董婭 趙鈺玲 范亞莉 楊栓盈 魚軍 王娟紅 王琦俠 李建英

紅花多糖對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

董婭1，2趙鈺玲1，2范亞莉1，2楊栓盈3魚軍4王娟紅5王琦俠6李建英1

目的探討不同濃度的紅花多糖(safflower polysaccharide,SPS)對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)染色法繪制細(xì)胞生長曲線及計(jì)算細(xì)胞活力；用不同濃度(0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.28,2.56mg/mL)的紅花多糖處理A549細(xì)胞24、48、72h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測不同濃度(0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.28,2.56mg/mL)的紅花多糖對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外生長的抑制作用，AnnexinV-FITC/PI熒光雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果臺(tái)盼藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)在第2-6天細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長，在第3-5天細(xì)胞活力最好；不同濃度SPS處理24,48,72h后，各時(shí)間點(diǎn)均以0.64mg/mL的SPS抑制率最高；不同濃度SPS處理48h后，倒置顯微鏡下A549細(xì)胞表現(xiàn)為皺縮、變圓等細(xì)胞凋亡性；各濃度組A549細(xì)胞的凋亡率增加呈劑量依賴性，而1.28mg/mL組除外。結(jié)論紅花多糖能明顯抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，在SPS濃度為0.64mg/mL最為顯著。

A549細(xì)胞；紅花多糖；增殖；凋亡

紅花是活血化瘀藥的代表藥，藥理作用廣泛，《中藥藥理學(xué)》明確指出紅花具有抗腫瘤作用[1]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[2-3]，紅花還具有抗氧化、抗凝血、降血壓以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。紅花多糖(safflower polysaccharide,SPS)是從紅花中提取的有效活性成分，近年來關(guān)于多糖抗腫瘤的研究逐漸增多,多糖通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞周期等。有研究發(fā)現(xiàn)，SPS具有抗腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[4-5]、保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷[6]；明顯增強(qiáng)H22荷瘤小鼠的免疫功能，清除自由基、減輕活性氧造成的損傷[7]。前期研究證實(shí)，紅花多糖可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡及細(xì)胞周期，實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌[8-12]等惡性腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用，但其對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制尚未明確,本文旨在研究SPS對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以期為肺癌的治療尋找新的治療方法及理論基礎(chǔ)。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1 細(xì)胞株：人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株由第四軍醫(yī)大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室提供。

2 主要儀器：Multiskan Mk3酶標(biāo)儀(Thermo公司)，流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)。

3 主要試劑：臺(tái)盼藍(lán)(TRYPAN BLUE),MP Biomedical.LLC公司,批號(hào)MR29186；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT) Sigma公司，批號(hào):M2128；RPMI-1640培養(yǎng)基,Hyclone公司，批號(hào)：ABA211779；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司 批號(hào)150130)；0.25%胰蛋白酶消化液,Solabio公司，批號(hào)：20160421；二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司批號(hào)：D5879；Annexin V-FITV 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，Miltenyi Biotec GmbH,貨號(hào)：5160412036。

4 藥品：紅花多糖(上海瑞康生物 批號(hào)20160504 純度90%)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代：將人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12-24小時(shí)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 不同濃度的紅花多糖對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞形態(tài)的影響：取對(duì)數(shù)生長期的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，分別加入200 uL 0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.16 mg/mL、0.32 mg/mL、0.64 mg/mL、1.28mg/mL、2.56 mg/mL 七個(gè)濃度的紅花多糖，在24h、48h、72h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并拍照。

3 人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長曲線的測定：取對(duì)數(shù)生長期的人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，制成濃度為104個(gè)/mL 的單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h 后，任取3孔用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行活細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)，總共持續(xù)計(jì)數(shù)9d，且重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次，按照平均值繪制生長曲線。

4 人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長活力的測定：取對(duì)數(shù)生長期的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，制成濃度為104個(gè)/mL 的單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h 后，任取3孔計(jì)數(shù)，并用臺(tái)盼藍(lán)染色法單獨(dú)進(jìn)行活細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)，總共持續(xù)計(jì)數(shù)9d，且重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次，按照下面公式計(jì)算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力=(細(xì)胞總數(shù)—死細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%

5 MTT法檢測：取對(duì)數(shù)生長期的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，以5×104個(gè)/孔的濃度接種于無菌的96孔培養(yǎng)板，按照MTT法常規(guī)進(jìn)行，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處檢測各孔吸光度值(OD)。按照下面公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率(inhibition rate,IR%)：生長抑制率(IR%)=[1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/空白最照組OD值]×100%

6 SPS對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響：將對(duì)數(shù)生長期的人肺癌細(xì)胞A549用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化后，以2×105個(gè)/孔的濃度接種到無菌的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按照Annexin V-FITV 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒步驟處理標(biāo)本后放入流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測，將激發(fā)波長Ex設(shè)置為488nm，發(fā)射波長Em設(shè)置為530nm 并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、 SPS對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響 對(duì)照組A549細(xì)胞貼壁良好，呈梭形貼壁生長，不同濃度的SPS處理48h后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯變化，表現(xiàn)為細(xì)胞整體萎縮、變圓、細(xì)胞折光減弱等典型細(xì)胞凋亡性狀, 在SPS濃度 0.64mg/mL時(shí)最顯著(見圖1)

二、 A549細(xì)胞生長曲線的測定(見圖2)

三、 A549細(xì)胞細(xì)胞活力的測定(見圖3)

四、 SPS對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

SPS作用后人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長明顯受抑制，呈現(xiàn)一定程度的時(shí)間、濃度依耐性，表現(xiàn)為隨著濃度的增高，作用時(shí)間的延長，抑制率增高，各時(shí)間點(diǎn)均以0.64mg/mL的SPS抑制率最高，劑量升高至1.28mg/mL的時(shí)抑制率反而下降(見表1)。

五、各濃度SPS作用48h對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖(見圖4)左下象限為正常活細(xì)胞( AnnexinV- /PI-)；右下象限為早期凋亡細(xì)胞( AnnexinV+ /PI-)；右上象限為晚期凋亡或壞死細(xì)胞( AnnexinV+ /PI+ )；而左上象限為細(xì)胞膜破損細(xì)胞( AnnexinV-/PI+)[13]。

圖1 不同濃度的SPS作用48h對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響(倒置顯微鏡×100)

注：A:對(duì)照組SPS濃度0mg/mL；B: SPS濃度0.04mg/mL； C: SPS濃度0.08mg/mL；D:SPS濃度 0.16mg/mL；E:SPS濃度0.32mg/mL； F:SPS濃度0.64mg/mL； G：SPS濃度1.28mg/mL； H：SPS濃度2.56mg/mL

圖2 0-192h A549細(xì)胞的生長曲線圖

圖3 第1-8天A549細(xì)胞活力圖

表1 不同濃度的SPS對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

*P<0.05

SPS作用A549細(xì)胞48h后各組細(xì)胞的凋亡率增高，以0.64mg/mL凋亡率最高。(見圖4)。

討 論

肺癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見惡性腫瘤之一，近年來，其病死率和發(fā)病率呈逐年遞增趨勢,非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是一種上皮組織來源的惡性腫瘤，占肺癌的80%，5年生存率不到15%[14], 傳統(tǒng)的治療方法如手術(shù)、放療及化療等不良反應(yīng)大，療效欠佳，這與NSCLC的發(fā)病機(jī)制不明、缺乏有效的治療手段密切相關(guān)，因此,研究其發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，并從中尋找有效的治療手段已成為NSCLC研究領(lǐng)域迫切需要解決的問題。目前，越來越多的中草藥及其提取物應(yīng)用于NSCLC的治療，多種中草藥對(duì)病灶穩(wěn)定性、生存期和生活質(zhì)量有顯著改善，并有抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移潛在優(yōu)勢。有研究發(fā)現(xiàn)，SPS可抑制肺癌細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖能力，在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用[15]，它的抗腫瘤作用機(jī)制可能與增強(qiáng)CTL、NK細(xì)胞的毒活性有關(guān)[4]。但SPS作用于NSCLC細(xì)胞的靶途徑、靶位點(diǎn)、靶分子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等仍不明確，因此需要進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

圖4 SPS作用A549細(xì)胞48h的凋亡率

注： A:對(duì)照組SPS濃度0mg/mL B: SPS濃度0.08mg/mL C :SPS濃度0.16mg/mL; D: SPS濃度 0.32mg/mL； E:SPS濃度0.64mg/mL；F:SPS濃度1.28mg/mL

本實(shí)驗(yàn)主要觀察不同濃度SPS對(duì)人NSCLC A549細(xì)胞增殖與凋亡的影響，初步探討SPS對(duì)人NSCLC細(xì)胞的抑制機(jī)制，為防治提供可能的治療策略。

本研究首先從形態(tài)學(xué)上觀察SPS可能誘導(dǎo)人NSCLC A549細(xì)胞凋亡，在倒置顯微鏡下觀察不同濃度的SPS作用后A549細(xì)胞貼壁細(xì)胞減少，細(xì)胞間隙增大，且部分細(xì)胞變圓，體積縮小，部分細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，在0.64mg/mL SPS作用48h后最為顯著；再通過臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞的生長曲線及計(jì)算細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)在第2-6天細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長，在第3-5天細(xì)胞活力最好；在MTT抑制試驗(yàn)中，不同濃度SPS作用后人NSCLC A549細(xì)胞生長明顯受抑制，呈現(xiàn)一定程度的時(shí)間、濃度依耐性，表現(xiàn)為隨著濃度的增高，作用時(shí)間的延長，抑制率增高，各時(shí)間點(diǎn)均以0.64mg/mL的SPS抑制率最高；最后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)SPS作用A549細(xì)胞48h后各組細(xì)胞的凋亡率增高，以0.64mg/mL凋亡率最高。

綜上所述，SPS能明顯抑制人NSCLC A549細(xì)胞的增殖，并可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，在SPS濃度為0.64mg/mL最為顯著，但SPS對(duì)人NSCLC細(xì)胞的更深層次作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，為臨床應(yīng)用提供可靠的論據(jù)。

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Effectofsafflowerpolysaccharideonproliferationandapoptosisinhumannon-smallcelllungcancercelllineA549

DONGYa,ZHAOYu-ling,FANYa-li,YANGShuan-ying,YUJun,WANGJuan-hong,WANGQi-xia,LIJian-ying

DepartmentofRespiratoryDisease,Xi’anCentralHospitalAffiliatedtoMedicalcollegeofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an,Shaanxi710003,China

ObjectiveTo investigate the potential anti-apoptotic effect of safflower polysaccharide on A549 cells of human non-small cell lung cancer.MethodsTrypan blue staining was used to count the alive cells in order to draw a cellular growth curve and calculate cell viability. A549 cells were treated with different concentrations (0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28 and 2.56 mg/mL) of SPS for 24, 48 and 72 hours. Inverted Micro-scope was used to observe the morphological changes of A549 cells. Different doses of safflower polysaccharide (0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28 and 2.56 mg/mL) were added to A549 cells. The MTT assay was performed to reveal the inhibitory effect on cell proliferation. Flow cytometry using annexin V-FITC/PI staining was employed to measure cell apoptosis.ResultsThe Trypan blue staining showed the 2nd to 6th days was logarithmic growth phase and cell viability was the best from the 3rd to 5th days. After being treated by SPS for 24, 48 and 72 hours, the highest inhibition rate was 0.64mg/mL. After being treated by SPS for 48h, evident morphological changes including membrane shrinking, rounding shaping and budding to form apoptotic characters were observed. SPS treatment inhibited the proliferation in a dose-dependent manner and the rate of cell apoptosis was increased also in a dose-dependent manner except 1.28mg/mL.ConclusionSPS could inhibit the proliferation of A549 and enhance apoptosis of A549 especially in 0.64mg/mL.

A549 cells; safflower polysaccharide; proliferation; apoptosis

2017-03-20]

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.11.030

陜西省自然科學(xué)基金(No 2012JC2-06) 陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(No 2014k11-01-02-15)

710003 陜西 西安,西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬西安市中心醫(yī)院 1.呼吸內(nèi)科、4.普外科、5.病理科、6.血液病研究所 2. 716000 陜西 延安,延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院 3. 710003 陜西 西安,西安交通大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科