馬俊驥，郭 平，郭 昱，吳江華

·論著·

血漿miR-92a-3p和miR-204-5p及miR-186-5p診斷膽管癌的價值研究

馬俊驥*，郭 平，郭 昱，吳江華

背景膽管癌(CCA)起源于膽管上皮細胞，起病隱匿，惡性度極高。循環(huán)血中微小RNA(miRNA)在CCA診斷中的價值尚待研究。目的探討血漿miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p診斷CCA的價值，以期提高CCA的診斷水平。方法選取2015年5月—2016年1月河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院符合納入標準的CCA患者16例為病例組。同期選取本院無肝膽疾病患者15例為對照組。制備兩組患者血漿標本，采用RT-qPCR法檢測血漿miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p表達水平。采用二元Logistic回歸分析計算miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p聯(lián)合的Logistic回歸方程；繪制miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p及其聯(lián)合診斷CCA的受試者工作特征曲線(ROC曲線)，計算ROC曲線下面積(AUC)、靈敏度、特異度、約登指數(shù)。結(jié)果病例組miR-92a-3p表達水平高于對照組，miR-204-5p、miR-186-5p表達水平低于對照組(P<0.05)。miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p診斷CCA的AUC分別為0.708〔95%CI(0.524，0.892)〕、0.725〔95%CI(0.535，0.915)〕、0.750〔95%CI(0.576，0.924)〕，截斷值分別為0.130 8、0.008 5、0.005 2，靈敏度分別為0.938、0.563、0.563，特異度分別為0.467、0.933、0.933，約登指數(shù)分別為0.405、0.496、0.496。二元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，Logit(P)=-0.031+9.167×miR-92a-3p-49.453×miR-186-5p -66.771×miR-204-5p，其診斷CCA的AUC為0.879〔95%CI(0.749，1.010)〕，截斷值為0.095 8，靈敏度、特異度、約登指數(shù)分別為0.938、0.800、0.738。miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p聯(lián)合診斷CCA的AUC大于miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p單獨診斷CCA的AUC(P<0.05)。結(jié)論miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p可以用于CCA的診斷，且其聯(lián)合診斷CCA的價值更高。

膽管腫瘤；診斷；血漿；腫瘤標記,生物學；微小RNA

馬俊驥,郭平,郭昱,等.血漿miR-92a-3p和miR-204-5p及miR-186-5p診斷膽管癌的價值研究[J].中國全科醫(yī)學，2017，20(30)：3736-3739.[www.chinagp.net]

MA J J,GUO P,GUO Y,et al.Value of plasma miR-92a-3p,miR-204-5p and miR-186-5p in the diagnosis of cholangiocarcinoma[J].Chinese General Practice，2017，20(30)：3736-3739.

膽管癌(CCA)是一種由膽管上皮細胞分化而來的惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤發(fā)生率的3%[1]。常用于CCA診斷的非侵入性檢查主要有磁共振胰膽管造影(MRCP)和糖蛋白抗原19-9(CA19-9)。但MRCP對遠端膽管顯示不佳，可能會忽視膽管內(nèi)的小充盈缺損，或?qū)⒛懝軆?nèi)的空氣、腫瘤誤認為結(jié)石，導致正確率降低[2]；而CA19-9的特異度、靈敏度較差，且在膽管結(jié)石所致的膽管炎、消化道其他腫瘤如胃癌患者中CA19-9表達水平也升高[3-4]。故尋找新的CCA分子生物學標志物具有一定的臨床指導價值。

微小RNA(miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸大小的非編碼單鏈RNA。如果能在外周血循環(huán)中檢測出腫瘤特異性表達的miRNA，對于腫瘤的早期診斷意義重大。本研究探討血漿miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p診斷CCA的價值，以期提高CCA的診斷水平。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年5月—2016年1月河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院符合納入標準的CCA患者16例為病例組。納入標準：(1)年齡18～90歲；(2)根據(jù)臨床癥狀及影像學檢查結(jié)果等初步診斷為CCA，術(shù)后病理由資深病理科專家確診為CCA；(3)尚未行手術(shù)、放療、化療。排除標準：合并其他部位的原發(fā)性惡性腫瘤。同期選取本院符合納入標準的無肝膽疾病患者15例為對照組。納入標準：腹部CT未發(fā)現(xiàn)急性化膿性膽管炎、膽總管結(jié)石、膽總管囊腫等肝膽系統(tǒng)病變。排除標準：合并其他部位的原發(fā)性惡性腫瘤、急性感染性疾病、自身免疫性疾病、藥物性肝炎和酒精肝所致的血清膽紅素升高。本研究已獲河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院倫理委員會批準(編號2013028)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 收集一般資料 收集兩組患者性別、年齡。

1.2.2 制備血漿標本 采集患者靜脈血2 ml置于經(jīng)乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2K)處理的抗凝管中，抗凝處理后分裝到2 ml無酶離心管中，4 ℃條件下1 600×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個新的2 ml無酶離心管中，4 ℃條件下16 000×g再次離心10 min，吸取上層血漿轉(zhuǎn)移到新的2 ml無酶離心管中，即為處理好的血漿標本，于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩６坞x心后即可將血漿中的細胞碎片等物質(zhì)除去，離心過程中使用的移液器和離心管均不含DNA酶和RNA酶，標本處理均在離體3 h內(nèi)完成。

1.2.3 RT-qPCR法檢測血漿miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p表達水平 應(yīng)用RNA試劑盒提取血漿總RNA(含小分子RNA)，應(yīng)用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將提取的總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用miRNA SYBR Green試劑盒和美國ABI公司的Step One PlusTMqPCR系統(tǒng)進行qPCR反應(yīng)，引物序列見表1；PCR反應(yīng)條件：每個循環(huán)包括94 ℃變性20 s，60 ℃退火、延伸34 s，共45個循環(huán)。使用比較閾值法對RT-qPCR數(shù)據(jù)結(jié)果進行定量分析，采用2-ΔΔCt法進行統(tǒng)計分析，其中Ct是熱循環(huán)反應(yīng)中熒光強度達到熒光閾值的循環(huán)數(shù)，每個樣品目的基因的Ct用加入的外參基因線蟲cel-miR-39來標化，從而校正加入的RNA量，ΔCt目的基因=Ct目的基因-Ctcel-miR-39，分別獲得兩組每個標本的ΔCt值，2-ΔΔCt表示目的基因相對表達水平，即miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p表達水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 病例組中，男13例，女3例；年齡46～88歲，平均年齡(64.8±10.0)歲。對照組中，男11例，女4例；年齡51～77歲，平均年齡(61.6±9.2)歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.685；t=0.925，P=0.362)。

2.2 兩組患者miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p表達水平比較 病例組miR-92a-3p表達水平高于對照組，miR-204-5p、miR-186-5p表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

表1 PCR引物序列

表2 兩組患者miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p表達水平比較〔M(QR)〕

Table2 Comparison of the expressions of miR-92a-3p,miR-204-5p and miR-186-5p between the two groups

組別例數(shù)miR-92a-3pmiR-204-5pmiR-186-5p對照組150.0654(0.1465)0.0102(0.0188)0.0066(0.0067)病例組160.1809(0.3589)0.0028(0.0095)0.0026(0.0062)u值66.00060.00066.000P值0.0330.0180.033

2.3 miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p及其聯(lián)合診斷CCA的價值 miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p診斷CCA的AUC分別為0.708〔95%CI(0.524，0.892)，P=0.048〕、0.725〔95%CI(0.535，0.915)，P=0.033〕、0.750〔95%CI(0.576，0.924)，P=0.018〕，截斷值分別為0.130 8、0.008 5、0.005 2，靈敏度分別為0.938、0.563、0.563，特異度分別為0.467、0.933、0.933，約登指數(shù)分別為0.405、0.496、0.496(見圖1)。

以CCA為因變量(賦值：是=1，否=0)，miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p為自變量(連續(xù)型變量)，進行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，Logit(P)=-0.031+9.167×miR-92a-3p-49.453×miR-186-5p-66.771×miR-204-5p，其診斷CCA的AUC為0.879〔95%CI(0.749，1.010)，P<0.001〕，截斷值為0.095 8，靈敏度、特異度、約登指數(shù)分別為0.938、0.800、0.738(見圖1)。

miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p聯(lián)合診斷CCA的AUC大于miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p單獨診斷CCA的AUC，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.994、4.991、4.987，P=0.025、0.025、0.026)。

圖1 miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p及其聯(lián)合診斷CCA的ROC曲線

Figure1 ROC curves of miR-92a-3p,miR-204-5p,miR-186-5p and their combined diagnosis for CCA

3 討論

CCA起病隱匿，在疾病出現(xiàn)癥狀時一般已到中晚期，預后不佳[5]。外周血標志物檢測具有無創(chuàng)性、簡便易行、結(jié)果穩(wěn)定、易于重復、可以動態(tài)觀察病情變化等諸多優(yōu)點，并且外周血腫瘤標志物有助于癌癥的篩查、早期診斷、治療指導和預后判斷，故而一直是研究熱點。大量數(shù)據(jù)表明，多種腫瘤如胃癌、肝癌、非小細胞肺癌等患者外周血中miRNA表達譜與健康對照患者不同，且其表達具有組織特異性[6-8]。但是有關(guān)CCA患者循環(huán)血中miRNA表達的報道較少。因此，本研究重點探討血漿miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p在CCA診斷中的價值。

miR-92a-3p是miR-17-92家族成員之一，在胃癌患者血漿中表達升高，其與轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)，可以調(diào)節(jié)細胞的增殖與凋亡[9]。本研究結(jié)果顯示，病例組miR-92a-3p表達水平高于對照組，說明血漿miR-92a-3p表達水平升高可能與CCA的發(fā)生有關(guān)。

miR-204表達水平降低與腫瘤發(fā)生有關(guān)，且其診斷非小細胞肺癌和子宮內(nèi)膜癌的效果均優(yōu)于目前現(xiàn)有的腫瘤標志物[10-11]。本研究結(jié)果顯示，病例組miR-204-5p表達水平低于對照組，與QIU等[12]研究的miR-204在CCA組織中表達水平降低的結(jié)果一致。

有研究顯示，頸部磷癌患者miR-186表達水平升高，miR-186診斷頸部磷癌的靈敏度和特異度較高，說明miR-186可以作為診斷頸部鱗癌的標志物，且其還可以用于評估治療效果[13]。本研究結(jié)果顯示，病例組miR-186-5p表達水平低于對照組，說明CCA患者和頸部鱗癌患者血漿miR-186-5p表達水平不同，原因可能與其作用機制不同有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p診斷CCA的AUC分別為0.708、0.725、0.750，截斷值分別為0.130 8、0.008 5、0.005 2，靈敏度分別為0.938、0.563、0.563，特異度分別為0.467、0.933、0.933，約登指數(shù)分別為0.405、0.496、0.496；miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p聯(lián)合診斷CCA的AUC為0.879，截斷值為0.095 8，靈敏度、特異度、約登指數(shù)分別為0.938、0.800、0.738；miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p聯(lián)合診斷CCA的AUC大于miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p單獨診斷CCA的AUC；說明單一的miRNA診斷CCA的效果欠佳，聯(lián)合診斷價值較高。

本研究尚需要結(jié)合患者臨床分期，對患者進行密切隨訪，以了解血漿miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p在評估治療效果和判斷患者預后方面的應(yīng)用價值。

綜上所述，miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p可以用于CCA的診斷，且其聯(lián)合診斷CCA的價值更高。但由于本研究樣本量較小，尚需要進一步擴大樣本量進行驗證。

作者貢獻：馬俊驥、郭昱進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，負責文章的質(zhì)量控制及審校；馬俊驥、郭平進行研究的實施與可行性分析，數(shù)據(jù)收集、整理和統(tǒng)計學處理；馬俊驥、郭平、郭昱、吳江華進行結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文；郭昱進行論文的修訂；馬俊驥進行英文的修訂，并對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

[1]RIZVI S,GORES G J.Pathogenesis,diagnosis,and management of cholangiocarcinoma[J].Gastroenterology,2013,145(6):1215-1229.DOI:10.1053/j.gastro.2013.10.013.

[2]唐俊軍,黃宗良,鄭少強,等.MRCP聯(lián)合CA19-9檢測對外科梗阻性黃疸診斷價值的探討[J].外科研究與新技術(shù),2013,2(1):36-40.

[3]INCE A T,YILDIZ K,BAYSAL B,et al.Roles of serum and biliary CEA,CA19-9,VEGFR3,and TAC in differentiating between malignant and benign biliary obstructions[J].Turk J Gastroenterol,2014,25(2):162-169.DOI:10.5152/tjg.2014.6056.

[5]MA J,SHI J,ZHAO D,et al.Raf kinase inhibitor protein inhibits cholangiocarcinoma cell metastasis by downregulating matrix metalloproteinase 9 and upregulating tissue inhibitor of metalloproteinase 4 expression[J].Oncol Lett,2015,9(1):15-24.DOI:10.3892/ol.2014.2637.

[6]RIQUELME I,TAPIA O,LEAL P,et al.miR-101-2,miR-125b-2 and miR-451a act as potential tumor suppressors in gastric cancer through regulation of the PI3K/AKT/mTOR pathway[J].Cell Oncol(Dordr),2016,39(1):23-33.DOI:10.1007/s13402-015-0247-3.

[7]JIANG L,CHENG Q,ZHANG B H,et al.Circulating microRNAs as biomarkers in hepatocellular carcinoma screening:a validation set from China[J].Medicine(Baltimore),2015,94(10):e603.DOI:10.1097/MD.0000000000000603.

[8]SUN L,CHEN Y,SU Q,et al.Increased plasma miRNA-30a as a biomarker for non-small cell lung cancer[J].Med Sci Monit,2016,22:647-655.

[9]ZHU C,REN C,HAN J,et al.A five-microRNA panel in plasma was identified as potential biomarker for early detection of gastric cancer[J].Br J Cancer,2014,110(9):2291-2299.DOI:10.1038/bjc.2014.119.

[10]GUO W,ZHANG Y,ZHANG Y,et al.Decreased expression of miR-204 in plasma is associated with a poor prognosis in patients with non-small cell lung cancer[J].Int J Mol Med,2015,36(6):1720-1726.DOI:10.3892/ijmm.2015.2388.

[11]JIA W,WU Y,ZHANG Q,et al.Identification of four serum microRNAs from a genome-wide serum microRNA expression profile as potential non-invasive biomarkers for endometrioid endometrial cancer[J].Oncol Lett,2013,6(1):261-267.DOI:10.3892/ol.2013.1338.

[12]QIU Y H,WEI Y P,SHEN N J,et al.miR-204 inhibits epithelial to mesen- chymal transition by targeting slug in intrahepatic cholangiocarcinoma cells[J].Cell Physiol Biochem,2013,32(5):1331-1341.DOI:10.1159/000354531.

[13]SUMMERER I,UNGER K,BRASELMANN H,et al.Circulating microRNAs as prognostic therapy biomarkers in head and neck cancer patients[J].Br J Cancer,2015,113(1):76-82.DOI:10.1038/bjc.2015.111.

ValueofPlasmamiR-92a-3p,miR-204-5pandmiR-186-5pintheDiagnosisofCholangiocarcinoma

MAJun-ji*,GUOPing,GUOYu,WUJiang-hua

DepartmentofGastroenterology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity;HebeiKeyLaboratoryofGastroenterology;HebeiInstituteofGastroenterology,Shijiazhuang050000,China

*Correspondingauthor:MAJun-ji,Associateprofessor,Associatechiefphysician;E-mail:majunji2006@163.com

BackgroundCholangiocarcinoma(CCA) originates from bile duct epithelial cells.It is occult and highly malignant.The value of circulating miRNA in the diagnosis of CCA remains to be studied.ObjectiveTo evaluate the diagnostic value of plasma miR-92a-3p,miR-204-5p and miR-186-5p for CCA,in order to improve the diagnostic level of CAA.MethodsSixteen patients with CCA who met the inclusion criteria and

treatment in the Second Hospital of Hebei Medical University from May 2015 to January 2016 were included in the case group,and other eligible 15 patients without liver and gallbladder diseases treated in the same hospital during the same period were selected as the control group.Reverse transcription-quantitative polymerase chain rection(RT-qPCR) was used to detect the expressions of miR-92a-3p,miR-204-5p and miR-186-5p from plasma samples of all the patients.The Logistic regression equation of miR-92a-3p,miR-204-5p and miR-186-5p was calculated by binary Logistic analysis.Receiver operating characteristic(ROC) curve was drawn to test the diagnostic value of miR-92a-3p,miR-204-5p,miR-186-5p and their combined diagnosis in patients with CCA.The area under the ROC curve(AUC),sensitivity,specificity,and Youden′s index were calculated.ResultsThe miR-92a-3p expression in the case group was higher than that in the control group(P<0.05).However,the expressions of miR-204-5p and miR-186-5p were found to be lower in the case group(P<0.05).The AUC of miR-92a-3p,miR-204-5p and miR-186-5p for CCA diagnosis was 0.708〔95%CI(0.524,0.892)〕,0.725〔95%CI(0.535,0.915)〕,0.750〔95%CI(0.576,0.924)〕,respectively.The cutoff value of miR-92a-3p,miR-204-5p and miR-186-5p for CCA diagnosis was 0.130 8,0.008 5,0.005 2,respectively.The sensitivity of miR-92a-3p,miR-204-5p and miR-186-5p for CCA diagnosis was 0.938,0.563,0.563,respectively.The specificity of miR-92a-3p,miR-204-5p and miR-186-5p for CCA diagnosis was 0.467,0.933,0.933 respectively.The Youden′s index of miR-92a-3p,miR-204-5p and miR-186-5p for CCA diagnosis was 0.405,0.496,0.496 respectively.Binary Logistic analysis showed that Logit(P)=-0.031+9.167×miR-92a-3p-49.453×miR-186-5p-66.771×miR-204-5p,the AUC for CCA diagnosis was 0.879〔95%CI(0.749,1.010)〕,and the cutoff value,sensitivity,specificity and Youden′s index were 0.095 8,0.938,0.800,and 0.738 respectively.The AUC of miR-92a-3p,miR-204-5p and miR-186-5p for combined diagnosis of CCA was larger than that of miR-92a-3p,miR-204-5p and miR-186-5p for CCA diagnosis alone(P<0.05).ConclusionmiR-92a-3p,miR-204-5p,and miR-186-5p can be used for the diagnosis of CCA,and their combined diagnosis of CCA is of higher value.

Bile duct neoplasms；Diagnosis；Plasma；Tumor markers,biological；MicroRNA

R 735.8

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.00.087

2017-03-12；

2017-08-30)

(本文編輯：崔麗紅)

河北省科技計劃項目(14277757D)050000 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院消化內(nèi)科 河北省消化病實驗室 河北省消化病研究所

*通信作者：馬俊驥，副教授，副主任醫(yī)師；E-mail：majunji2006@163.com