌、肝癌中表達(dá)下調(diào)。本研究中首先細(xì)胞轉(zhuǎn)染了miR-101-3p模擬物，并通過RT-PCR檢測證實miR-101-3p模擬物能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞中miR-101-3p的表達(dá)。MTT法檢測了細(xì)胞的存活情況，發(fā)現(xiàn)miR-101-3p模擬物能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-101-3p模擬物能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。

注：1：對照組；2：mimics control組；3：miR-101-3p mimics組；與對照組相比，aP<0.01。

注：1：對照組；2：siRNA control組；3：SOX9 siRNA組。

表2 細(xì)胞存活率、凋亡率及Cleaved Caspase-3、SOX9相對表達(dá)水平

注：與對照組相比，aP<0.01。

Caspase是一種與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白家族，參與真核生物細(xì)胞的生長和凋亡過程。Caspase蛋白家族目前已經(jīng)確定的有11個成員，這些成員中除了Caspase-1、Caspase-4、Caspase-11不參與凋亡信號傳遞外，其他幾個成員均與細(xì)胞凋亡有關(guān)，而Caspase-3是凋亡的執(zhí)行因子，在正常狀態(tài)下以無活性的酶原狀態(tài)存在，經(jīng)過外界因素刺激后能夠活化發(fā)揮促凋亡的作用[15-19]。本研究中探討了miR-101-3p模擬物作用后的細(xì)胞中Caspase-3的活化水平，發(fā)現(xiàn)miR-101-3p模擬物能夠促進(jìn)Caspase-3的活化，提示miR-101-3p可能作用Caspase-3的活化而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。

miRNA功能的發(fā)揮與靶基因調(diào)控有關(guān)。本研究中，用3個不同的靶基因預(yù)測庫The miRBase、TargetScan、PicTar預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-101-3p的靶基因可能為SOX9，同時也通過熒光素酶報告基因鑒定了靶基因的正確性。SOX9基因是一種癌基因，在大腸癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌中均表達(dá)上調(diào)，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞生長[20]。本研究中，通過siRNA技術(shù)干擾肝癌細(xì)胞中SOX9的表達(dá)，進(jìn)一步檢測細(xì)胞存活和凋亡情況發(fā)現(xiàn)，干擾SOX9表達(dá)同樣能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，miR-101-3p能夠靶向負(fù)調(diào)控SOX9基因促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞增殖。本研究為后續(xù)在體內(nèi)進(jìn)一步探討miR-101-3p在肝癌中的作用奠定了基礎(chǔ)，為肝癌的治療提供了新思路。

致謝

本研究感謝鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究實驗室和導(dǎo)師趙國強教授的幫助和支持。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

StudyontheeffectofmiR-101-3ptargetingSOX9onproliferationandapoptosisofhepatocellularcarcinomacells

CUI Hong, YANG Nanmu, HE Tao, WAN Baishun, HAN Feng

Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, the Cancer Hospital of He’nan, the Tumor Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China

ObjectiveTo investigate the effect of miR-101-3p on proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells and the regulation of sex determining region Y-box 9 (SOX9).MethodsHepatocellular carcinoma cells were transfected with miR-101-3p mimics(miR-101-3p mimics group), mimics negative control (mimics control group), SOX9 small interfering RNA (SOX9 siRNA group) and siRNA control (siRNA control group). At the same time, the cells transfected with transfection reagent were used as control group, RT-PCR was used to detect the level of miR-101-3p in cells. MTT was used to detect the proliferation of cells, and apoptosis was detected by flow cytometry, expressions of Cleaved Caspase-3 and SOX9 in cells were detected by Western blotting. miR-101-3p target gene was predicted by target gene prediction library, luciferase reporter gene targeting gene.ResultsmiR-101-3p mimics could promote the expression of miR-101-3p in hepatocellular carcinoma cells, SOX9 siRNA could inhibit the expression of SOX9 in hepatocellular carcinoma cells. The apoptosis rate of miR-101-3p group mimics was (35.69±5.27)%, the cell survival rate was only (76.34±4.63)%, the expression of Cleaved Caspase-3 in cells was increased. Target gene prediction library and double luciferase reporter gene predicted and identified the target gene of miR-101-3p was SOX9. miR-101-3p mimics could inhibit the expression of SOX9 mRNA and protein. The expression of SOX9 protein was decreased in SOX9 siRNA group, the level of Cleaved Caspase-3 protein was elevated. The apoptosis rate was (29.58±2.58)%, the cell survival rate was (69.47±5.26)%.ConclusionmiR-101-3p can negatively regulate the target gene SOX9 and promote the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells, inhibite proliferation of hepatocellular carcinoma cells.

Hepatocellular carcinoma; Apoptosis; Proliferation; miR-101-3p; Sex determining region Y-box 9

R735.7

A

1006-5709(2017)10-1174-05

2017-03-17

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.10.027

崔宏，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：肝膽胰基礎(chǔ)和臨床。E-mail：dcm138@126.com

韓風(fēng)，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：肝膽胰基礎(chǔ)和臨床。E-mail：lqiong159@126.com