劉石雪，唐麗云

（沂蒙老區(qū)酒業(yè)有限公司，山東臨沂276700）

高效液相色譜法測(cè)定白酒中紐甜含量影響因素的探究

劉石雪，唐麗云

（沂蒙老區(qū)酒業(yè)有限公司，山東臨沂276700）

本實(shí)驗(yàn)對(duì)高效液相色譜法測(cè)定白酒中紐甜含量的各個(gè)影響因素進(jìn)行了探究，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件。采用Agilent C18色譜柱(5 μm,150 mm×4.6 mm),流動(dòng)相為乙腈-離子對(duì)試劑緩沖液，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)210 nm，柱溫30℃，流速1 mL/min。結(jié)果表明，紐甜濃度在0.16～25 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，檢出限0.06 μg/mL，加標(biāo)回收率在93.75%～98.13%之間。該方法分離度較好，操作穩(wěn)定，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,適用于白酒中紐甜的檢測(cè)。

高效液相色譜法； 紐甜； 白酒

紐甜是一種新一代的人工合成的二肽類(lèi)強(qiáng)力甜味劑，其化學(xué)名稱(chēng)為N-［N-(3,3-二甲基丁基)-L-α-天門(mén)冬氨酰］-L-苯丙氨酸-1-甲酯，分子式為C20H30N2O5[1-2]。由于具有高甜度、無(wú)齲齒性、高安全性、高穩(wěn)定性、協(xié)同增效性、適用范圍廣、添加方式多樣等優(yōu)點(diǎn)，可以替代蔗糖、阿斯巴甜等甜味劑，并廣泛添加到食品中[3]。例如可以添加到乳制品、谷物食品、糖果、巧克力、鈣片、飲料、烘焙食品、復(fù)合調(diào)味料等食品中。其熱值小、不參與人體代謝過(guò)程，適當(dāng)?shù)奶砑恿靠梢云鸬礁纳瓶诟械淖饔茫粫?huì)引起人的肥胖、高血壓、糖尿病等疾病[4]，因此是一種無(wú)營(yíng)養(yǎng)安全類(lèi)食品添加劑。但依據(jù)國(guó)家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)，紐甜不在白酒(食品分類(lèi)號(hào)15.01.01)允許使用的范圍之內(nèi)，即發(fā)酵酒種中不得添加甜味劑[5-6]。

最新食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.247—2016規(guī)定了食品中紐甜測(cè)定的高效液相色譜法[7]，其前處理過(guò)程包括混合提取液提取、固相萃取柱凈化、氮吹濃縮等步驟，處理過(guò)程較為復(fù)雜，影響因素較多。因此本實(shí)驗(yàn)在國(guó)標(biāo)法基礎(chǔ)上對(duì)白酒中紐甜提取的過(guò)程、液相色譜條件等關(guān)鍵控制點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，為以后測(cè)定白酒中紐甜的含量提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：市售白酒樣。

試劑：乙腈（色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司）；甲酸（色譜純，科密歐）；三乙胺（色譜純，科密歐）；磷酸（分析純，科密歐）；辛烷磺酸鈉（色譜純，科密歐）；紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液（純度≥99.0%）。

儀器設(shè)備：高效液相色譜儀（Agilent1260II型，配有紫外檢測(cè)器）；超聲波清洗儀（朗博儀器制造有限公司）；分析天平（梅特勒·托利多AL104型）；漩渦振蕩器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；DN系列氮吹儀（天津市東康科技有限公司）；HSE系列固相萃取裝置（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 儀器條件

色譜柱：C18色譜柱，5 μm，150 mm×4.6 mm（內(nèi)徑）；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量50 μL；流動(dòng)相A乙腈、B離子對(duì)試劑緩沖液。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1000 g紐甜標(biāo)準(zhǔn)品，加混合提取液溶解定容至100 mL，此溶液紐甜含量為1.00 mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至濃度分別為0.16 μg/mL、0.80 μg/mL、1.60 μg/mL、4.00 μg/mL、8.00 μg/mL、25.00 μg/mL等系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確量取10.0 mL試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入30 mL混合提取液，振蕩混勻。超聲15 min后，用混合提取液定容至刻度。吸取10.0 mL溶液以2 mL/min的流速通過(guò)固相萃取柱；待濾液完全流出后，用5 mL混合提取液以2 mL/min的流速淋洗萃取柱，棄去全部流出液；最后用5 mL甲醇以1 mL/min的流速洗脫。洗脫液在40℃水浴中用氮吹儀濃縮，混合提取液定容至2.0 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后作為待測(cè)液供色譜分析[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的影響

前處理方法的影響對(duì)同一個(gè)酒樣進(jìn)行了3組實(shí)驗(yàn)：第1組，根據(jù)1.4所述處理過(guò)程進(jìn)行酒樣前處理，后用氮吹儀濃縮近干，混合提取液定容至2.0 mL。第2組，根據(jù)1.4所述處理過(guò)程進(jìn)行酒樣前處理，后用氮吹儀濃縮至1.0 mL，混合提取液定容至2.0 mL。第3組，樣品不經(jīng)過(guò)前處理，直接加熱除去乙醇，用水定容至2.0 mL。結(jié)果顯示：第1組、第2組，紐甜分離度好，雜峰較少，回收率較高，并且氮吹濃縮的體積對(duì)結(jié)果定量影響不大，紐甜含量均為0.39 μg/mL。第3組，紐甜分離度不好，雜峰較多，回收率低，紐甜含量為0.08 μg/mL。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

紐甜在206 nm波長(zhǎng)到218 nm波長(zhǎng)間都有吸收峰[9-10]，但是考慮到乙腈在210 nm以下也有較強(qiáng)的吸收峰。因此選擇波長(zhǎng)218 nm、212 nm、210 nm進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可看出，波長(zhǎng)210 nm時(shí)，樣品中紐甜吸收峰最高，最為靈敏。因此選擇210 nm為實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)。

2.3 色譜柱溫度的影響

選取不同柱溫25℃、28℃、30℃、32℃、35℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，色譜柱溫度對(duì)紐甜的保留時(shí)間和色譜峰形影響不大?？紤]到溫度過(guò)低或者過(guò)高不易控制，并且受環(huán)境影響較大，確定本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)柱溫為30℃。

2.4 流動(dòng)相變化的影響

對(duì)乙腈和離子對(duì)試劑緩沖液梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明表1梯度洗脫程序具有較好分離效果，能滿足檢測(cè)要求。

圖1 前處理方法對(duì)酒樣中紐甜含量的影響

圖2 檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)酒樣中紐甜含量的影響

2.5 流速變化的影響

流動(dòng)相流速的高低影響色譜柱的柱效、系統(tǒng)的壓力、各個(gè)組分分離效果和保留時(shí)間。選擇實(shí)驗(yàn)的流速為0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，結(jié)果表明，隨著流速增大，各組分出峰時(shí)間提前，在0.8 mL/min、1.0 mL/min時(shí)，出峰時(shí)間合適，分離度較好。因此確定本實(shí)驗(yàn)流速為1.0 mL/min。

2.6 在優(yōu)化條件下進(jìn)行紐甜測(cè)定實(shí)驗(yàn)

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

分別取0.16 μg/mL、0.80 μg/mL、1.60 μg/mL、4.00 μg/mL、8.00 μg/mL、25.00 μg/mL 的系列紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)作線性回歸，得到如下回歸方程：y=25.879x+0.714，r=0.9999?？梢?jiàn)，紐甜在濃度0.16～25.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（圖3）。

圖3 紐甜的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6.2 檢出限的確定

根據(jù)GB/T 5009.1—2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分總則》[8]中對(duì)檢出限的規(guī)定，把3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量或濃度稱(chēng)為檢出限。色譜法（GC,HPLC）的檢出限為色譜儀最低響應(yīng)值（儀器噪音水平的3倍）/標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程斜率。平均測(cè)定20次，得出本實(shí)驗(yàn)紐甜檢出限為0.06 μg/mL。

2.6.3 樣品加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

選取不含紐甜的空白酒樣，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分別加入一定量紐甜標(biāo)液，使其濃度分別為0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL、3.2 μg/mL、6.4 μg/mL，每個(gè)濃度做3次平行試樣。根據(jù)上述方法進(jìn)行前處理，測(cè)定其紐甜含量。按外標(biāo)法進(jìn)行定量，并計(jì)算其加標(biāo)回收率，具體情況見(jiàn)表2。由表2可以看出，此方法的加標(biāo)回收率在93.75%～98.13%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.82%，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

2.6.4 樣品檢測(cè)結(jié)果

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

從市場(chǎng)上抽取4個(gè)酒樣，按上述優(yōu)化后的處理方法進(jìn)行紐甜檢測(cè)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，1#、2#樣品未檢出，3#樣品為0.33 mg/L，RSD為1.0%。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 標(biāo)樣及3#樣品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的儀器設(shè)備和色譜柱性能，對(duì)GB 5009.247—2016規(guī)定的食品中紐甜測(cè)定的高效液相色譜法[7]進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。確定了新的乙腈、離子對(duì)試劑緩沖液的洗脫梯度、210 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)，獲得了更加準(zhǔn)確的分離度和響應(yīng)值。并對(duì)前處理過(guò)程的關(guān)鍵控制點(diǎn)進(jìn)行把控實(shí)驗(yàn)，確定對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的影響，為以后其他企業(yè)和檢測(cè)機(jī)構(gòu)紐甜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性提供參考依據(jù)。

[1]魯琳,杭義萍,高燕紅.高效液相色譜法快速檢測(cè)乳飲料中常用甜味劑[J].食品科學(xué),2009,30(10)：166-168.

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[7]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中紐甜的測(cè)定：GB 5009.247—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2017.

[8]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生部.食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分總則：GB/T 5009.1—2003[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004.

[9]張暉,薛洪寶,楊俊松,等.HPLC測(cè)定食品中甜味劑的含量[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2013,30(4)：1813-1817.

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茅臺(tái)集團(tuán)“匠中匠”酒博會(huì)簽約3億元

本刊訊：據(jù)《貴州日?qǐng)?bào)》報(bào)道，2017年9月8日,貴州茅臺(tái)集團(tuán)白金酒公司高端醬酒“匠中匠”品牌發(fā)布會(huì)在貴陽(yáng)中天凱悅酒店舉行。中國(guó)酒類(lèi)流通協(xié)會(huì)副秘書(shū)長(zhǎng)、中國(guó)酒業(yè)論壇創(chuàng)始人趙禹,酒仙網(wǎng)董事長(zhǎng)郝鴻峰,貴州省白酒產(chǎn)業(yè)顧問(wèn)權(quán)圖,貴州省煙草學(xué)會(huì)秘書(shū)長(zhǎng)毛學(xué)軍等行業(yè)嘉賓前來(lái)祝賀。

發(fā)布會(huì)上,匠中匠CEO董兵勾勒了“匠中匠”的未來(lái)規(guī)劃,提出要在3年內(nèi),將匠中匠打造成10億元規(guī)模的品牌,成為貴州茅臺(tái)集團(tuán)白金酒公司旗下又一款超級(jí)大單品,成為茅臺(tái)品牌家族的又一顆明星!近200名來(lái)自貴州本地和華東、華中、華北的經(jīng)銷(xiāo)商參加了發(fā)布會(huì),并與“匠中匠”簽署了總額3億元、首款3千萬(wàn)元的經(jīng)銷(xiāo)合同。（江源薦，黃筱鸝編輯）

來(lái)源：貴州日?qǐng)?bào) 2017-09-11

Factors Influencing the Determination of
Neotame Content in Baijiu by HPLC

LIU Shixue and TANG Liyun

(Yimeng Distillery Co.Ltd.,Linyi,Shandong 276700,China)

In this study,the factors influencing the determination of neotame content in Baijiu by HPLC were explored.The column of Agilent C18(5 μm,150 mm×4.6 mm)was adopted,a mobile phase of acetonitrile-ion pair reagent buffer at a flow rate of 1.0 mL/min was used,and column temperature was at 30℃with UV detector wavelength at 210 nm.The results suggested that neotame content in the range of 0.16 μg/mL to 25 μg/mL presented a good linear relation with peak area,the detection limit was 0.06 μg/mL,and the spiked recovery rate was between 93.75%to 98.13%.The method had the advantages including good separation,stable operation,and accurate data,and it was suitable for the determination of neotame content in Baijiu.

HPLC;neotame;Baijiu

TS262.3；TS261.7

A

1001-9286（2017）10-0084-04

10.13746/j.njkj.2017241

2017-09-11

劉石雪，女，碩士研究生，E-mail：zhaoweishan1986@163.com。

唐麗云，女，國(guó)家級(jí)白酒評(píng)委，主要研究方向：白酒產(chǎn)品研發(fā)，E-mail：lytliyun@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-09-14；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170914.1422.003.html。