李國友，陳 翔，米 嬌，楊 勇，楊 濤，周新虎，唐佳林，莊名揚，吳林蔚

（1.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都610041； 2.江蘇洋河酒廠股份有限公司 江蘇宿遷223800）

洋河大曲產(chǎn)核苷功能菌的研究

李國友1，陳 翔2，米 嬌1，楊 勇2，楊 濤1，周新虎2，唐佳林1，莊名揚1，吳林蔚1

（1.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都610041； 2.江蘇洋河酒廠股份有限公司 江蘇宿遷223800）

利用涂布法、劃線法等技術(shù)手段，從洋河成品大曲中分離得到1株代謝產(chǎn)生核苷類健康功能因子的絲狀真菌。利用形態(tài)觀察和分子生物學(xué)相結(jié)合的技術(shù)手段，將核苷代謝功能菌鑒定為橫梗霉。高效液相分析表明，該菌可代謝產(chǎn)生具有重要生理活性的次級代謝產(chǎn)物——腺苷和尿苷。該研究為核苷健康功能菌在中國白酒釀造中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

微生物； 大曲； 絲狀真菌； 橫梗霉； ITS； 核苷

大曲是釀造名優(yōu)白酒及獨特風(fēng)味白酒的基礎(chǔ)之一[1]，在白酒釀造過程中起著重要作用。大曲中的微生物種類多種多樣，且相互作用，功能微生物能夠代謝產(chǎn)生各種結(jié)構(gòu)類型豐富，生物活性顯著的次級代謝產(chǎn)物。因此，大曲不僅是白酒釀造功能微生物群的載體，也是香味及前驅(qū)物質(zhì)的來源，更是白酒健康功能因子的源泉，其對白酒的品質(zhì)具有十分重要的影響[2-3]。前期，我們首次從江蘇洋河酒廠的大曲中分離得到了能產(chǎn)腺苷、尿苷等核苷類活性化合物的絲狀真菌，該類次級代謝產(chǎn)物具有免疫調(diào)節(jié)、改善腦細胞代謝、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)等廣泛的藥理生理活性[4]。腺苷是一種遍布人體細胞且具有重要生理功能的內(nèi)源性物質(zhì)[5]，是人體循環(huán)系統(tǒng)疾病的藥物[6]；在臨床上可直接作為心血管和循環(huán)系統(tǒng)疾病的藥物，能促進冠狀血管擴張[7]和血管生成、增加毛細血管的密度[8-9]，能緩解炎癥，具有抗炎作用[10]，同時也是多種抗病毒藥物合成的中間體；尿苷具有治療肝病和心腦血管疾病的功能。目前核苷類化合物已作為藥品、保健品和食品添加劑得到了廣泛的應(yīng)用。

隨著人們健康意識的增強，飲用健康白酒的理念越來越深入人心，開發(fā)具有良好生理活性的健康型白酒是中國白酒的必然發(fā)展趨勢，因此從大曲中發(fā)現(xiàn)能夠代謝產(chǎn)生健康功能因子的功能菌，并將其應(yīng)用到健康白酒的釀造中，對于促進中國白酒的健康發(fā)展具有十分重要的意義。本實驗采用涂布法、劃線法等傳統(tǒng)微生物分離純化的方法，對洋河大曲中能夠代謝產(chǎn)生核苷健康功能因子的菌進行了分離、篩選和鑒定，獲得了1株能夠產(chǎn)核苷類活性化合物的絲狀真菌，利用形態(tài)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對其進行了鑒定。在此，本文對該菌的分離純化和分子鑒定工作進行報道，該研究為洋河大曲核苷功能菌開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

大曲樣取自江蘇洋河酒廠股份有限公司。

1.1.2 儀器

高效液相色譜（上海伍豐色譜儀），SW-CJ-1FD潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州泰安空氣技術(shù)有限公司），DH-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），PCWJ-20超純水機（成都品成科技有限公司），DL-1萬用電爐（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），BH-2型光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS），TG16-W微量高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)公司），PCR儀（Eppendorf Thermal Cycler），電泳儀（Bio-Rad）。

1.1.3 試劑

真菌平板分離培養(yǎng)基：馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，孟加拉紅33.4 mg，卡那霉素20 mg，瓊脂15 g，純水1000 mL，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮10 g，葡萄糖0.2 g，純水7.5 mL，121℃滅菌30 min。

標品：腺嘌呤核苷，鳥嘌呤核甘，胸腺嘧啶核甘。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種分離

在超凈工作臺中粉碎曲塊，取10 g大曲中心部位樣品加入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，在培養(yǎng)箱中以150 r/min、室溫振蕩30 min。再進行逐級稀釋，取合適稀釋倍數(shù)的菌懸液在真菌分離培養(yǎng)基上進行平板涂布。然后將平板置于溫度為30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過適當?shù)呐囵B(yǎng)時間，選擇菌落形態(tài)有明顯差異的菌株分離、純化和保藏。

1.2.2 菌種篩選

真菌以30℃靜置培養(yǎng)15 d。發(fā)酵完成后，加入100 mL 70%vol乙醇，在60℃條件下水浴4 h，再將提取液過濾，提取2次，合并濾液，減壓濃縮獲得浸膏。所得浸膏各取20 mg，加入1 mL超純水，濾膜過濾，HPLC分析（分析條件：檢測波長258 nm；柱溫30 ℃；流量0.8 mL/min；甲醇/水梯度洗脫：0～30 min，0%～25%）。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 菌種形態(tài)、生化鑒定

真菌菌落形態(tài)鑒定：以無菌操作，分別將經(jīng)融化并冷卻到45℃左右的PDA培養(yǎng)基傾注于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基凝固后即成平板。從菌株斜面上挑取少量孢子點到上述平板適當位置，30℃倒置培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。

真菌顯微形態(tài)觀察：采用濕室載片培養(yǎng)法，在培養(yǎng)皿底部鋪一張略小于皿底的圓濾紙片，再放1個U形玻棒，其上入一塊潔凈載玻片和2塊蓋玻片，蓋上皿蓋，包扎后以121℃滅菌30 min，烘干備用。取已滅菌的PDA培養(yǎng)基6～7 mL注入另一滅菌平皿中，使之凝固成薄層。用解剖針切取0.5～1 cm的瓊脂塊，并將其移至上述培養(yǎng)室中的載玻片上。用尖細的接種針挑取少量孢子接種于瓊脂塊的邊緣上，用無菌鑷子將蓋玻片覆蓋在瓊脂塊上。在平皿的濾紙上加3～5 mL滅菌的20%甘油，蓋上皿蓋，30℃培養(yǎng)。一定培養(yǎng)時間后取出載玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察顯微形態(tài)。

1.2.3.2 菌種分子鑒定

真菌采用ITS[11]序列分析的方法對菌種進行鑒定，真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和IST4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')用于真菌ITS序列的擴增。PCR擴增體系為：模板DNA 2 μL，引物1和引物2各 1 μL，10×PCR 緩沖液 2.5 μL，Hifi酶 0.5 μL，dNTP 2 μL，無菌超純水16 μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4 min后進行32個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸45 s，最后一個循環(huán)72℃延伸10 min，4℃保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選

累積分離得到71株菌，其中細菌31株，真菌40株。通過高效液相（HPLC）技術(shù)對分離菌株發(fā)酵產(chǎn)物進行分析，最終篩選得到1株產(chǎn)核苷類化合物的菌株（圖1和圖2），鑒定為橫梗霉（Lichtheimia ramosaYH2.3.4）。

圖1 標準品HPLC檢測譜圖

圖2 Lichtheimia ramosa YH2.3.4發(fā)酵液HPLC檢測譜圖

2.2 菌種鑒定結(jié)果

2.2.1 菌種形態(tài)鑒定結(jié)果

Lichtheimia ramosaYH2.3.4型態(tài)觀察結(jié)果：菌落生長迅速，初為白色，后為灰白色，反面無色，有假根，孢囊梗由生假根處的匍匐菌絲生出，分枝或不分枝，頂端膨大成中軸基，孢子囊半球形或球形，孢囊孢子多呈球形（圖3）。

圖3 橫梗霉顯微照片

2.2.2 菌種分子鑒定結(jié)果

將擴增過的DNA片段進行測序，測序結(jié)果在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中進行BLASTN同源性比對，根據(jù)相似度鑒定出菌株的種屬，再結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果，將該菌鑒定為橫梗霉（Lichtheimia ramosa）。橫梗霉ITS測序結(jié)果：

5’-CCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGAGGTCTAAAAAACCACTAGTTGGGGGT CTCTTCCCCTCTAGTAGTTCCTCACAGTTTTGT GCAAAGTCGGGTCAACTTGGTTGGCTCTGCCT TGTGCTGTAGATCTGGTTGTTGGCATAGAGACC CTCCTTTTAGGAGACTTGTGCCACTACTAAGAT CTAGGCTGCTTGAAAAGAGACGTATGGACCCT TCTTTCAGGAGACCTATGTCTCGAGTCAAAGC AAGCAAGGCAAGCCTTTGGGGCTCTAGTACTA ACTATCCCCAAAGGTGTTTATTCTTCTCGTGTA AACCATGATGTACGAAAAAGTTAGTTGTTAAC TTAAAAACAACTCTTGGCAATGGATCTCTTGGT TCTCGCATCGATGAAGAGCGTAGCAAAGTGCG ATAATTATTGCGACTTGCATTCATAGCGAATCAT CGAGTTCTCGAACGCATCTTGCGCCTAGTAGT CAATCTACTAGGCACAGTTGTTTCAGTATCTGC AACTACCAATCAGTTCAACTTGGTTCTTTGAAC CTAAGCGAGCTGGAAATGGGCTTGTGTTGATG GCATTCAGTTGCTGTCATGGCCTTAAATACATT TAGTCCTAGGCAATTGGCTTTAGTCATTTGCCG GATGTAGACTCTAGAGTGCCTGAGGAGCAACG ACTTGGTTAGTGAGTTCATAATTCCAAGTCAAT CAGTCTCTTCTTGAACTAGGTCTTAATCTTTAC GGACTAGCGAGAGGATCTAACTTGGGTCTTCT CTTAAACAAACTCATATCTAGATCTGAAATCAA CTGAGATCACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA-3’

3 討論

本實驗首次從洋河成品大曲中分離得到1株可以代謝產(chǎn)生腺苷、尿苷活性成分的功能性微生物，并利用分子生物學(xué)的技術(shù)將其鑒定為橫梗霉。本研究為洋河大曲中核苷活性功能因子的來源提供了依據(jù)，也為洋河大曲核苷功能菌在白酒釀造中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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貴州“黔酒”國家級專家品鑒會在筑舉行

本刊訊：2017年9月7日，由貴州省釀酒工業(yè)協(xié)會、貴州黔酒股份有限公司主辦的“黔酒股份國家級專家品評會”在貴陽舉行。中國白酒著名專家高月明、高景炎，以及著名白酒專家、首屆中國釀酒大師、茅臺原總工程師呂云懷，著名白酒專家、水井坊總工賴登燡，《釀酒科技》雜志總編黃平、貴州大學(xué)明德學(xué)院院長吳天祥，著名白酒專家高軍，四川郎酒股份有限公司總工沈毅，貴州董酒股份有限公司總工李其書、貴州省知名白酒專家方長仲、貴州省質(zhì)檢院部長孟望霓等共11位專家蒞臨會場，會議由黃平總編主持。

貴州黔酒股份有限公司董事長張方利致辭，對各位蒞臨指導(dǎo)的專家及與會來賓表示感謝，并就公司的建立及發(fā)展歷程作了簡介。張方利董事長對此次品鑒會的4個酒樣——“黔酒一號珍品十五”“黔酒一號國標醬香”“黔酒一號天釀藏香”“黔酒一號館藏封壇”進行了介紹。經(jīng)過認真細致的品鑒，各位專家均形成自己的品評意見。其中，高月明老先生發(fā)表感言，評價4款酒大體風(fēng)格一樣，個性有差異，都是比較好的醬香白酒，產(chǎn)品的性價比也合理。專家組經(jīng)過規(guī)范、認真的現(xiàn)場品評，對4款酒給出了評語并發(fā)言，最后形成鑒評綜合意見，如下：

黔酒一號珍品十五：微黃透明，醬香突出，陳香舒適，醇厚協(xié)調(diào)、回味悠長、空杯留香持久、大曲醬香酒風(fēng)格典型。黔酒一號國標醬香：微黃透明，醬香優(yōu)雅，酒體醇厚、回味綿長、空杯留香久、大曲醬香酒風(fēng)格典型。黔酒一號天釀藏香：微黃透明，醬香明顯，香味協(xié)調(diào)、醇和柔順、回味長、空杯留香久、大曲醬香酒風(fēng)格典型。黔酒一號館藏封壇：微黃透明，醬香明顯，醇和協(xié)調(diào)、回味綿長，空杯留香久、大曲醬香酒風(fēng)格典型。品評會結(jié)束時，白酒專家委員會主任委員高景炎老先生做了總結(jié)發(fā)言，各位專家均在品鑒意見上簽字，并與公司主要領(lǐng)導(dǎo)合影留念。（小雨、螢子、曉文）

Study on Nucleoside-Producing Fungus Isolated from Yanghe Daqu

LI Guoyou1,CHEN Xiang2,MI Jiao1,YANG Yong2,YANG Tao1,ZHOU Xinhu2,TANG Jialin1,ZHUANG Mingyang1and WU Linwei1
(1.Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu,Sichuan 610041;2.Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China)

A nucleoside-producing fungus strain was isolated from Yanghe Daqu by using spread plate and streaking.On the basis of morphological and molecular analysis,it was identified asLichtheimia ramosa.HPLC analysis showed thatLichtheimia ramosacould produce adenosine and uridine with diverse bioactivities.This study laid the foundation for the application of nucleoside-producing fungus in Baijiu production.

microbe;Daqu;mycelial fungus;Lichtheimia ramosa;ITS;nucleoside

TS262.3；TQ925.7；TS261.1；Q93-3

A

1001-9286（2017）10-0024-04

10.13746/j.njkj.2017197

2017-07-14

李國友（1977-），男，羌族，理學(xué)博士，主要從事活性天然產(chǎn)物研究工作，E-mail：ligy@cib.ac.cn。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-08-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170817.1428.010.html。