翁曉芹 杜強 馮旰珠 黃茂

丹皮酚抑制PM2.5誘導的人支氣管上皮細胞VEGF表達的研究

翁曉芹1杜強2馮旰珠2黃茂1

目的觀察丹皮酚對細顆粒物(particulate matter 2.5, PM2.5)誘導的人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)表達血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelia growth factor, VEGF)的影響。方法選取不同濃度PM2.5 (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL)刺激BEAS-2B細胞，分別收集刺激6 h、12 h、24 h 后的細胞培養(yǎng)上清液和刺激24 h后的細胞，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和Western Blot方法檢測上清液中及細胞內(nèi)VEGF的表達水平；利用不同濃度丹皮酚(15μmol/L, 30μmol/L)進行干預(yù)24 h，收集細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA方法檢測上清液中VEGF的表達水平。結(jié)果隨著PM2.5濃度的升高，細胞培養(yǎng)上清及支氣管上皮細胞中VEGF蛋白表達水平呈劑量依賴性增高；隨著PM2.5作用時間的延長，細胞培養(yǎng)上清中VEGF的表達水平呈時間依賴性增高；丹皮酚干預(yù)可抑制PM2.5誘導的VEGF表達，且抑制效應(yīng)呈劑量依賴性。結(jié)論PM2.5可誘導BEAS-2B表達VEGF，該作用可以被丹皮酚抑制。

丹皮酚；PM2.5；血管內(nèi)皮生長因子

細顆粒物(Particulate Matter2.5, PM2.5)是指大氣總懸浮顆粒物中空氣動力學效應(yīng)直徑≤2.5 μm的顆粒物，為大氣顆粒物的主要組成部分，主要來源于汽車尾氣和燃煤[1]；PM2.5顆粒直徑小，可經(jīng)由呼吸道到達遠端肺損傷支氣管和肺泡，PM2.5長期刺激可誘發(fā)支氣管哮喘、肺炎、慢性支氣管炎、肺癌、間質(zhì)性肺病等呼吸系統(tǒng)疾病[2]。謝鵬等[3]研究表明，隨著PM2.5濃度的增加，人群中呼吸系統(tǒng)疾病死亡率明顯增加，每升高10 μg/m3，死亡率增加1.43%。近年來，PM2.5污染已成為我國第四大死亡原因[4]。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelia growth factor, VEGF)是呼吸系統(tǒng)損傷反應(yīng)中重要炎癥介質(zhì)之一，近年來多項研究表明其具有促進炎性細胞趨化、聚集、血管生成、氣道重塑等功能，在氣道炎癥性疾病尤其在哮喘的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[5-6]。

丹皮酚(Paeonol)又稱芍藥醇,主要為中藥牡丹皮中酚類化合物，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種作用[7-9]，但有關(guān)其抑制氣道炎癥的作用報道較少。

資料與方法

一、 材料

支氣管上皮細胞(BEAS-2B) 購自美國ATCC公司；DMEM高糖培養(yǎng)購自Hyclone公司； ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司；抗VEGF 抗體購自美國SantaCruz公司；丹皮酚(純度>98%)購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。

二、方法

1 BEAS-2B細胞的培養(yǎng)：于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中接種BEAS-2B細胞，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)至細胞融合80%，然后用PBS溶液洗滌兩次，加入0.25%胰酶消化，以2×105個/mL細胞密度接種于六孔板。

2 PM2.5的采集與制備：采樣點位于南京市鼓樓區(qū)，采用武漢天虹 TH-150 中流量總懸浮微粒采樣器，在空氣質(zhì)量指數(shù)大于5級及PM2.5嚴重超標的霧霾天采樣，將采樣纖維濾膜經(jīng)超聲洗脫處理后離心20min，收集提取物真空冷凍干燥成干粉，稱重，于-20℃避光保存?zhèn)溆?。使用時用滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)配置成質(zhì)量濃度分別為0、25、50、100ug/mL的PM2.5混懸液[10]。

3 PM2.5刺激：當BEAS-2B細胞以對數(shù)生長，融合達80%時，以無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后利用不同劑量的PM2.5刺激細胞。實驗分為：① 對照組，培養(yǎng)基中PM2.5 含量為0 μg/mL；② 刺激組：培養(yǎng)基中加入PM2.5，使其終濃度分別為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，刺激6 h、12 h、24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清，利用ELISA測定上清中VEGF蛋白水平；提取細胞全蛋白，利用Western Blot方法檢測細胞中VEGF蛋白水平。

4 丹皮酚干預(yù)：BEAS-2B在不同濃度PM2.5 (25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)刺激的同時，利用不同濃度丹皮酚(15μmol/L、30μmol/L)進行干預(yù)，藥物干預(yù)下孵育24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清，使用ELISA試劑盒檢測上清中VEGF蛋白水平。

三、 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、 PM2.5對BEAS-2B表達VEGF的影響

給予不同濃度PM2.5刺激BEAS-2B細胞24 h后，對細胞培養(yǎng)上清及細胞中VEGF蛋白表達水平進行檢測。結(jié)果提示，隨著PM2.5濃度的升高，細胞培養(yǎng)上清中VEGF水平呈濃度依賴性逐漸增加，p值分別為0.001、0.0252、0.0381，差別存在統(tǒng)計學意義(圖1A)。利用Western Blot方法對BEAS-2B細胞中VEGF蛋白表達水平進行檢測，結(jié)果顯示： BEAS-2B細胞中VEGF蛋白表達隨著不同濃度的PM2.5刺激呈濃度依賴性逐步提高， P值分別為0.0279、0.0004、0.0043，差別有統(tǒng)計學意義(圖1B，1C)。

圖1A不同濃度PM2.5刺激后BEAS-2B細胞培養(yǎng)上清中VEGF的蛋白表達水平圖1B不同濃度PM2.5刺激后BEAS-2B細胞VEGF的蛋白表達水平圖1C不同濃度PM2.5刺激后BEAS-2B細胞中VEGF的蛋白表達水平

在同一濃度下，利用PM2.5分別刺激細胞6 h、12 h、24 h，隨PM2.5作用時間延長，細胞培養(yǎng)上清中VEGF蛋白表達水平逐步上升。如圖2所示，PM2.5濃度為25 μg/mL時，P值分別為0.001、<0.001；PM2.5濃度為50 μg/mL是，P值分別為<0.001、0.003；PM2.5濃度為100 μg/mL組P值分別為<0.001、<0.001，差別均存在統(tǒng)計學意義。

圖2 不同濃度PM2.5作用不同時間誘導VEGF表達水平變化

與作用時間6 h 組相比，#P<0.05； 與作用時間12 h 組相比：*P<0.05

二、 丹皮酚干預(yù)后對VEGF表達的影響

BEAS-2B細胞在PM2.5 (25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL )各種濃度刺激下，分別利用不同濃度丹皮酚(15 μg/mL、30 μg/mL)進行干預(yù)24 h，用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中VEGF表達水平。(見圖3)所示，丹皮酚對基礎(chǔ)狀態(tài)下VEGF的表達無抑制作用，但可以抑制各個濃度PM2.5誘導的VEGF表達上調(diào)。對照組 BEAS-2B 細胞隨著丹皮酚(15μmol/L、30μmol/L )濃度變化，VEGF水平無顯著變化(P值分別為0.093、0.087 )；在PM2.5濃度分別為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL時，15μmol/L丹皮酚即可抑制細胞VEGF的表達(P值分別為<0.001、0.008、<0.001)；30μmol/L丹皮酚與15μmol/L丹皮酚相比，可進一步抑制VEGF表達水平(P值分別為<0.001、<0.001、0.015 )，差別有統(tǒng)計學意義。

圖3 不同濃度的丹皮酚對BEAS-2B細胞VEGF表達的影響

討 論

PM2.5主要來源為煤炭燃燒、機動車尾氣、煙草煙霧等，其化學成分主要包括多環(huán)芳香烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs )類以及鐵、鋅等金屬元素，目前關(guān)于PM2.5的研究較多，既往研究表明，PM2.5可通過招募炎癥細胞、釋放細胞因子和活性氧(ROS)，進而激活不同的路徑,如促細胞分裂原活化蛋白(MAP)激酶,核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB),信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子-1(Stat-1)等參與呼吸系統(tǒng)疾病如哮喘、慢阻肺、肺纖維化,甚至肺癌的發(fā)生[11]。劉莎莎[12]、徐秀段[13]等曾研究表明PM2.5可通過活化NF-ΚB、轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(AP-1)進而調(diào)控多種炎性因子(如IL-8、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、VEGF)表達，誘導氣道炎癥反應(yīng)。

VEGF廣泛分布于肺組織中，在炎癥、血管新生和調(diào)節(jié)上皮層通透性中均發(fā)揮重要作用。近年來血管因素在慢阻肺及哮喘所致的氣道重塑中受到越來越多的關(guān)注，哮喘主要表現(xiàn)為血管生成和血管滲漏同時慢阻肺主要表現(xiàn)為血管舒張和血管滲漏。[14]VEGF在哮喘及慢阻肺中是一種血管生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，如哮喘氣道中VEGF可以促進氣道內(nèi)皮細胞的增殖、分化和誘導血管滲漏，同時可以調(diào)節(jié)Th2細胞反應(yīng)進而趨化單核細胞和嗜酸粒細胞聚集并導致氣道水腫[15]。

本課題組在既往研究中已發(fā)現(xiàn)，PM2.5可加重哮喘小鼠的氣道炎癥[16]，為進一步探索PM2.5參與哮喘氣道炎癥的分子機制，本實驗對PM2.5干預(yù)后的支氣管上皮細胞內(nèi)的VEGF的變化進行研究，研究發(fā)現(xiàn)PM2.5能夠呈濃度及時間依賴性增加支氣管上皮細胞對VEGF的表達，該結(jié)果提示PM2.5 可能通過上調(diào)VEGF導致呼吸系統(tǒng)損傷進而誘導哮喘的加重。其機制可能為 PM2.5激活氣道上皮細胞內(nèi)的NF-κB、PA-1等，進而上調(diào)VEGF的表達[12-13]。

目前全球每年有320萬人的死亡歸因于PM2.5污染，嚴重增加全球的疾病負擔[17]；Wagner等[18]研究證實，暴露于PM2.5會導致氧化應(yīng)激、氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，控制因PM2.5所致的氣道損傷可進一步減少呼吸系統(tǒng)疾病尤其是哮喘的發(fā)作具有重要意義。丹皮酚是從牡丹花根皮中提取出來的一種多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜、止痛、抗腫瘤等多種生物學效應(yīng)[19]。目前已有應(yīng)用以丹皮酚為主要成分的藥物治療皮膚和關(guān)節(jié)炎癥的報道，有研究證實丹皮酚可通過調(diào)節(jié)IL-8等細胞因子減輕氣道炎癥[10]。本實驗使用丹皮酚干預(yù)PM2.5刺激后的BEAS-2B細胞發(fā)現(xiàn)：丹皮酚能顯著抑制PM2.5誘導氣道上皮細胞分泌VEGF，且抑制作用呈隨著丹皮酚濃度的增加而加強。

綜上所述，PM2.5可通過上調(diào)氣道內(nèi)VEGF的表達導致氣道炎癥加重，而丹皮酚能通過抑制VEGF表達減輕氣道炎癥，可為進一步開發(fā)新藥物對抗因PM2.5引起的氣道炎癥如哮喘、慢阻肺急性加重等提供一定的實驗依據(jù)，但仍需體內(nèi)實驗進一步驗證，其具體分子機制尚需進一步深入研究。

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InhibitoryeffectofpaeonolontheexpressionofVEGFinbronchialepithelialcellsinducedbyPM2.5

WENGXiao-qin,DUQiang,FENGGan-zhu,HUANGMao

DepartmentofRespiratoryMedicine,thefirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu210029,China

ObjectiveTo explore the effect of peaonol on the expression of vascular endothelia growth factor (VEGF) in human epithelia cell (BEAS-2B) stimulated with particulate matter 2.5 (PM2.5).MethodsBEAS-2B cells were stimulated with PM2.5 (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL), the cell culture supernatants were collected after 6 h, 12 h and 24 h and cells were obtained after 24 h. VEGF in supernatants and cells were detected with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western Blot respectively. BEAS-2B cells stimulated with PM2.5 (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) were treated with peaonol (15μmol/L, 30μmol/L) for 24 h in vitro. After treatment, the cell culture supernatants were collected and VEGF in the supernatants were estimated by ELISA.ResultsPM2.5 enhanced the protein expression of VEGF in supernatants and BEAS-2B cells in a dose dependent way and increased its expression in supernatants in a time dependent way. Peaonal could inhibit PM2.5-induced VEGF expression in a dose dependent way.ConclusionPM2.5 could up-regulate the expression of VEGF in BEAS-2B, which could be suppressed by peaonol.

Paeonol; PM2.5; vascular endothelia growth factor

2017-04-23]

歡迎訂閱2018年《臨床肺科雜志》

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.11.009

南京醫(yī)科大學面上項目(No 2015NJMU015)

1. 210029 江蘇 南京，南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸科 2. 210011 江蘇 南京，南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院呼吸科

黃茂，E-mail: hm6114@126.com

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