宋軍營，袁 永，王叢笑，張鐘允，宮洪濤，張振強*，劉文弟，高愛社

·論著·

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

六味地黃丸含藥血清對β-淀粉樣蛋白損傷大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞的保護作用研究

宋軍營1，袁 永1，王叢笑2，張鐘允1，宮洪濤3，張振強1*，劉文弟1，高愛社4

目的研究六味地黃丸含藥血清(MSLDP)對β-淀粉樣蛋白(Aβ)25-35損傷大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)的保護作用，探討六味地黃丸在防治阿爾茨海默病(AD)中的作用機制。方法2012年3月—2013年4月選取SPF級雄性SD大鼠20只，按照隨機數(shù)字表法將20只雄性SD大鼠分為對照組、給藥組，每組10只。制備MSLDP及Aβ25-35母液備用。根據(jù)Aβ25-35、MSLDP不同干預濃度將處于對數(shù)生長期PC12細胞分為0、10、20、40 μmol/LAβ25-35組和0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組，另取處于對數(shù)生長期PC12細胞分為正常對照組(不加Aβ25-35和MSLDP)、模型組(加入20 μmol/L Aβ25-35制備AD模型)、MSLDP干預組(加入20% MSLDP+20 μmol/L Aβ25-35)，顯微鏡下觀察0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組及正常對照組、模型組、MSLDP干預組PC12細胞形態(tài)。采用 MTT法檢測PC12細胞存活率，同上分組方法及步驟采用Western blotting法檢測 PC12細胞血管內(nèi)皮生長因子B(VEGF-B)蛋白表達水平。結(jié)果0 μmol/L Aβ25-35組PC12細胞存活率高于10、20、40 μmol/L Aβ25-35組(P<0.05)；10 μmol/L Aβ25-35組PC12細胞存活率高于20、40 μmol/L Aβ25-35組(P<0.05)；20 μmol/L Aβ25-35組PC12細胞存活率高于40 μmol/L Aβ25-35組(P<0.05)。0、10 μmol/L Aβ25-35組VEGF-B蛋白表達水平高于20、40 μmol/L Aβ25-35組(P<0.05)；20 μmol/L Aβ25-35組VEGF-B蛋白表達水平高于40 μmol/L Aβ25-35組(P<0.05)。0%MSLDP組PC12細胞存活率低于2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組(P<0.05)；2.5%MSLDP組PC12細胞存活率低于5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組(P<0.05)；5.0%MSLDP組PC12細胞存活率低于10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組(P<0.05)；10.0%MSLDP組PC12細胞存活率低于20.0%、30.0%MSLDP組(P<0.05)。20.0%MSLDP組PC12細胞存活率低于30.0%MSLDP組(P<0.05)。顯微鏡下示0%MSLDP組PC12細胞形態(tài)規(guī)則，大小均一；2.5%、5.0%MSLDP組PC12細胞數(shù)目增多，形態(tài)正常；10.0%MSLDP組PC12細胞聚集成片狀生長；20.0%、30.0%MSLDP組PC12細胞聚集成片狀生長，邊緣長出小的棘突，具有分化趨勢。0%、2.5%、5.0% MSLDP組VEGF-B蛋白表達水平低于10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組(P<0.05)；10.0%MSLDP 組VEGF-B蛋白表達水平低于20.0%MSLDP組(P<0.05)；20.0%MSLDP組VEGF-B蛋白表達水平高于30.0%MSLDP組(P<0.05)。正常對照組、MSLDP干預組PC12細胞存活率高于模型組(P<0.05)。顯微鏡觀察示正常對照組細胞形態(tài)規(guī)則，大小均一；模型組細胞數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，呈凋亡或死亡的萎縮狀，有細胞碎片；MSLDP干預組細胞數(shù)量明顯增多，部分細胞呈拉伸狀有棘突。正常對照組VEGF-B蛋白表達水平高于模型組和MSLDP干預組(P<0.05)；模型組VEGF-B蛋白表達水平低于MSLDP干預組(P<0.05)。結(jié)論MSLDP可增加 Aβ25-35損傷的 PC12細胞的活性，并對PC12細胞具有保護作用，其機制可能與其可增加VEGF-B蛋白表達水平有關。

阿爾茨海默?。涣兜攸S湯；血管內(nèi)皮生長因子類；淀粉樣β肽類

宋軍營，袁永，王叢笑，等.六味地黃丸含藥血清對β-淀粉樣蛋白損傷大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞的保護作用研究[J].中國全科醫(yī)學，2017，20(30)：3763-3769.[www.chinagp.net]

SONG J Y,YUAN Y,WANG C X,et al.Protective effects of medicated serum of Liuwei dihuang pill on Aβ25-35-injured rat PC12 cells [J].Chinese General Practice，2017，20(30)：3763-3769.

中醫(yī)學認為阿爾茨海默病(AD)的病機為腎精衰枯、髓減腦消、神機失用，所以補腎健腦、養(yǎng)肝益血藥物在 AD 的治療中受到廣泛關注?，F(xiàn)代醫(yī)學認為腦部血管淀粉樣疾病和動脈粥樣硬化均可導致腦微循環(huán)障礙[1]。臨床研究表明，AD患者是大腦微血管疾病的高發(fā)人群[2-4]。因此，微血管功能障礙被認為是AD發(fā)病機制的重要組成之一，但是β-淀粉樣變和微血管功能障礙之間的關系尚不清楚[5]。六味地黃丸是中醫(yī)名方，由熟地黃、山萸肉、淮山藥、茯苓、牡丹皮、澤瀉組成，主要功能為滋陰補腎，其可通過改善微循環(huán)及脂質(zhì)代謝等途徑防治老年病，這可能與其可改善血管內(nèi)皮細胞功能有關。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞功能的主要細胞因子，能夠與內(nèi)皮細胞表面受體酪氨酸激酶結(jié)合促進血管內(nèi)皮細胞生成并參與血管重建。本研究采用β-淀粉樣蛋白(Aβ)25-35損傷大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)模型，以研究六味地黃丸在AD防治中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究時間 2012年3月—2013年4月。

1.2 實驗材料 PC12細胞，由昆明理工大學醫(yī)學部白潔教授贈予。SPF級雄性SD大鼠20只，周齡 12周，平均體質(zhì)量(250±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司〔SCXK(京)2012-0001〕。六味地黃丸濃縮丸(河南省宛西制藥股份有限公司，批號110316)。

1.3 主要試劑及儀器 VEGF-B (美國Epitomics公司)，β-actin(北京中杉金橋生物技術有限公司)，Aβ25-35(美國SIGMA公司)，山羊抗小鼠(北京中杉金橋生物技術有限公司)，MTT(北京索萊寶科技有限公司)，倒置顯微鏡〔尼康映像儀器銷售(中國)有限公司〕，多功能全波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)，高速冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)，蛋白印記檢測系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組 SD大鼠于河南中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心適應性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境：通風，明暗交替各12 h，自由進食、進水。按照隨機數(shù)字表法將20只雄性SD大鼠分為對照組、給藥組，每組10只。

1.4.2 六味地黃丸含藥血清(MSLDP)制備 六味地黃丸濃縮丸溶于純水，給藥組按照1.08 g/kg劑量灌胃，對照組予以等體積蒸餾水灌胃，2次/d，連續(xù)3 d。第4天灌胃后1 h兩組均予以10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血。取全血于室溫下靜置2 h，3 000 r/min離心10 min(離心半徑9.7 cm)，分離血清，56 ℃、30 min滅活，超凈工作臺用0.22 μm濾器過濾滅菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 Aβ25-35配制 用無菌超純水將1 mg Aβ25-35配制成1 000 μmol/L母液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中“老化”5 d，120 μl/管分裝后(避免反復凍融)于-80 ℃保存，使用前稀釋到所需濃度。

1.4.4 MTT法檢測PC12細胞存活率

1.4.4.1 細胞培養(yǎng) 用含10%馬血清、5%胎牛血清、100 U/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細胞。在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，3～4 d傳代1次，實驗均取對數(shù)生長期細胞。

本文創(chuàng)新點：

本文通過采用β-淀粉樣蛋白(Aβ)25-35損傷大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)構(gòu)建阿爾茨海默病(AD)模型，并用補腎類中藥——六味地黃丸干預AD模型，檢測血管內(nèi)皮生長因子B(VEGF-B)蛋白表達水平以探討VEGF-B在AD發(fā)病機制中的作用，為完善六味地黃丸對AD等老年性疾病的防治提供實驗性依據(jù)。

1.4.4.2 MTT法 取對數(shù)生長期的PC12細胞3份(A、B、C)，分別吹打成單細胞懸液，按2.5×104個/孔，200 μl/孔加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將上清液吸出，加入培養(yǎng)基(同1.4.4.1)。A中加入不同濃度Aβ25-35，分為0、10、20、40 μmol/L Aβ25-35組，常規(guī)培養(yǎng)24 h；B中加入不同濃度MSLDP，分為0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組，常規(guī)培養(yǎng)48 h；C分為正常對照組(不加Aβ25-35和MSLDP)、模型組(加入20 μmol/L Aβ25-35制備AD模型)、MSLDP干預組(加入20% MSLDP+20 μmol/L Aβ25-35)，常規(guī)培養(yǎng)24 h；每個濃度設5個平行孔，實驗結(jié)束前4 h，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)；1 500 r/min離心5 min(離心半徑9.7 cm)，吸掉150 μl上清液，分別加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩或反復吹打，直至結(jié)晶紫溶解完全。酶標儀590 nm測吸光度值(OD值)。細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。(注：實驗組指代10、20、40 μmol/L Aβ25-35組，2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組，模型組、MSLDP干預組；對照組指代0 μmol/L Aβ25-35組、0%MSLDP組、正常對照組)。顯微鏡下觀察0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組及正常對照組、模型組、MSLDP干預組PC12細胞形態(tài)。

1.5 Western blotting法檢測VEGF-B蛋白表達水平 取對數(shù)生長期PC12細胞3份(D、E、F)，分別按2×105個/ml的密度接種至35 cm培養(yǎng)皿，細胞貼壁后，D中加入不同濃度Aβ25-35，分為0、10、20、40 μmol/L Aβ25-35組均處理24 h；E中加入不同濃度MSLDP，分為0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0% MSLDP組處理24 h，F(xiàn)分正常對照組、模型組、MSLDP干預組處理細胞24 h。將處理好的細胞用胰酶消化收集，提取總蛋白。使用Bio-Rad公司的蛋白定量試劑盒，應用BCA法檢測蛋白質(zhì)的濃度。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜(轉(zhuǎn)膜電壓為100 V，75 min)。用10%的脫脂奶粉封膜，4 ℃孵育過夜；洗膜，一抗VEGF(1∶1 000)封膜，室溫搖床振蕩1 h；洗膜，二抗羊抗鼠(1∶1 000)，封膜，室溫搖床振蕩1 h；洗膜，加入ECL試劑，反應2～4 min，然后用X線底片曝光。

2 結(jié)果

2.1 Aβ25-35對PC12 細胞存活率的影響 4組PC12細胞存活率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。0 μmol/L Aβ25-35組PC12細胞存活率高于10、20、40 μmol/L Aβ25-35組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；10 μmol/L Aβ25-35組PC12細胞存活率高于20、40 μmol/L Aβ25-35組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；20μmol/L Aβ25-35組PC12細胞存活率高于40 μmol/L Aβ25-35組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

Table1 Effect of different concentrations of Aβ25-35 on the survival rate of PC12 cells

組別PC12細胞存活率(%)0μmol/LAβ25-35組100.00±0.0010μmol/LAβ25-35組81.33±2.49a20μmol/LAβ25-35組73.64±1.07ab40μmol/LAβ25-35組61.29±0.94abcF值384.568P值<0.001

注：Aβ=β-淀粉樣蛋白，PC12細胞=大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞；與0 μmol/L Aβ25-35組比較，aP<0.05；與10 μmol/L Aβ25-35組比較，bP<0.05；與20 μmol/L Aβ25-35比較，cP<0.05

2.2 Aβ25-35對VEGF-B蛋白表達水平的影響 4組VEGF-B蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。0、10 μmol/L Aβ25-35組VEGF-B蛋白表達水平高于20、40 μmol/L Aβ25-35組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；20 μmol/L Aβ25-35組VEGF-B蛋白表達水平40 μmol/L Aβ25-35組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2、圖1)。

2.3 MSLDP對PC12細胞存活率的影響 6組PC12細胞存活率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。0%MSLDP組PC12細胞存活率低于2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2.5%MSLDP組PC12細胞存活率低于5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5.0%MSLDP組PC12細胞存活率低于10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；10.0%MSLDP組PC12細胞存活率低于20.0%、30.0%MSLDP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；20.0%MSLDP組PC12細胞存活率低于30.0%MSLDP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

顯微鏡觀察顯示：0%MSLDP組PC12細胞形態(tài)規(guī)則，大小均一；2.5%、5.0%MSLDP組PC12細胞數(shù)目增多，形態(tài)規(guī)則，大小均一；10.0%MSLDP組PC12細胞數(shù)目增多明顯，細胞聚集成片狀生長，形態(tài)有拉伸趨勢；20.0%、30.0%MSLDP組PC12細胞聚集成片狀生長，形態(tài)拉伸更明顯，并且細胞長出小的棘突，具有分化趨勢及神經(jīng)元特征(見圖2)。

2.4 MSLDP對VEGF-B蛋白表達水平的影響 6組VEGF-B蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。0%、2.5%、5.0% MSLDP組VEGF-B蛋白表達水平低于10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；10.0%MSLDP組VEGF-B蛋白表達水平低于20.0%MSLDP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；20.0%MSLDP組VEGF-B蛋白表達水平高于30.0%MSLDP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表4、圖3)。

Table2 Effect of different concentrations of Aβ25-35 on the protein expression of VEGF-B in PC12 cells

組別VEGF-B0μmol/LAβ25-35組0.67±0.0310μmol/LAβ25-35組0.62±0.0220μmol/LAβ25-35組0.40±0.04ab40μmol/LAβ25-35組0.11±0.01abcF值293.349P值<0.001

注：與0 μmol/L Aβ25-35組比較，aP<0.05；與10 μmol/L Aβ25-35組比較，bP<0.05；與20 μmol/L Aβ25-35組比較，cP<0.05；VEGF-B=血管內(nèi)皮生長因子B

注：VEGF-B=血管內(nèi)皮生長因子B；從左到右依次為0、10、20、40 μmol/L β-淀粉樣蛋白(Aβ25-35)組

圖1 Aβ25-35對VEGF-B蛋白表達水平的影響

Figure1 Effect of different concentrations of Aβ25-35 on the protein expression of VEGF-B

Table3 Effect of MSLDP on the survival rate of PC12 cells in the 6 MSLDPgroups

組別PC12細胞存活率(%)0%MSLDP組100.00±0.002.5%MSLDP組166.50±3.64a5.0%MSLDP組190.90±5.19ab10.0%MSLDP組199.20±5.50abc20.0%MSLDP組241.60±8.62abcd30.0%MSLDP組259.60±7.15abcdeF值2.383P值<0.001

注：與0%MSLDP組比較，aP<0.05；與2.5%MSLDP組比較，bP<0.05；與5.0%MSLDP組比較，cP<0.05；與10.0%MSLDP組比較，dP<0.05；與20.0%MSLDP組比較，eP<0.05

注：A為0%MSLDP組，B為2.5%MSLDP組，C為5.0%MSLDP組，D為10.0%MSLDP組，E為20.0%MSLDP組，F(xiàn)為30.0%MSLDP組；MSLDP=六味地黃丸含藥血清，PC12細胞=大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞

圖2 六味地黃丸含藥血清對PC12細胞形態(tài)的影響(×200)

Figure2 Effect of MSLDP on the cellular morphology of PC12 cells in 6 groups

Table4 Effect of MSLDP on the protein expression of VEGF-B in the 6 groups

組別VEGF-B0%MSLDP組0.31±0.012.5%MSLDP組0.33±0.015.0%MSLDP組0.34±0.0110.0%MSLDP組0.66±0.02abc20.0%MSLDP組0.80±0.01abcd30.0%MSLDP組0.69±0.01abceF值4.488P值0.015

注：與0%MSLDP組比較，aP<0.05；與2.5%MSLDP組比較，bP<0.05；與5.0%MSLDP組比較，cP<0.05；與10.0%MSLDP組比較，dP<0.05；與20.0%MSLDP組比較，eP<0.05

注：從左到右依次為0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0%MSLDP組

圖3 六味地黃丸含藥血清對PC12細胞VEGF-B蛋白表達水平的影響

Figure3 Effect of different concentrations of MSLDP on the protein expression of VEGF-B

2.5 MSLDP對AD模型PC12細胞存活率的影響 3組PC12細胞存活率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。正常對照組、MSLDP干預組PC12細胞存活率高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表5)。鏡下觀察：正常對照組細胞形態(tài)規(guī)則，大小均一；模型組細胞數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，呈凋亡或死亡的萎縮狀，有細胞碎片；MSLDP干預組細胞數(shù)量明顯增多，細胞形態(tài)相對規(guī)則，部分細胞呈拉伸狀有棘突，幾乎沒有碎片(見圖4)。

2.6 MSLDP對AD模型VEGF-B蛋白表達水平的影響 3組VEGF-B蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。正常對照組VEGF-B蛋白表達水平高于模型組和MSLDP干預組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組VEGF-B蛋白表達水平低于MSLDP干預組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表6、圖5)。

表5 MSLDP對AD模型損傷PC12細胞存活率的影響

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

Table6 Effect of MSLDP on the protein expression of VEGF-B in the AD model

組別VEGF-B正常對照組0.51±0.02模型組0.26±0.02aMSLDP干預組0.31±0.01abF值181.341P值<0.001

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

注：A為正常對照組，B為模型組，C為MSLDP干預組

圖4 六味地黃丸含藥血清對AD模型PC12細胞形態(tài)的影響(×200)

Figure4 Effect of MSLDP on the cellular morphology of PC12 cells in the AD model

注：從左到右依次為正常對照組、模型組、MSLDP干預組

圖5 六味地黃丸含藥血清對AD模型VEGF-B蛋白表達水平的影響

Figure5 Effect of MSLDP on the protein expression of VEGF-B in the AD model

3 討論

AD在中醫(yī)學屬“呆病”“健忘”“虛勞”“郁癥”等范疇，將衰老的成因歸結(jié)于虛，病位在腎，即AD的發(fā)生與腎虛關系密切。老年人因耗精過度或虛勞內(nèi)傷，久病氣衰致五臟虧損或失于情志、陰精暗耗皆可致腎精虧損、髓少腦空、元神不得守位，而致神明錯亂，精髓逐漸枯萎，遂成呆病，并可呈進行性加劇[6]。腎為先天之本，藏精、生髓、通腦，與腦髓的關系密切，補腎益精填髓為中醫(yī)治療AD的重要方法。六味地黃丸是中醫(yī)名方，始見于宋·錢乙的《小兒藥證直訣》，組方為熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮，以8∶4∶4∶3∶3∶3比例配伍，補藥量重于瀉藥量，以滋補為主。研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸能夠改善AD患者的記憶、智力和精神行為[7]；還有研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸具有抗氧化應激和炎癥作用，能夠改善小鼠腦部的記憶細胞和認知功能[8-11]。目前，血管因素對AD發(fā)病機制的作用受到越來越多的關注。AD患者腦組織VEGF水平低于正常人，VEGF水平降低可致AD患者腦微血管密度降低、神經(jīng)元保護功能下降以及大腦微血管調(diào)節(jié)、血管新生、營養(yǎng)因子滲透等發(fā)生改變，加重大腦缺氧[12]。此外，AD患者血清VEGF水平低于正常對照組，而且與AD病情嚴重程度存在相關性，即VEGF水平越低，AD神經(jīng)變性病理過程發(fā)展越快[13]。Aβ蛋白是老年斑的主要成分，在AD的病理和發(fā)展中起決定性作用，其可激活膠質(zhì)細胞釋放炎性因子；同時，在體內(nèi)炎性修復機制的作用下，將由Aβ產(chǎn)生的炎性反應轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝仔該p傷，導致神經(jīng)元發(fā)生緩慢的、階段性的凋亡、變性及壞死[14]。有研究發(fā)現(xiàn)VEGF能夠恢復Aβ引起的血管損傷[15]。本研究將Aβ25-35作用于PC12細胞，觀察其對PC12細胞的影響，構(gòu)建AD模型，并研究六味地黃丸對AD模型中VEGF-B蛋白表達水平的影響，尋找中醫(yī)防治AD的分子機制。

本研究結(jié)果顯示，隨Aβ25-35濃度的增加，PC12細胞存活率降低；而PC12細胞存活率隨MSLDP濃度的增加而增加，說明六味地黃丸能夠促進PC12細胞增殖。顯微鏡觀察PC12細胞形態(tài)示：隨著Aβ25-35濃度增高，PC12細胞數(shù)目減少并有少許凋亡，細胞膜完整性降低，細胞質(zhì)內(nèi)空泡增多，視野背景細胞碎片增多，漂浮凋亡細胞逐漸增多。經(jīng)MSLDP干預后PC12細胞存活率明顯增加，說明 MSLDP可促進PC12細胞增殖。顯微鏡下觀察PC12細胞形態(tài)：隨著MSLDP濃度增高，PC12細胞數(shù)目增多，細胞聚集成片，形態(tài)逐漸拉伸，20.0%、30.0%MSLDP組PC12細胞長出小棘突，有明顯分化趨勢，表明 MSLDP在一定濃度下有促PC12細胞增殖作用，而且可能對神經(jīng)元具有保護作用。

研究報道，VEGF誘導血管生成改善了轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型的記憶障礙，其還能通過改善血管生存狀況恢復AD小鼠的記憶，這說明VEGF在AD神經(jīng)退行性病變和血管功能障礙中有重要作用[15-16]。本研究結(jié)果顯示，VEGF-B蛋白表達水平隨著Aβ25-35濃度增加依次降低，而隨著 MSLDP濃度增加依次增加，并且六味地黃丸能夠上調(diào)Aβ25-35損傷后PC12細胞的VEGF-B蛋白表達水平，這些暗示了VEGF-B在AD病理過程中發(fā)揮重要作用。

模型組PC12細胞存活率明顯降低，細胞形態(tài)顯示細胞數(shù)量明顯減少，細胞形態(tài)改變，有少許碎片，加入MSLDP后細胞數(shù)量明顯增多，細胞形態(tài)恢復正常狀態(tài)，幾乎沒有碎片，這些均表明六味地黃丸對Aβ25-35 損傷的PC12細胞有一定的保護作用，并且可能通過調(diào)節(jié)VEGF-B蛋白表達水平對AD的防治發(fā)揮重要作用；提示補腎類中藥-六味地黃丸防治AD的分子機制之一是通過上調(diào)VEGF表達而發(fā)揮作用的，但其具體調(diào)節(jié)信號通路及其機制尚未完全明確，還需進行深入研究。

綜上所述，MSLDP可增加 Aβ25-35損傷的 PC12細胞的活性，并對PC12細胞具有保護作用，其機制可能與其可增加VEGF-B蛋白表達水平有關。

作者貢獻：宋軍營、袁永、王叢笑進行實驗實施、數(shù)據(jù)收集及處理；張鐘允、高愛社進行資料收集整理及對實驗評估；宋軍營撰寫論文；宮洪濤、張振強進行實驗設計和指導并對文章負責；劉文弟負責審校。

本文無利益沖突。

本文不足：

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)信號通路有密切聯(lián)系，但本文沒有深入研究六味地黃丸對PI3K/AKT信號通路中VEGF表達的影響，后續(xù)實驗會補充這方面的內(nèi)容，開拓中醫(yī)藥疾病治療的新靶點。

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ProtectiveEffectsofMedicatedSerumofLiuweiDihuangPillonAβ25-35-injuredRatPC12Cells

SONGJun-ying1,YUANYong1,WANGCong-xiao2,ZHANGZhong-yun1,GONGHong-tao3,ZHANGZhen-qiang1*,LIUWen-di1,GAOAi-she4

1.ImmunologyLaboratoryofChineseMedicine,HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046,China2.TheThirdAffiliatedHospitalofHenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450008,China3.TheFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTCM,Zhengzhou450000,China4.SchoolofBasicMedicalSciences,HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046,China

ObjectiveTo explore the effects and mechanisms of Liuwei dihuang pill(LDP) in the prevention and treatment of alzheimer disease (AD) by studying the protective effects of medicated serum of Liuwei Dihuang Pill (MSLDP) on rat adrenal pheochromocytoma cells (PC12) injured by amyloid-beta peptide 25-35(Aβ25-35).MethodsThis study was conducted from March 2012 to April 2013.Twenty SPF grade SD male rats were selected and divided into the control group and the drug group according to the random number table,10 for each group.MSLDP and Aβ25-35 were prepared.According to the intervention concentration of Aβ25-35 and MSLDP,PC12 cells in logarithmic growth phase were taken and divided into 0,10,20,40 μmol/L Aβ25-35 group and 0%,2.5%,5.0%,10.0%,20.0%,30.0% MSLDP group.Then we took other PC12 cells in logarithmic growth phaseand divided into the normal control group (without the intervention of Aβ25-35 and MSLDP),model group (receiving intervention of 20 μmol/L Aβ25-35 for the preparation of AD model),and MSLDP intervention group (receiving intervention of 20% MSLDP + 20 μmol/L Aβ25-35).The survival rate of PC12 cells in all the groups was detected by MTT.Then we took other PC12 cells in logarithmic growth phase and obtained the same groups by using the above grouping methods and steps.The morphology of PC12 cells in all MSLDP groups,normal control group,model group and MSLDP intervention group were observed under the microscope.The express ion level of vascular endothelial growth factor B (VEGF-B) in PC12 cells in these groups was detected by western blotting.ResultsThe survival rate of PC12 cells in 0 μmol/L Aβ25-35 group was higher than that in the other three Aβ25-35 treated groups(P<0.05);the survival rate of PC12 cells in 10 μmol/L Aβ25-35 group was higher than that of 20,40 μmol/L Aβ25-35 group(P<0.05);the survival rate of PC12 cells in 20 μmol/L Aβ25-35 group was higher than that of 40 μmol/L Aβ25-35 group(P<0.05).The protein expression of VEGF-B was higher in 0,10 μmol/L Aβ25-35 group than in the 20,40 μmol/L Aβ25-35 group(P<0.05),and it was higher in the 20 μmol/L Aβ25-35 group than in the 40 μmol/L Aβ25-35 group(P<0.05).The survival rate of PC12 cells was lower in the 0% MSLDP group than that in other MSLDP groups (P<0.05);the survival rate of PC12 cells in the 2.5% MSLDP group was lower than that of the 5.0%,10.0%,20.0%,30.0% MSLDP group(P<0.05);the survival rate of PC12 cells in the 5.0% MSLDP group was lower than that of 10.0%,20.0%,30.0% MSLDP group(P<0.05);the survival rate of PC12 cells in the 10.0% MSLDP group was lower than that of the 20.0%,30.0% MSLDP group(P<0.05)；the survival rate of PC12 cells in the 20.0% MSLDP group was lower than that of the 30.0% MSLDP group(P<0.05).Microscope observation showed that,the PC12 cells in the 0% MSLDP group were regular in shape and uniform in size;the PC12 cells in 2.5%,5.0% MSLDP group were increased but with normal shape;PC12 cells in 10.0%,20.0%,30.0% MSLDP group displayed aggregated and lamellar growth with small protrusions on the edge and differentiated trend.The protein expression of VEGF-B was lower in 0%,2.5%,5.0% MSLDP group than that in 10.0%,20.0%,30.0% MSLDP group(P<0.05),and it was lower in the 10.0% MSLDP group than in 20.0% MSLDP group(P<0.05),but it was higher in the 20.0% MSLDP group than in the 30.0% MSLDP group(P<0.05).The survival rate of PC12 cells was higher in the normal control group and MSLDP intervention group than that in the model group(P<0.05).Microscope observation demonstrated that,the PC12 cells in the normal control group were regular in shape and uniform in size;the PC12 cells in the model group were reduced and irregular,presenting cellular atrophy or death as well as cellular debris;the PC12 cells in MSLDP intervention group were significantly increased,and part of them were stretched with protrusions.The protein expression of VEGF-B in normal control group was higher than that in the model group and MSLDP intervention group(P<0.05);the protein expression of VEGF-B in model group was lower than that of MSLDP intervention group(P<0.05).ConclusionMSLDP can increase theactivity of the Aβ25-35-injured PC12 cells and protect them,the mechanism might be related to the increase of the protein expression of VEGF-B.

Alzheimer disease;Liuwei dihuang decoction;Vascular endothelial growth factors;Amyloid beta-peptides

R 745.7

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.00.067

2017-05-10；

2017-08-24)

(本文編輯：崔莎)

國家自然科學基金聯(lián)合基金項目(U1504829)；河南省基礎與前沿科學研究項目(14230041023,162300410127)；河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計劃(13HASTIT027)；河南省科技攻關項目(16102310182)

1.450046河南省鄭州市，河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥免疫學實驗室 2.450008河南省鄭州市，河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 3.450000河南省鄭州市，河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 4.450046河南省鄭州市，河南中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院

*通信作者：張振強，教授；E-mail:zhang_zhenqiang@126.com

*Correspondingauthor:ZHANGZhen-qiang,Professor;E-mail:zhang_zhenqiang@126.com