牛小平，何池義，劉少鋒，張 偉，韓 真

皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.病理科，安徽 蕪湖 241001

LC3Ⅱ及P62在小胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義

牛小平1，何池義1，劉少鋒1，張 偉2，韓 真1

皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.病理科，安徽 蕪湖 241001

目的通過檢測小胃間質(zhì)瘤和正常胃間質(zhì)組織中自噬相關(guān)基因LC3Ⅱ和P62的表達(dá)情況，探討LC3Ⅱ和P62在胃間質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法采用免疫組織化學(xué)染色法，檢測LC3Ⅱ和P62在21例小胃間質(zhì)瘤組織、16例正常胃間質(zhì)組織中的表達(dá)情況。 試驗(yàn)組：選取2013年1月-2014年5月在皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院內(nèi)鏡切除的21例小胃間質(zhì)瘤病例，中位年齡52歲。對(duì)照組：選取同期16例因“消化性潰瘍”在皖南醫(yī)學(xué)院戈磯山醫(yī)院行胃大部切除術(shù)的病例，術(shù)后病理證實(shí)胃組織正常者，中位年齡47歲。采用免疫組織化學(xué)法(非生物素二步法)分別檢測LC3Ⅱ和P62在小胃間質(zhì)瘤和正常胃間質(zhì)組織中的表達(dá)，免疫組化結(jié)果采用半定量綜合分析法。結(jié)果正常胃間質(zhì)組織和小胃間質(zhì)瘤組織中LC3Ⅱ、P62的陽性率均為100%。與正常胃間質(zhì)組織相比，小胃間質(zhì)瘤組織LC3Ⅱ表達(dá)明顯增強(qiáng)，P62表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。結(jié)論小胃間質(zhì)瘤自噬活性增加，可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

自噬；LC3Ⅱ；P62；小胃間質(zhì)瘤

細(xì)胞自噬(autophagy)是一種依賴溶酶體的降解途徑，它與細(xì)胞生長、分化及死亡有著非常重要的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，自噬活性的改變是一把雙刃劍，一方面，自噬能夠使腫瘤細(xì)胞逃避放療、化療所致的損傷，從而耐受應(yīng)激條件而獲得生存；另一方面，自噬可以減輕各種應(yīng)激條件下的正常組織細(xì)胞的損傷(如慢性炎癥、慢性細(xì)胞死亡及基因組損傷)而減少腫瘤的發(fā)生[1]。胃腸間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors，GIST)是一組獨(dú)立起源于胃腸道的間葉性腫瘤，與平滑肌腫瘤和神經(jīng)鞘瘤不同，其基本瘤細(xì)胞是一種未定的具有多潛能的梭形或上皮間葉樣細(xì)胞。GIST占胃腸道惡性腫瘤的1%～3%，多發(fā)于中老年患者，40歲以下患者少見，男女發(fā)病率無明顯差異，胃是GIST最常見發(fā)病部位(占全部GIST的50%～70%)。小胃腸間質(zhì)瘤是指瘤體≤2 cm的間質(zhì)瘤，目前將其分級(jí)定為極地危險(xiǎn)度范疇，小胃間質(zhì)瘤是間質(zhì)瘤發(fā)展的早期階段[2]。本研究將通過檢測小胃間質(zhì)瘤和正常胃間質(zhì)組織中自噬相關(guān)基因LC3Ⅱ和P62的表達(dá)情況，探討細(xì)胞自噬與胃間質(zhì)瘤的關(guān)系，將有助于闡明胃間質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等一系列問題，并為胃間質(zhì)瘤的預(yù)防、診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源收集2013年1月-2014年5月在弋磯山醫(yī)院消化科內(nèi)鏡中心采用內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection，ESD)切除的21例小胃間質(zhì)瘤病例，所有病例術(shù)前均未進(jìn)行任何化學(xué)和放射治療，術(shù)后均經(jīng)病理診斷證實(shí)，且免疫組化CD117均為陽性。

1.2主要試劑DAB顯色試劑盒(ZL1-9032)、辣根酶標(biāo)記鏈親和素(ZB-2404)、生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2010)，LC3Ⅱ(貨號(hào)PM036)及P62(PM045)均購自日本MBL公司。

1.3免疫組化分析所有標(biāo)本均用100 g/L中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋并切片，片厚4.0 μm。免疫組織化學(xué)染色采用SP法，染色步驟按說明書進(jìn)行。一抗稀釋度為1∶100，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，以已知陽性切片作為陽性對(duì)照。將胞漿為棕黃色～黃色判定為陽性，細(xì)胞核為藍(lán)色判定為陰性。在100倍光鏡下觀察免疫組化全片，選擇5個(gè)陽性物質(zhì)豐富的視野，采用Image-ProPlus Version 6.0分析軟件在200倍光鏡下測定陽性物質(zhì)的積分光密度(integrated optical density，IOD)值，分析LC3Ⅱ及P62蛋白在小胃間質(zhì)瘤組及正常對(duì)照組中的表達(dá)及意義。

2 結(jié)果

參照J(rèn)oensuu等[3]對(duì)GIST危險(xiǎn)度分級(jí)評(píng)分，21例小胃間質(zhì)瘤均為極地危險(xiǎn)度。免疫組化結(jié)果示，LC3Ⅱ及P62在小胃間質(zhì)瘤組織及正常胃間質(zhì)組織均有不同程度的表達(dá)，即表達(dá)率均為100%。且LC3Ⅱ及P62均定位于細(xì)胞質(zhì)中，而在細(xì)胞核中無表達(dá)。Image-ProPlus測定陽性物質(zhì)的IOD定量分析發(fā)現(xiàn)，與正常胃間質(zhì)組織相比，小胃間質(zhì)瘤組織中，LC3Ⅱ表達(dá)增強(qiáng)，P62表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1、圖1)，表明胃間質(zhì)瘤自噬功能增強(qiáng)。

表1 LC3Ⅱ、P62蛋白在小胃間質(zhì)瘤及正常胃間質(zhì)組織中的表達(dá)水平

注：與正常對(duì)照組LC3Ⅱ表達(dá)比較，t=13.151，*P<0.05；與正常對(duì)照組P62表達(dá)比較，t=22.248，*P<0.05。

圖1小胃間質(zhì)瘤內(nèi)鏡下表現(xiàn)及LC3Ⅱ、P62免疫組化結(jié)果A：胃體底交界小胃間質(zhì)瘤；B：小胃間質(zhì)瘤超聲內(nèi)鏡，起源于黏膜肌層；C：LC3Ⅱ蛋白在小胃間質(zhì)瘤的表達(dá)；D：LC3Ⅱ蛋白在正常胃間質(zhì)組織的表達(dá)；E：P62蛋白在小胃間質(zhì)瘤的表達(dá)；F：P62蛋白在正常胃間質(zhì)組織的表達(dá)(C～F均為SP法，200×)

Fig1EndoscopicfindingsofsmallgastricstromaltumorsandimmunohistochemicalfindingsofLC3ⅡandP62A: small stromal tumor of the fundus of stomach; B: endoscopic ultrasonography of small gastric stromal tumors originated from the muscularis mucosae; C: the expression of LC3Ⅱ protein in small gastric stromal tumors; D: the expression of LC3Ⅱ protein in normal gastric stromal tissues; E: the expression of P62 protein in small gastric stromal tumors; F: the expression of P62 protein in normal gastric stromal tissues

3 討論

自噬又稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡(type Ⅱ programed cell death)，是以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)包裹長壽命蛋白和細(xì)胞器的自噬體為特征的細(xì)胞“自我消化”的一系列生化過程。研究[4]發(fā)現(xiàn)，自噬與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有非常重要的關(guān)系，并且為腫瘤治療提供了新思路及靶點(diǎn)，已經(jīng)成為目前國際腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。自噬現(xiàn)象貫穿于真核細(xì)胞正常生長增殖的病理生理全部過程，對(duì)細(xì)胞的作用具有雙重性，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段,或者細(xì)胞周圍環(huán)境發(fā)生變化及治療干預(yù)措施的不同時(shí)期，自噬發(fā)揮著不同的作用[5]。一般認(rèn)為，在腫瘤尚未完全形成之前，尤其是在不典型增生時(shí)期，自噬抑制腫瘤的形成，此時(shí)阻礙自噬將導(dǎo)致癌前病變的發(fā)展，進(jìn)而形成早癌[6]。自噬在腫瘤進(jìn)展中的作用隨疾病病程而不斷發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，在腫瘤生長過程中,尤其是腫瘤早期階段，當(dāng)腫瘤內(nèi)還未形成足夠的血管為其擴(kuò)增提供營養(yǎng)時(shí)，腫瘤細(xì)胞可以通過自噬來克服營養(yǎng)缺乏和低氧的環(huán)境得以生存。此外，對(duì)肝癌、胃癌等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)化療、放療后，腫瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的破損細(xì)胞器、損壞的蛋白質(zhì)等有害成分，自噬可以清除化學(xué)及電離輻射時(shí)受損的大分子或細(xì)胞器(如線粒體)，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受電離輻射的作用，從而逃避凋亡存活下來，因此認(rèn)為自噬可以作為這些腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)[7-8]。

LC3是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)定位于自噬泡內(nèi)膜、參與多種信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的蛋白，后被證明為細(xì)胞自噬發(fā)生與否的一個(gè)良好的標(biāo)志物。LC3前體Pro LC3形成后，首先加工成胞漿可溶性形式的LC3Ⅰ，并暴露出其羧基末端的甘氨酸殘基，隨后與自噬泡膜表面的PE結(jié)合，被修飾成LC3Ⅱ。當(dāng)細(xì)胞自噬過程進(jìn)行到自噬泡即將形成閉合結(jié)構(gòu)時(shí)，只有膜結(jié)合形式的LC3Ⅱ定位于自噬泡膜上，且LC3Ⅱ始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上，其含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少呈正比。因此，LC3Ⅱ含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少呈正比。所以，LC3Ⅱ是研究自噬很好的標(biāo)記物[9]。同時(shí)，P62作為LC3的配體，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的一個(gè)整合性蛋白，在決定細(xì)胞凋亡和存活中起到重要的作用，同時(shí)也是一個(gè)抑制癌癥生成的重要蛋白質(zhì)。P62是否被降解也可以作為細(xì)胞自噬發(fā)生與否的一個(gè)良好標(biāo)志物[10]。國外有研究[11]表明，進(jìn)展期胃間質(zhì)瘤自噬功能增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致了間質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的耐藥。但對(duì)間質(zhì)瘤發(fā)展初期尤其是小間質(zhì)瘤自噬功能的研究，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過對(duì)ESD法切除的21例小胃間質(zhì)瘤免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，與正常胃間質(zhì)組織相比，小胃間質(zhì)瘤組織LC3Ⅱ表達(dá)明顯增強(qiáng)，P62表達(dá)減弱，表明小間質(zhì)瘤細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，能及時(shí)清除瘤細(xì)胞生長所產(chǎn)生的廢物，這可能與間質(zhì)瘤不像胃癌組織那樣容易發(fā)生壞死有關(guān)。由于小間質(zhì)瘤是間質(zhì)瘤發(fā)展的早期階段，腫瘤內(nèi)還沒有形成足夠的血管為其擴(kuò)增提供營養(yǎng)，間質(zhì)瘤細(xì)胞可以通過增強(qiáng)自噬功能來克服營養(yǎng)缺乏和低氧的環(huán)境得以生存。

GIST是一種潛在惡性的腫瘤，目前對(duì)于原發(fā)、較大的GIST，外科手術(shù)是其主要的治療方法，而對(duì)于<2 cm的GIST，尤其是小胃間質(zhì)瘤，主要采取內(nèi)鏡ESD。但對(duì)于術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或不可切除的GIST，則主要依賴于伊馬替尼的治療。但伊馬替尼價(jià)格昂貴，且易產(chǎn)生耐藥[12-13]，因而，研究間質(zhì)瘤早期階段發(fā)生、發(fā)展機(jī)理，探索新的治療方案勢在必行。本研究發(fā)現(xiàn)，小胃間質(zhì)瘤組織細(xì)胞自噬功能與正常胃間質(zhì)組織相比，明顯增強(qiáng)，如何將細(xì)胞自噬作為靶點(diǎn)，開辟新的治療方案，將是未來間質(zhì)瘤治療的研究熱點(diǎn)之一。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

ExpressionsandclinicalsignificancesofLC3ⅡandP62insmallgastricstromaltumors

NIU Xiaoping1, HE Chiyi1, LIU Shaofeng1, ZHANG Wei2, HAN Zhen1

1.Department of Gastroenterology; 2.Department of Pathology, Yijishan Hospital, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, China

ObjectiveTo detect the expressions of autophagy-related gene LC3Ⅱ and P62 in patients with small gastric stromal tumors and healthy controls, and explore the roles of LC3Ⅱ and P62 in the occurrence and development of gastric stromal tumors.MethodsImmunohistochemistry was used to detect expressions of LC3Ⅱ and P62 among 21 cases of small gastric stromal tumor tissues and 16 cases of normal gastric tissues. Experimental groups: 21 cases of small stromal tumor were resected by endoscopy in Yijishan Hospital from Jan. 2013 to May. 2014. The median age of the patients was 52 years. Control group: 16 cases of peptic ulcer patients, who underwent gastrectomy in Yijishan Hospital were selected during the same period, the cases were postoperative pathologically confirmed normal gastric tissue. The median age was 47 years old. Expressions of P62 and LC3Ⅱ were detected by immunohistochemistry method (non-biotin two-step), semi-quantitative method of comprehensive analysis was used to quantify the results of immunohistochemistry.ResultsThe expressions of LC3Ⅱand P62 were positive both in normal gastric tissues and small gastric stromal tumor tissues. The expression of LC3Ⅱ was increased and the expression of P62 was significantly decreased in small gastric stromal tumor tissues compared with normal gastric tissues (P=0.000).ConclusionAutophagic activity in small gastric stromal tumors is significantly increased, which may be associated with occurrence and development of tumors.

Autophagy; LC3Ⅱ; P62; Small gastric stromal tumor

R735.2

A

1006-5709(2017)10-1138-03

2017-03-25

牛小平，副主任醫(yī)師，博士，研究方向：消化系統(tǒng)疾病的診斷及治療。E-mail：niuxiaoping@aliyun.com

何池義，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：消化病學(xué)及消化內(nèi)鏡學(xué)。E-mail：chiyihe@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.10.018