張有新，仇朝紅，劉學(xué)良

（1.青海省互助縣人民醫(yī)院，青海 海東 810500；2.青海省藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，青海 西寧 810000；3.青海省食品藥品審評(píng)中心，青海 西寧 810007）

流感丸中烏頭堿含量測(cè)定研究

張有新1，仇朝紅2，劉學(xué)良3

（1.青海省互助縣人民醫(yī)院，青海 海東 810500；2.青海省藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，青海 西寧 810000；3.青海省食品藥品審評(píng)中心，青海 西寧 810007）

目的建立測(cè)定流感丸中烏頭堿含量測(cè)定的高效液項(xiàng)色譜（HPLC）法。方法采用Hypersil-ODS C18柱色譜柱，以乙腈-四氫呋喃為流動(dòng)相A，0.1 mol/L醋酸銨溶液為流動(dòng)相B，（A:B）比例為（15:85）為；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。理論板數(shù)按烏頭堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。結(jié)果在上述條件下，對(duì)烏頭堿測(cè)定峰沒(méi)有干擾，在0.1034 μg～1.2051 μg范圍內(nèi)與色譜峰面積之間線性關(guān)系良好。結(jié)論本方法準(zhǔn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于流感丸中烏頭堿含量的HPLC測(cè)定。

流感丸；烏頭堿；HPLC；

流感丸中草烏具有溫經(jīng)止痛和祛風(fēng)除濕的功效，常用于心腹冷痛、風(fēng)寒濕痹等疾病治療。流感丸中草烏的主要成分為烏頭堿及次烏頭堿等，這些成分既是有效成分也是毒性成分。榜嘎通常以全草入藥，烏頭則多以塊根或根入藥[1]。榜嘎性涼、味苦，是藏醫(yī)常用藥物，具清熱解毒的功效，在各種藏藥復(fù)方制劑中較為常用。

1 儀器及試藥

本研究所使用儀器為電子天平、高效液相色譜儀、紫外檢測(cè)器、超聲波清洗器乙腈、甲醇、四氫呋喃均為色譜純。烏頭堿（批號(hào)：110720-201111，含量按98.8%計(jì)）、新烏頭堿（批號(hào)：110799-201106，含量按98.5%計(jì)）、次烏頭堿（批號(hào)：110798-200805，含量按99.5%計(jì)）對(duì)照品。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)二極管陣列檢測(cè)器得到的紫外吸收光譜圖及最大吸收波長(zhǎng)顯示，新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的最大吸收波長(zhǎng)為240 nm。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)考察：

流動(dòng)相A和B分別為乙腈-四氫呋喃（25:15）和0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL），（A:B）比例為（15:85）作為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm，流速1.0 mL/分鐘，填充劑使用十八烷基硅烷鍵合硅膠。

應(yīng)用Hypersil-ODS C18柱與Sunfire C18柱（250 mm×4.6 mm），對(duì)以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀-醋酸-異丙醇（27:69:2:2）、甲醇-0.3 mol/L三乙胺（65:35）、以乙腈-四氫呋喃（25:15）為流動(dòng)相A，0.1 mol/L醋酸銨溶液為流動(dòng)相B，（A:B）比例為（15:85）為流動(dòng)相時(shí)的分離情況進(jìn)行考察，柱溫為30℃，（A:B）比例為（15:85）為流動(dòng)相，按烏頭堿峰計(jì)算理論板數(shù)應(yīng)在3000以上。

2.3 制備對(duì)照品溶液

烏頭堿對(duì)照品準(zhǔn)確稱取12.11 mg、新烏頭堿對(duì)照品8.79 mg、次烏頭堿對(duì)照品10.33 mg，將異丙醇-三氯甲烷混合溶液加入到10mL容量瓶中，稀釋后獲得每1 mL含烏頭堿1.1965 mg、新烏頭堿0.8658 mg、次烏頭堿1.0278 mg的溶液。精密量取上述三種溶液各1 mL，并在容量瓶中加入異丙醇-三氯甲烷混合溶液，待其稀釋后獲得含烏頭堿0.11965 mg/mL、新烏頭堿0.08658 mg/mL、次烏頭堿0.10278 mg/mL的溶液。再精密量取上述稀釋后溶液至10 mL容量瓶中，按1:1比例加入加異丙醇-三氯甲烷混合溶液，稀釋后得含烏頭堿11.965 μg、新烏頭堿8.658 μg、次烏頭堿10.278 μg每毫升的混合溶液。

2.4 制備供試品溶液

2.4.1 提取方法的考察

方法一（水提氯仿萃取法）取本品10 g，加水振蕩后轉(zhuǎn)移至離心管中，離心5分鐘后取上清液，用0.04%HC1將沉淀洗2次，用10%氨水將pH值調(diào)為10，用氯仿萃取3次后，將10 mL的異丙醇-二氯甲烷（1:1）混合溶液加入到殘?jiān)?，取續(xù)濾液。

方法二（異丙醇-乙酸乙酯提取法）取10 g本品粉末，稱定后將其置于具塞錐形瓶中，按1:1的比例加入異丙醇-乙酸乙酯混合液50 mL和5 mL氨試液，經(jīng)超聲處理30分鐘后冷卻，稱定重量后補(bǔ)足減失的重量，搖勻?yàn)V過(guò)后在殘?jiān)屑尤氘惐?二氯甲烷混合溶液10 mL，經(jīng)溶解濾過(guò)后取續(xù)濾液即可。

方法三（氨乙醚冷浸法）取本品粉末10 g，置于具塞錐形瓶中，加氨試液5 mL和乙醚50 mL，振蕩5分鐘，冷浸6小時(shí)，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，離心5分鐘后取乙醚液，并在殘?jiān)屑?0 mL甲醇溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

方法四（氨乙醚超聲法）取10 g粉末置于具塞錐形瓶中，精密加5 mL氨試液和50 mL乙醚，經(jīng)超聲處理半小時(shí)后轉(zhuǎn)移至離心管中，離心5分鐘后取乙醚液，加甲醇10 mL對(duì)殘?jiān)M(jìn)行溶解，濾過(guò)后取續(xù)濾液，即得。

方法五（酸提氯仿萃取法）取本品粉末約15 g，置于具塞錐形瓶中，加50 mLHC1溶液，振蕩6小時(shí)，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，離心5 min，獲取上清液后用0.04%HC1洗沉淀2次，用氨水將pH值調(diào)為10，加氯仿萃取3次，在殘?jiān)屑尤氘惐?二氯甲烷混合溶液后取續(xù)濾液。

測(cè)定上述5種提取方法所得樣品的含量，各種提取方法的提取率順序?yàn)椋悍椒ㄈ痉椒ㄋ模痉椒ǘ痉椒ㄎ澹痉椒ㄒ?。確定方法三（氨乙醚冷浸法）為最有效的提取方法。

2.4.2 提取時(shí)間的考察

取本品10g，加氨試液5 mL，加乙醚50 mL，振蕩5分鐘，冷浸4、6、8小時(shí)，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，離心5 min后取乙醚液，用乙醚洗2次沉淀后合并乙醚液，蒸干。加甲醇2mL溶解殘?jiān)瑸V過(guò)，取續(xù)濾液，即得。按照“2.2項(xiàng)”方法測(cè)定三種生物堿總含量。6、8小時(shí)所測(cè)得的三種生物堿總含量接近，以6小時(shí)為提取時(shí)間。

2.5 制備陰性對(duì)照溶液

取除榜嘎、草烏外的其余藥味，制成不含榜嘎、草烏的制劑，制備陰性對(duì)照溶液。測(cè)定發(fā)現(xiàn)供試品溶液在對(duì)照品溶液出峰位置上無(wú)峰出現(xiàn)，說(shuō)明對(duì)其無(wú)干擾。

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果

本研究中，3批樣品的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3批樣品含測(cè)結(jié)果（n，%）

3 討 論

稀鹽酸和氨乙醚提取法是提取烏頭類生物堿較為有效的方法，烏頭類生物堿難溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶劑，在服用烏頭屬中藥時(shí)，常用水煎煮法[2]，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)以氯仿、乙醚為溶劑的提取方法進(jìn)行了對(duì)比。

烏頭類生物堿在水中無(wú)法全部被溶出，溶解度低，所以水提取氯仿萃取法與其他方法相比提取率較低[3]。氨乙醚冷浸法則具有較高的提取率，其主要原因在于堿性環(huán)境下，烏頭類生物堿能充分溶于有機(jī)溶劑并被萃取出來(lái)，其他方法的提取率均低于氨乙醚冷浸法[4]。

經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，三批流感丸中的新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿含量在3.6547 μg/g～3.9215 μg/g之間，取樣量低于5 g時(shí)，烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿三個(gè)峰低于定量限，取樣量超過(guò)15 g后樣品中雜質(zhì)干擾較大，不利于檢測(cè)，故在試驗(yàn)中取樣量定為10 g[5]。流感丸標(biāo)示重量為0.25 g，用法用量為：一次4～8丸，一日2～3次，按日最高服用劑量（一次8丸，一日3次，流感丸中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的總量以4 μg/g計(jì)）來(lái)計(jì)算，日服烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的總量為24 μg，有必要采用高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行烏頭堿限量控制。

[1] 楊秀芳,王 峰.含烏頭堿類藥物致不良反應(yīng)的特點(diǎn)及規(guī)律,中外健康文摘2013,10(21):371-372.

[2] 劉高宏,魏立莉.流感丸中烏頭堿的限量檢查及HPLC含量測(cè)定方法的建立[J].西部中醫(yī)藥,2016,29(11):24-26.

[3] 吳成鳳,李國(guó)衛(wèi),王樟根.LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定烏頭湯中烏頭堿型生物堿含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2015(6):833-837.

[4] 袁 帥,許 玉,黃 磊.烏頭屬藥材中單酯型烏頭堿的ELISA法測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2016,47(7):897-901.

[5] 魏文芝,海 平,駱桂法.超高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定藏藥薩熱十三味鵬鳥(niǎo)丸中烏頭堿類含量[J].中國(guó)藥業(yè),2016,25(18):25-29.

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ISSN.2095-8242.2017.38.7497.02

本文編輯：王雨辰