陳燕玲*，羅 婷，凡 棟，吳秀香，王曉玲，黃霜枝

（遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)病理生理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041）

?基礎(chǔ)研究?

6-姜酚對(duì)抗丙酮醛引起的HK-2腎小管上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制

陳燕玲*，羅 婷，凡 棟，吳秀香，王曉玲，黃霜枝

（遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)病理生理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041）

目的探討6-姜酚對(duì)丙酮醛引起的HK-2腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）損傷的可能機(jī)制。方法 實(shí)驗(yàn)分為四組：對(duì)照組、丙酮醛損傷組、丙酮醛+6-姜酚組（丙酮醛與6-姜酚共處理）及6-姜酚組。用DCFH-DA（雙氯熒光素）染色法檢測(cè)HK-2細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平；比色法測(cè)點(diǎn)細(xì)胞SOD（超氧化物歧化酶）活力；western blot法檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與對(duì)照組相比，丙酮醛損傷組HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增高，SOD活力明顯降低，而NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯增高；加入6-姜酚處理后，HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平及NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低，而SOD活力明顯增高。結(jié)論 6-姜酚對(duì)抗丙酮醛引起的HK-2細(xì)胞損傷的機(jī)制可能與其提高細(xì)胞抗氧化能力及抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路有關(guān)。

6-姜酚；丙酮醛；氧化應(yīng)激；NF-κB

干姜是一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物，從干姜中分離出姜酚的結(jié)晶體，包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚等，其中6-姜酚是干姜中最主要的活性成分[1]。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，6-姜酚可以對(duì)丙酮醛引起的HK-2腎小管上皮細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，但其機(jī)制未明。因此，本研究旨在探討6-姜酚對(duì)抗丙酮醛引起的HK-2細(xì)胞損傷作用的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞株

由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。

1.1.2 藥品與主要試劑

6-姜酚（純度＞98%）購自上海同田生物技術(shù)有限公司，丙酮醛（純度＞95%）購自上海源葉生物科技有限公司，DCFH-DA（雙氯熒光素）購自Sigma，SOD試劑盒購自南京建成公司，NF-κB抗體及β-actin抗體均購自Cell Signaling Technology。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，每孔1000 μL，分為對(duì)照組、丙酮醛損傷組、丙酮醛+6-姜酚組及6-姜酚組。其中丙酮醛和6-姜酚處理濃度分別為400 μmol/L和200 μmol/L。細(xì)胞給予相應(yīng)藥物處理24 h后，加入1 μg/LDCFH-DA染色液，于37℃下避光孵育30 min，然后在熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個(gè)不重復(fù)區(qū)拍照。

1.2.2 HK-2細(xì)胞內(nèi)SOD活力檢測(cè)

將HK-2細(xì)胞接種于24孔板，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。按照實(shí)驗(yàn)分組加入藥物處理24后。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液收集到EP管中，300 0rpm/min，離心10 min后吸取上清。按照南京建成公司SOD檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 Western blot 法檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)水平

將HK-2細(xì)胞按相應(yīng)密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，按實(shí)驗(yàn)分組加入藥物處理。24h后去掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗兩遍，每皿加入100 μL細(xì)胞裂解液，在冰上裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。每個(gè)泳道蛋白上樣量為50 μg，電泳：恒壓80V 30 min，100V 60 min。220 mA恒流轉(zhuǎn)膜1h。用5%脫脂奶粉封閉1h后加入NF-κB抗體及β-actin抗體，β-actin作為內(nèi)參。4℃搖床上孵育過夜，加入二抗。經(jīng)曝光、顯影及定影后，使用ImageJ軟件分析條帶的相應(yīng)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用“±s”表示，采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 6-姜酚對(duì)丙酮醛誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

DCFH-DA（2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽）本身沒有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后可被水解生成DCFH，在活性氧存在的情況下，DCFH被氧化生成熒光物質(zhì)DCF，綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比。如圖1所示，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度較弱，僅有少量ROS生成，而經(jīng)400 μmol/L的丙酮醛處理后，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說明ROS水平明顯升高；而加入6-姜酚共處理后，綠色熒光強(qiáng)度又顯著減弱，明顯抑制了丙酮醛誘導(dǎo)的ROS的生成。

圖1 6-姜酚對(duì)丙酮醛誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

2.2 6-姜酚對(duì)丙酮醛誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)SOD活力的影響

如圖2所示，HK-2細(xì)胞經(jīng)丙酮醛處理后的SOD活力明顯降低，而加入6-姜酚共處理后，SOD活力明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 6-姜酚對(duì)丙酮醛誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響

如圖3所示，HK-2細(xì)胞經(jīng)400 μmol/L的丙酮醛處理后，炎性細(xì)胞因子合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯增高，而加入6-姜酚共處理后，NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 6-姜酚對(duì)丙酮醛誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

我國糖尿病發(fā)病率很高，總?cè)藬?shù)達(dá)9200萬人，而隨著全球范圍內(nèi)糖尿病患者人數(shù)的不斷增加，糖尿病腎病發(fā)病率也會(huì)隨之增高[2]。研究發(fā)現(xiàn)，丙酮醛是引起糖尿病組織細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素[3]。因此，尋求有效對(duì)抗丙酮醛損傷的藥物是我們臨床治療糖尿病腎病的重要內(nèi)容。我們先前報(bào)道干姜的主要活性成分——6-姜酚對(duì)丙酮醛誘導(dǎo)的HK-2腎小管上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，但機(jī)制尚未闡明。研究報(bào)道，6-姜酚可以通過抗氧化作用以及調(diào)節(jié)NF-κB對(duì)抗阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡[1,4]。本研究結(jié)果顯示，6-姜酚可以明顯抑制丙酮醛引起的HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS的生成以及NF-κB蛋白的表達(dá)水平，并且提高細(xì)胞內(nèi)SOD的活力。表明6-姜酚可能通過提高HK-2細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力及抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路對(duì)抗丙酮醛引起的HK-2細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)將為干姜在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

[1] Chen YL,Zhuang XD,Xu ZW,et al,Higenamine Combined with 6-Gingerol Suppresses Doxorubicin-Triggered Oxidative Stress and Apoptosis in Cardiomyocytes via Upregulation of PI3K/Akt Pathway,Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:970490.

[2] Yang W,Lu J,Weng J,et al,Prevalence of diabetes among men and women in China.N Engl J Med,2010,362(12):1090-101.

[3] Beisswenger PJ,Howell SK,Russell GB,et al.,Early progression of diabetic nephropathy correlates with methylglyoxal-derived advanced glycation end products.Diabetes Care,2013,36(10):3234-9.

[4] El-Bakly WM,Louka ML,El-Halawany AM,et al,6-gingerol ameliorated doxorubicin-induced cardiotoxicity:role of nuclear factor kappa B and protein glycation.Cancer Chemother Pharmacol,2012 Dec;70(6):833-41.

R285.5

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ISSN.2095-8242.2017.052.10111.03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（NO.：81560133）；貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（NO.：黔科合LH字[2015]7529號(hào)）；遵義醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金

陳燕玲，E-mail：546475534@qq.com

本文編輯：趙小龍