楊 帆 袁 芳 朱躍蘭

(北京中醫(yī)藥大學(xué)2015級(jí)博士研究生，北京 100029)

比較2種造模方法對(duì)家兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的血清及關(guān)節(jié)液中炎性因子的影響※

楊 帆 袁 芳1朱躍蘭△

(北京中醫(yī)藥大學(xué)2015級(jí)博士研究生，北京 100029)

目的檢測(cè)2種造模方法制備的家兔膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)模型的血清及關(guān)節(jié)液中炎性因子含量，分析2種造模方法對(duì)家兔KOA模型的血清及關(guān)節(jié)液中炎性因子的影響。方法將10只新西蘭大白兔隨機(jī)分為模型1組、模型2組，每組5只。模型1組采用改良后伸直位固定法制備KOA模型；模型2組采用雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物法制備KOA模型。觀察2組家兔的一般狀態(tài)并記錄體質(zhì)量、患側(cè)膝關(guān)節(jié)寬度及Lequesne指數(shù)。比較2組家兔造模后血清及關(guān)節(jié)液中炎性因子[前列腺素E2(PGE2)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)]含量水平。結(jié)果模型2組首次注射木瓜蛋白酶溶液后及模型1組膝關(guān)節(jié)制動(dòng)后的1周內(nèi)，家兔出現(xiàn)精神萎靡，進(jìn)食量減少，活動(dòng)靈活性減低，患側(cè)肢體跛行，甚至蹬地?zé)o力伴疼痛、回頭舔吮等狀態(tài)。2組家兔造模前后體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2組家兔造模后患側(cè)膝關(guān)節(jié)寬度均較本組造模前增加(P<0.05)，模型2組造模后患側(cè)膝關(guān)節(jié)寬度較模型1組增加(P<0.05)。2組家兔造模前后Lequesne指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組家兔造模后Lequesne指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2組家兔造模后血清中PGE2、IL-1β及TNF-α含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型2組高于模型1組。2組家兔關(guān)節(jié)液中IL-1β及TNF-α含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型2組高于模型1組；PGE2含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論2種造模方法對(duì)家兔的一般生活狀態(tài)影響不大，而對(duì)其血清及關(guān)節(jié)液中炎性因子影響較為明顯。

骨關(guān)節(jié)炎，膝；動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是臨床常見的一種嚴(yán)重影響人類健康生活的疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬及功能活動(dòng)障礙等癥狀[1]。其主要病理特征是關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨破壞，具有發(fā)病緩慢、呈漸進(jìn)性退變的特點(diǎn)[2]，在生物學(xué)和力學(xué)因素共同作用下形成[3]。近年來，骨關(guān)節(jié)疾病增多，尤以膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)為主，隨著人們生活水平的提高，追求高水平的生活質(zhì)量也日趨受到重視，因此對(duì)KOA的基礎(chǔ)研究也逐漸深入。目前本病病因及發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，因此建立相應(yīng)的KOA模型以研究其病理機(jī)制及防治方法具有重要意義。

在KOA發(fā)病過程中，關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨細(xì)胞因炎性因子增多而破壞加重，因此通過檢測(cè)動(dòng)物血清及關(guān)節(jié)液中炎性因子的含量水平，可分析KOA嚴(yán)重程度。我們?cè)诓殚喯嚓P(guān)文獻(xiàn)[4-9]的基礎(chǔ)上，選取2種家兔KOA的造模方法：改良后伸直位固定法和雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物法。2種方法都較為成熟且常用，但對(duì)所造成的KOA炎性因子含量水平之間的差異尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立以上2種家兔KOA模型，檢測(cè)家兔血清及關(guān)節(jié)液中炎性因子的含量，比較并分析2種造模方法之間的異同點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康新西蘭大白兔10只，購于北京市海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0003，10周齡，體質(zhì)量2 kg左右，飼養(yǎng)于中國人民解放軍陸軍總醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室，均單籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，自然光線照射，室溫20～22 ℃，濕度46%～60%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 實(shí)驗(yàn)試劑：木瓜蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：325A0210)，青霉素G鈉鹽(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：916B0213)，水合三氯乙醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150812)，碘伏消毒液(德州安捷高科消毒制品有限公司，批號(hào)：20141202)，75%醫(yī)用酒精(北京鴻志偉達(dá)工貿(mào)有限公司朝陽衛(wèi)生用品分公司，批號(hào)：20150910)，0.9%氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H13023200)，前列腺素E2(PGE2)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒，均由北京歐北生物科技有限公司提供。造模材料：醫(yī)用高分子繃帶(規(guī)格：7.5 cm×360 cm，蘇州元康醫(yī)療器械有限公司)，醫(yī)用脫脂棉，醫(yī)用紗布，醫(yī)用膠帶。行為學(xué)測(cè)試材料：游標(biāo)卡尺，關(guān)節(jié)測(cè)量醫(yī)用測(cè)角尺。儀器：電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]，Eppendorf高速離心機(jī)(Eppendorf AG 22331 Hamburg Germany，5810R型)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將10只新西蘭大白兔隨機(jī)分為模型1組、模型2組，每組5只。

1.2.2 模型制備

1.2.2.1 模型1組 采用改良后伸直位固定法，即右后肢伸直位固定制動(dòng)法制備KOA模型[4-7]。將家兔仰臥位固定于兔固定臺(tái)上，牽拉右后肢使其處于完全伸直位，將醫(yī)用脫脂棉墊在醫(yī)用高分子繃帶內(nèi)側(cè)，從腹股溝至足趾固定家兔的右后肢(膝關(guān)節(jié)伸直呈180 °，踝關(guān)節(jié)背屈呈60 °)，用醫(yī)用紗布將醫(yī)用高分子繃帶固定好，待其定型后外套絲襪以防動(dòng)物撕咬，再用醫(yī)用膠帶將絲襪固定，剪開絲襪留出足趾以便觀察右后肢血供或腫脹等情況，固定制動(dòng)6周。注意事項(xiàng)：①如足趾腫脹嚴(yán)重或有壞死傾向，立即拆除全部固定，待腫脹消退后再重新固定。②家兔制動(dòng)后行動(dòng)不便，可能會(huì)出現(xiàn)健側(cè)肢體卡在金屬籠空隙中等情況，需注意觀察，如出現(xiàn)上述情況，立即拆除全部固定，待卡住的肢體恢復(fù)正常血供1～2 d后再行固定。③若固定部位磨損皮膚，嚴(yán)重者出現(xiàn)感染等情況，立即肌肉注射青霉素G鈉鹽溶液(將青霉素G鈉鹽2.0×105U溶于0.9 %氯化鈉注射液0.5 mL中)0.5 mL，連續(xù)肌肉注射3 d。

1.2.2.2 模型2組 采用雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物法制備KOA模型[8-9]。配制木瓜蛋白酶溶液(將木瓜蛋白酶0.25 g溶于0.9%氯化鈉溶液5 mL中)，將家兔雙側(cè)后肢彎曲，充分暴露膝關(guān)節(jié)，每次向雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注入木瓜蛋白酶溶液0.5 mL。對(duì)5只實(shí)驗(yàn)家兔分別于造模第1、4、7 d行3次雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，以強(qiáng)化造模效果。3次雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射后再觀察1周。注意事項(xiàng)：膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)范進(jìn)行，防止給藥局部出現(xiàn)感染等情況，若出現(xiàn)嚴(yán)重感染，立即肌肉注射青霉素G鈉鹽溶液0.5 mL，連續(xù)肌肉注射3 d。

1.3 觀察指標(biāo) 在實(shí)驗(yàn)過程中，觀察2組家兔的一般狀態(tài)并用體質(zhì)量秤稱取動(dòng)物體質(zhì)量、用游標(biāo)卡尺測(cè)量患側(cè)膝關(guān)節(jié)最大寬度，用Lequesne指數(shù)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。比較2組家兔造模后血清及關(guān)節(jié)液中炎性因子含量水平。

1.4 Lequesne指數(shù)檢測(cè) 分別于造模前后采用Lequesne指數(shù)對(duì)2組家兔患肢疼痛、步態(tài)、關(guān)節(jié)活動(dòng)、關(guān)節(jié)腫脹程度進(jìn)行測(cè)量評(píng)估。要求由2名評(píng)分人員同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)家兔進(jìn)行評(píng)估并各自打分，結(jié)果取平均值，2次評(píng)估人員相同。Lequesne指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]見表1。

表1 Lequesne指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 動(dòng)物標(biāo)本處理方法 造模成功后，用10%水合三氯乙醛溶液按3 mL/kg經(jīng)耳緣靜脈麻醉后，分別于頸總動(dòng)脈取血及患側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)抽吸0.9%氯化鈉注射液灌注液，經(jīng)3 000 r/min離心15 min后取上清液，分裝于離心管內(nèi)，做好標(biāo)記后置于-80 ℃冰箱保存。利用ELISA法按其試劑盒提供的操作流程，分別對(duì)血清及關(guān)節(jié)液中的PGE2、IL-1β及TNF-α含量進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 2組家兔一般狀態(tài)比較 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，所有家兔均存活，但模型2組首次注射木瓜蛋白酶溶液后及模型1組膝關(guān)節(jié)制動(dòng)后的1周內(nèi)，家兔出現(xiàn)精神萎靡，進(jìn)食量減少，活動(dòng)靈活性減低，患側(cè)肢體跛行，甚至蹬地?zé)o力伴疼痛、回頭舔吮等狀態(tài)。

2.2 2組家兔造模前后Lequesne指數(shù)比較 見表2。

表2 2組家兔造模前后Lequesne指數(shù)比較 分

與本組造模前比較，*P<0.05

由表2可見，2組家兔造模前后Lequesne指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組家兔造模后Lequesne指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 2組家兔造模前后體質(zhì)量及患側(cè)膝關(guān)節(jié)寬度比較 見表3。

模型1組(n=5)造模前造模后模型2組(n=5)造模前造模后體質(zhì)量(kg)2．08±0．842．52±0．222．06±0．552．42±0．13患側(cè)膝關(guān)節(jié)寬度(mm)15．58±0．8618．64±0．85?△16．10±0．7021．17±0．72?

與本組造模前比較，*P<0.05；與模型2組造模后比較，△P<0.05

由表3可見，2組家兔造模前后體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2組家兔造模后患側(cè)膝關(guān)節(jié)寬度均較本組造模前增加(P<0.05)，模型2組造模后患側(cè)膝關(guān)節(jié)寬度較模型1組增加(P<0.05)。

2.4 2組家兔造模后血清及關(guān)節(jié)液中炎性因子水平比較 見表4。

組 別模型1組(n=5)血清關(guān)節(jié)液模型2組(n=5)血清關(guān)節(jié)液PGE295．17±16．51?86．86±12．89124．42±21．16108．29±24．43IL-1β17．28±2．02?27．61±5．23?28．61±5．0340．06±10．70TNF-α15．06±2．23?18．17±1．51?22．64±3．1726．75±2．28

與模型2組比較，*P<0.05

由表4可見，2組家兔造模后血清中PGE2、IL-1β及TNF-α含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型2組高于模型1組。2組家兔關(guān)節(jié)液中IL-1β及TNF-α含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型2組高于模型1組；PGE2含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

在KOA的基礎(chǔ)研究中，因家兔膝關(guān)節(jié)具有關(guān)節(jié)面較寬、取材量較多且容易等特點(diǎn)，結(jié)構(gòu)又與人類相近，所以多選其作為KOA的動(dòng)物模型以便研究本病的病程進(jìn)展、組織病理學(xué)特征或篩選診療方法等。對(duì)于KOA家兔的造模方法也多種多樣，有手術(shù)切除膝關(guān)節(jié)韌帶或結(jié)扎血管[11]、石膏固定膝關(guān)節(jié)制動(dòng)方法[12]、直接向膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物局部破壞關(guān)節(jié)軟骨[13]等，不同的造模方法有不同的優(yōu)勢(shì)，針對(duì)不同的KOA成因可采用不同的方法。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶溶液引起的骨關(guān)節(jié)炎[14-15]，具有實(shí)驗(yàn)總體時(shí)間短、重復(fù)性好、成功率高、造模成型周期短等優(yōu)點(diǎn)，且病變典型，過程清晰，與人類KOA相似度高[16-17]。

炎性因子在KOA的進(jìn)展過程中具有重要作用。其中PGE2就是參與軟骨基質(zhì)破壞的主要炎性因子，它可參與激活破骨細(xì)胞，促進(jìn)血管新生，破壞骨與軟骨正常組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)PGE2又是重要的致痛因子，是造成關(guān)節(jié)疼痛的主要原因[18]。IL-1β主要作用于關(guān)節(jié)軟骨，它能抑制透明軟骨特征性的Ⅱ型膠原蛋白合成，反而促進(jìn)Ⅰ或Ⅲ型膠原蛋白合成，從而影響軟骨細(xì)胞正常代謝，使軟骨細(xì)胞變形，抑制軟骨細(xì)胞增殖和蛋白多糖合成[19-20]，進(jìn)而加重骨關(guān)節(jié)炎的病情程度。TNF-α是一種多功能炎性因子，主要作用于滑膜，刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生PGE2，從而間接使骨與軟骨發(fā)生破壞[21]。大量研究表明TNF-α還能誘導(dǎo)IL-1β產(chǎn)生，而IL-1β和TNF-α均能刺激PGE2生成，因此3種炎性因子互相協(xié)同作用，共同加重關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨破壞，加速骨關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，2組不同的造模方法均可使實(shí)驗(yàn)家兔的體內(nèi)血清中及局部的膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)大量的炎性因子PGE2、IL-1和TNF-α，表明不同的方法均可促進(jìn)KOA形成，加重疾病嚴(yán)重程度。但血清及關(guān)節(jié)液中炎性因子的含量水平有所不同，通過膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)直接注射木瓜蛋白酶溶液的方法，炎性因子的含量較膝關(guān)節(jié)制動(dòng)增加明顯(P<0.05)，說明膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)直接注射藥物法能夠使實(shí)驗(yàn)家兔的KOA疾病的嚴(yán)重程度變化更明顯。通過肉眼大體觀察2組家兔患側(cè)膝關(guān)節(jié)寬度均增加，游標(biāo)卡尺測(cè)量結(jié)果也顯示進(jìn)行膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射法干預(yù)的家兔增加明顯。但2組家兔的一般活動(dòng)狀態(tài)與體質(zhì)量變化情況相似，Lequesne指數(shù)也相近，比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可見2組實(shí)驗(yàn)家兔在一般狀態(tài)及膝關(guān)節(jié)功能活動(dòng)表現(xiàn)上差異并不明顯。因此認(rèn)為，若肉眼直觀KOA實(shí)驗(yàn)家兔的一般活動(dòng)狀態(tài)與體質(zhì)量變化情況，則2種造模方法均可適用，若需檢測(cè)模型的炎性因子水平情況，則膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶溶液的方法較膝關(guān)節(jié)固定制動(dòng)方法變化更為明顯。

綜上，相較膝關(guān)節(jié)固定制動(dòng)法，用膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物的方法在復(fù)制KOA動(dòng)物模型方面，更為省時(shí)、省力且經(jīng)濟(jì)，同時(shí)效果穩(wěn)定，與人類KOA的發(fā)病機(jī)制相近，是建立KOA動(dòng)物模型的理想方法。同時(shí)操作者的操作技能、無菌技術(shù)及動(dòng)物護(hù)理對(duì)造模結(jié)果亦有很大影響，研究者需考慮實(shí)驗(yàn)具體需求，采用最合適的造模方法。

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(本文編輯：習(xí) 沙)

Comparisontheeffectsoftwomodelingmethodsoninflammatoryfactorsinserumandsynovialfluidofrabbitkneeosteoarthritismodel

YANGFan*,YUANFang,ZHUYuelan.

*2015-GradeDoctoralCandidateofBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100029

ObjectiveTo detect the content of inflammatory factors in serum and synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis (KOA) model by two modeling methods, and analyze the effects of two modeling methods on inflammatory factors in serum and synovial fluid of rabbit KOA model.Methods10 New Zealand white rabbits were randomly divided into model group 1, model group2, 5 rabbits in each group. The KOA model in model group 1 was prepared by the modified methods of immobilization in extension position. The KOA model in model group 2 was prepared by intracavitary injection drug of bilateral knee. The general state of rabbits were observed, and the body mass, the width of affected side knee joint and Lequesne index were recorded in two groups. The levels of inflammatory factors including prostaglandin E2(PGE2), interleukin-1 beta (IL-1β), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) in serum and synovial fluid after model establishment were compared in the two groups.ResultsAfter injection of papain solution for the first time in model group 2 and after braking knee in model 1, rabbits appeared apathetic, reduced food intake, reduced activity flexibility, affected side limb limping, and even pedal unable with suffer pain, turn back for lick and suck and other states within 1 week. There was no statistical difference on the body mass between before and after modeling in two groups (P>0.05). The width of affected side knee joint after modeling increased in the two groups (P<0.05), and the width of affected side knee joint after modeling in model group 2 was higher than that in model group 1 (P<0.05). There were statistical differences on the Lequesne index between before and after modeling in two groups (P<0.05). There was no statistical difference on the Lequesne index after modeling between the two groups (P>0.05). The contents of PGE2, IL-1β and TNF-α in serum in model group 2 were higher than those in model group 1 with statistical differences (P<0.05). The contents of IL-1β and TNF-α in synovial fluid in model group 2 were higher than those in model group 1 with statistical differences (P<0.05),and with no statistical difference on PGE2(P>0.05).ConclusionThe two modeling methods has no statistical difference on the general life status of rabbits, but has obvious influences on inflammatory factors in serum and synovial fluid

Osteoarthritis; Knee; Animal; Experiment

R684.3；R684.305；R-331

A

1002-2619(2017)09-1368-05

2017-06-01)

※ 項(xiàng)目來源：北京市科技計(jì)劃課題(編號(hào)：Z151100003815013)

△ 通訊作者：北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院風(fēng)濕科，北京 100078

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院針灸中心，北京 100010

楊帆(1990—)，女，博士研究生在讀，碩士。研究方向：中醫(yī)藥防治風(fēng)濕病。