王勇，張春祥，高葦，孔慶學(xué)，閻瑞香，張娜

(1.天津市植物保護(hù)研究所，天津 300381；2. 天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384；3. 國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心(天津)/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300381)

灰葡萄孢毒素對(duì)產(chǎn)后蒜薹的致病性及其毒素基因的檢測(cè)

王勇1，張春祥1，高葦1，孔慶學(xué)2，閻瑞香3，張娜3

(1.天津市植物保護(hù)研究所，天津 300381；2. 天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384；3. 國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心(天津)/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300381)

為明確灰葡萄孢毒素對(duì)產(chǎn)后蒜薹的致病性及其毒素基因的檢測(cè)方法，本研究運(yùn)用蒜薹灰霉病強(qiáng)致病菌株灰葡萄孢霉BC-3，通過蒜薹懸滴接種法、系統(tǒng)侵染法和毒素浸漬法，測(cè)定灰葡萄孢毒素對(duì)蒜薹薹條和薹苞組織損傷及細(xì)胞葉綠素降解的活性。結(jié)果表明，灰葡萄孢毒素是導(dǎo)致產(chǎn)后蒜薹灰霉病的重要因素，可造成蒜薹組織細(xì)胞損傷、葉綠素降解，并可由輸導(dǎo)組織傳導(dǎo)造成蒜薹組織系統(tǒng)侵害。同時(shí)建立了灰葡萄孢毒素BcBOT2基因特異性檢測(cè)方法，可用于其引起的蒜薹灰霉病早期檢測(cè)。

灰葡萄孢霉；蒜薹；毒素；致病性；毒素基因

由灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)引起的產(chǎn)后蒜薹灰霉病，多在蒜薹入庫(kù)2～3個(gè)月后發(fā)生，導(dǎo)致蒜薹爛梢、爛基、斷條[1]，已成為蒜薹貯藏保鮮的重要限制性因素之一[2]?；移咸焰呙钩Ｔ谥参锇l(fā)育早期階段侵入宿主，并在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持沉默，直到宿主植物生理發(fā)生變化有利于其生長(zhǎng)時(shí)，便快速引發(fā)宿主軟腐，造成成熟或衰老組織的嚴(yán)重破壞。究其原因是由于植物病原真菌在與宿主植物相互識(shí)別、相互作用的過程中所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物——真菌毒素導(dǎo)致產(chǎn)后蒜薹灰霉病的發(fā)生，而且在致病過程中起著決定因子的作用[3,4]。由灰葡萄孢霉中分離鑒定出的二環(huán)倍半萜烯毒素Botrydial毒性最高[5]，被認(rèn)為是致病的關(guān)鍵因素，可引發(fā)辣椒、菜豆等黃萎和組織細(xì)胞破裂[6]，其余多為其前體或衍生物[7]。近年來(lái)，合成Botrydial的基因簇及其編碼的蛋白序列已經(jīng)鑒定出來(lái)，其中BcBOT2基因負(fù)責(zé)編碼Botrydial合成途徑中關(guān)鍵酶——倍半萜合酶[8]，敲除BcBOT2基因的灰葡萄孢霉失去合成Botrydial和相關(guān)化合物的能力，菌株毒力基本喪失[9]。因此筆者從蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)產(chǎn)后蒜薹組織的致病作用及毒素BcBOT2基因檢測(cè)入手，探索灰霉病菌毒素對(duì)蒜薹的致病性及其檢測(cè)方法，為產(chǎn)后蒜薹灰霉病的綠色防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試菌株

產(chǎn)后蒜薹灰霉病強(qiáng)致病力菌株BC-3，經(jīng)鑒定為灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)，由天津市植物保護(hù)研究所種苗室分離、鑒定和保存。

1.2產(chǎn)后蒜薹灰霉病菌毒素濾液的制備

試驗(yàn)采用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，加蒸餾水至1 L)和PD培養(yǎng)液。在250 mL三角瓶中分別加入PD培養(yǎng)液150 mL，共制備30瓶。

將供試蒜薹灰霉病菌BC-3移至PDA培養(yǎng)基上，于25℃下培養(yǎng)4 d，用直徑4 mm的打孔器在長(zhǎng)勢(shì)一致的菌落邊緣打取菌餅，接種到裝有PD培養(yǎng)液的三角瓶中，每瓶接種5塊菌餅，在黑暗條件下25℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)第0、3、6、7、9、12、14、15、18、21 d分別取一瓶培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液通過雙層滅菌濾紙過濾除去菌絲體和孢子后，用0.22 μm微孔濾膜加壓抽濾，獲得無(wú)菌濾液，即蒜薹灰霉病菌毒素濾液。4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)產(chǎn)后蒜薹組織的致病作用

1.3.1 蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)蒜薹細(xì)胞損傷的活性 采用毒素懸滴接種法。選取同一生長(zhǎng)期的蒜薹薹條和薹苞，將其放在鋪有兩層浸濕濾紙的大培養(yǎng)皿中，在蒜薹薹條和薹苞表面采用接種針制造傷口，懸滴接種20 μL毒素濾液(分別為PD培養(yǎng)第0、3、6、9、12、15、18、21 d菌液毒素)于傷口表面，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)3皿，每皿放入5個(gè)蒜薹薹條或薹苞，以接種20 μL無(wú)菌水為清水對(duì)照。同時(shí)用無(wú)菌水將毒素濾液稀釋10、100倍，以1、10、100倍液分別懸滴接種蒜薹薹條。將處理的蒜薹組織，于25℃培養(yǎng)箱中(光周期為12 h)保濕培養(yǎng)3 d后，調(diào)查毒素接種點(diǎn)的細(xì)胞損傷情況。

1.3.2 蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)蒜薹組織系統(tǒng)影響的活性 采用毒素系統(tǒng)侵染法。取各毒素濾液5 mL加入到20 mL燒瓶中，將采集的同一生長(zhǎng)期的蒜薹薹條和薹苞一端浸入濾液中，每處理重復(fù)3次，以浸入5 mL無(wú)菌水為清水對(duì)照。25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后(光周期為12 h)，調(diào)查蒜薹薹條和薹苞的黃變程度。蒜薹黃變程度標(biāo)準(zhǔn)為：-，薹條或薹苞無(wú)顯著變化；+，薹條或薹苞部分失綠；++，薹條或薹苞整體失綠；+++，薹條或薹苞組織變黃。

1.3.3 蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)蒜薹細(xì)胞葉綠素降解的活性 采用毒素浸漬法。取6 mm平皿，分別加入7、14、21 d獲得的毒素濾液3 mL，將采集的同一生長(zhǎng)期的蒜薹薹條和薹苞切成10 mm苔段，浸入3 mL毒素濾液中，每處理重復(fù)3次，以浸入3 mL無(wú)菌水為清水對(duì)照。25℃培養(yǎng)箱中處理24、48 h后(光周期為12 h)，每處理蒜薹組織采用濾紙吸干毒素汁液后，采用10 mL丙酮乙醇溶液(丙酮∶無(wú)水乙醇=1∶1，V/V)室溫萃取，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量OD663和OD645，計(jì)算葉綠素含量。毒素會(huì)對(duì)蒜薹細(xì)胞內(nèi)葉綠素產(chǎn)生影響，通過檢測(cè)灰霉病菌毒素作用下蒜薹葉綠素降解程度，來(lái)確定毒素對(duì)蒜薹細(xì)胞葉綠素降解的活性。葉綠素含量計(jì)算方法：

葉綠素含量(mg/g)=(8.02×OD663+2.02×OD645×V)/(100×W)。

式中：V為毒素濾液體積；W為蒜薹質(zhì)量。

1.4蒜薹灰霉病菌毒素基因的檢測(cè)

以灰葡萄孢霉Botrydial毒素BcBOT2基因6 781～8 807 bp區(qū)段為模板，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(見表1)，由金維智公司合成。采用擴(kuò)增體系：總體系25 μL(Master Mix 12.5 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由金維智公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索比對(duì)。同時(shí)選取PCR擴(kuò)增效果較好的引物，分別以蒜薹灰霉病菌BC-3、蔥鱗葡萄孢霉、鏈格孢、青霉P1、青霉P2、粉紅單端孢、鐮刀菌的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳以檢測(cè)引物的特異性。

表1 灰葡萄孢霉Botrydial毒素BcBOT2基因6 781～8 807 bp表達(dá)區(qū)段的特異性引物

2 結(jié)果與分析

2.1蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)產(chǎn)后蒜薹組織的致病作用

2.1.1 蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)蒜薹細(xì)胞損傷的活性 由毒素懸滴接種試驗(yàn)結(jié)果(表2)可知，蒜薹灰霉病菌毒素可導(dǎo)致蒜薹薹條和薹苞細(xì)胞損傷，自接種點(diǎn)位置褪綠變黃，并擴(kuò)展形成病斑，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，接種點(diǎn)細(xì)胞壞死、黃變、擴(kuò)展程度逐漸加重，明顯造成蒜薹組織細(xì)胞損傷，且毒素對(duì)蒜薹薹苞的損傷較薹條嚴(yán)重。

由懸滴接種法測(cè)定不同稀釋濃度毒素濾液對(duì)接種點(diǎn)細(xì)胞損傷試驗(yàn)結(jié)果(表3)可知，由PD培養(yǎng)液培養(yǎng)3～21 d獲得毒素濾液，均可導(dǎo)致蒜薹薹條細(xì)胞損傷，使蒜薹自接種點(diǎn)位置褪綠變黃，并擴(kuò)展形成病斑。且隨著蒜薹灰霉病菌培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，薹條接種點(diǎn)細(xì)胞壞死、黃變、擴(kuò)展程度逐漸加重。毒素濾液稀釋后對(duì)接種點(diǎn)細(xì)胞損傷下降，培養(yǎng)9～21 d毒素濾液稀釋10倍仍對(duì)蒜薹接種點(diǎn)細(xì)胞造成損傷；稀釋100倍毒素，僅15～21 d毒素濾液對(duì)蒜薹有損傷，且隨著稀釋倍數(shù)的增加，毒素對(duì)蒜薹組織細(xì)胞損傷明顯下降。

表2 蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)蒜薹薹條和薹苞接種點(diǎn)細(xì)胞損傷的情況

注：“—”，接種點(diǎn)無(wú)顯著變化；“+”，接種點(diǎn)失綠；“++”，接種點(diǎn)失綠變黃；“+++”，接種點(diǎn)失綠變黃逐步擴(kuò)展；“++++”，接種點(diǎn)失綠變黃擴(kuò)展較大。下同。

表3 蒜薹灰霉病菌毒素的濃度變化對(duì)蒜薹薹條接種點(diǎn)細(xì)胞損傷的情況

2.1.2 蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)蒜薹組織系統(tǒng)損傷的活性 由毒素系統(tǒng)侵染試驗(yàn)結(jié)果(表4)可知，蒜薹灰霉病菌毒素可導(dǎo)致蒜薹薹條和薹苞系統(tǒng)損傷，造成薹條和薹苞整體褪綠變黃。說(shuō)明毒素可通過蒜薹輸導(dǎo)系統(tǒng)傳導(dǎo)使蒜薹上部發(fā)生褪綠、黃化，對(duì)蒜薹產(chǎn)生毒性影響。且隨著PD培養(yǎng)獲取毒素時(shí)間的延長(zhǎng)，由3～21 d獲取毒素導(dǎo)致蒜薹薹條和薹苞系統(tǒng)褪綠、黃變程度逐漸加重，明顯造成蒜薹組織系統(tǒng)損傷，且毒素對(duì)蒜薹薹苞的損傷較薹條嚴(yán)重。

2.1.3 蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)蒜薹組織細(xì)胞葉綠素降解的活性 由毒素浸漬法測(cè)定不同稀釋濃度毒素濾液處理蒜薹薹條組織細(xì)胞葉綠素降解試驗(yàn)結(jié)果(表5)可知，PD培養(yǎng)液培養(yǎng)7、14、21 d所獲取毒素濾液與清水對(duì)照相比，均可導(dǎo)致蒜薹薹條細(xì)胞葉綠素下降，且隨著蒜薹灰霉病菌培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，薹條褪綠程度逐漸提高。毒素隨著培養(yǎng)時(shí)間的縮短以及稀釋倍數(shù)的提高，對(duì)蒜薹薹條組織葉綠素的降解能力降低，其中培養(yǎng)21、14、7 d后毒素濾液原液對(duì)蒜薹薹條組織細(xì)胞葉綠素降解率分別為72.83%、59.78%和47.83%，下降顯著；培養(yǎng)21、14、7 d毒素稀釋100倍后，降解率分別為29.35%、27.17%和26.09%，降解無(wú)顯著差異。

表4 蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)蒜薹組織系統(tǒng)損傷的情況

注：蒜薹黃變程度標(biāo)準(zhǔn)為：—，薹條或薹苞無(wú)顯著變化；+，薹條或薹苞部分失綠；++，薹條或薹苞整體失綠；+++，薹條或薹苞組織變黃。

表5 蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)蒜薹薹條組織細(xì)胞葉綠素降解的情況

由毒素濾液對(duì)蒜薹薹苞組織細(xì)胞葉綠素降解試驗(yàn)結(jié)果(表6)可知，PD培養(yǎng)液培養(yǎng)7、14、21 d所獲取毒素濾液與清水對(duì)照相比，均可導(dǎo)致蒜薹薹苞細(xì)胞葉綠素下降，且與對(duì)薹條影響類似，隨著蒜薹灰霉病菌培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，所獲毒素對(duì)薹苞褪綠程度也逐漸提高。毒素隨著培養(yǎng)時(shí)間的縮短以及稀釋倍數(shù)的提高，對(duì)蒜薹薹苞組織葉綠素的降解能力降低，其中培養(yǎng)21、14、7 d后毒素濾液原液對(duì)蒜薹薹苞組織細(xì)胞葉綠素降解率為57.74%、60.18%和40.93%，21 d和14 d之間無(wú)顯著差異，降解率顯著高于7 d的處理；培養(yǎng)21、14、7 d毒素稀釋100倍后，降解率分別為36.95%、30.09%和23.45%，隨著培養(yǎng)時(shí)間的縮短毒素對(duì)薹苞細(xì)胞葉綠素的降解顯著降低。

表6 蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)蒜薹薹苞組織細(xì)胞葉綠素降解的情況

2.2蒜薹灰霉病菌毒素基因的檢測(cè)

以灰葡萄孢霉Botrydial毒素BcBOT2基因6 781～8 807 bp區(qū)段為模板，采用特異性引物(見表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳，其中引物對(duì)BCbot2-F2和BCbot2-R2可獲得較好擴(kuò)增條帶，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，所獲PCR產(chǎn)物長(zhǎng)337 bp，經(jīng)比對(duì)，擴(kuò)增區(qū)段包括灰葡萄孢霉Botrydial毒素BcBOT2基因7 156～7 410 bp區(qū)段序列。

進(jìn)一步以蒜薹灰霉病菌BC-3、蔥鱗葡萄孢霉、鏈格孢、青霉P1、青霉P2、粉紅單端孢、鐮刀菌的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳，由圖1可知，所獲引物可以特異性擴(kuò)增灰葡萄孢霉Botrydial毒素BcBOT2基因。

1：灰葡萄孢霉BC-3；2：蔥鱗葡萄孢霉；3：鏈格孢；4：青霉P1；5：青霉P2；6：粉紅單端孢；7：鐮刀菌；M：DNA Marker

3 討論與結(jié)論

灰葡萄孢霉是引起產(chǎn)后蒜薹灰霉病的重要病原之一，其多為田間侵染于貯藏期危害，造成蒜薹爛梢、爛基和斷條。因此灰葡萄孢霉的早期檢測(cè)，對(duì)于蒜薹灰霉病的早期監(jiān)測(cè)和防控有著重要意義。以毒素BcBOT2基因[10]7 156～7 410 bp區(qū)段序列為模板，以BCbot2-F2和BCbot2-R2為引物，可以特異性地檢測(cè)灰葡萄孢霉Botrydial毒素基因。BcBOT2基因是灰葡萄孢霉Botrydial毒素表達(dá)的重要基因，通過對(duì)BcBOT2的檢測(cè)可有效監(jiān)測(cè)灰葡萄孢霉Botrydial毒素的形成，為由灰葡萄孢霉引起的蒜薹灰霉病提供早期檢測(cè)依據(jù)。

本研究通過蒜薹懸滴接種法、系統(tǒng)侵染法和毒素浸漬法測(cè)定，蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)蒜薹薹條和薹苞組織損傷及蒜薹細(xì)胞葉綠素降解的活性比較，說(shuō)明蒜薹灰霉病菌毒素對(duì)產(chǎn)后蒜薹組織有較強(qiáng)破壞作用，可導(dǎo)致蒜薹薹苞和薹條組織細(xì)胞損傷、葉綠素降解，并可由輸導(dǎo)組織傳導(dǎo)造成蒜薹組織的系統(tǒng)危害。同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，所獲毒素對(duì)蒜薹薹條和薹苞組織的損傷均逐漸加強(qiáng)，且隨著毒素濃度的降低，對(duì)蒜薹組織細(xì)胞損傷顯著下降。經(jīng)驗(yàn)證蒜薹灰霉病菌毒素是導(dǎo)致產(chǎn)后蒜薹灰霉病的重要因素之一。

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PathogenicitytoGarlicScapeandGeneDetectionofToxinfromBotrytiscinerea

Wang Yong1，Zhang Chunxiang1, Gao Wei1, Kong Qingxue2, Yan Ruixiang3, Zhang Na3

(1.TianjinInstituteofPlantProtection,Tianjin300381,China; 2.TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China; 3.NationalEngineeringTechnologyResearchCenterforPreservationofAgriculturalProducts/KeyLaboratoryofStorageofAgri-Products,MinistryofAgriculture,Tianjin300381,China)

To make clear the pathogenicity of toxin fromBotrytiscinereato garlic scape and the detection method to toxin gene, theBotrytiscinereastrain BC-3 with high pathogenicity was selected as target. The bioassay of mycotoxin to tissue damage and cell chlorophyll degradation activity were tested by garlic scape droplet inoculation, systemic infection and toxin dipping. The results showed that the toxin ofBotrytiscinereawas the important pathogenic factor leading to garlic gray mold. The toxin could lead to tissue injury, chlorophyll degradation and garlic conducting tissue damage. At the same time, the specific detection method to toxin geneBcBOT2 was established. The method could be used to the early detection of garlic gray mold caused byBotrytiscinerea.

Botrytiscinerea; Garlic scape; Toxin; Pathogenicity; Toxin gene

S436.33

A

1001-4942(2017)10-0076-05

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.016

2017-02-06

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題“物流蒜薹綠色防腐與安全保鮮技術(shù)綜合示范”(2015BAD16B00)；農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目“灰霉菌毒素對(duì)采后蒜薹的致病機(jī)制及檢測(cè)、控制研究”(20150901)

王勇(1971—)，女，研究員，主要從事植物病害及其生物-生態(tài)防治研究。E-mail：wangyongwb@126.com