于偉偉，喬軍，孟慶玲,，彭葉龍，張金生，王輝勝，才學(xué)鵬，陳創(chuàng)夫

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046；3.新疆沙灣縣畜牧獸醫(yī)站，沙灣 832100；4.新疆沙灣縣烏蘭烏蘇鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，沙灣 832100; 5.阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心，阿克蘇 843000）

奶牛乳房炎大腸桿菌新疆分離株系統(tǒng)分群及其耐藥特性與毒力因子分布研究

于偉偉1，喬軍1，孟慶玲1,2，彭葉龍5，張金生3，王輝勝4，才學(xué)鵬2，陳創(chuàng)夫1

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046；3.新疆沙灣縣畜牧獸醫(yī)站，沙灣 832100；4.新疆沙灣縣烏蘭烏蘇鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，沙灣 832100; 5.阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心，阿克蘇 843000）

本研究利用PCR技術(shù)對奶牛乳房炎大腸桿菌新疆臨床分離株進(jìn)行種系分群、耐藥基因和毒力基因檢測，并測定大腸桿菌對16種抗菌藥物的敏感性。從1 068份奶牛乳房炎樣品中分離出124株大腸桿菌，分離率為11.6%，其中A群（占58.8%）分布較多，其次是B1群（占16.1%）和D群（占13.7%）及B2群（占11.3%）。藥敏結(jié)果顯示，分離株對常用抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中對多黏菌素B和氨芐西林的耐藥率最高，分別為76.6%和75.8%；多重耐藥株中以3～7耐藥株較多，最多對15種抗菌藥物耐藥，藥敏表型與基因型基本一致。在分離株中攜帶的主要毒力基因?yàn)閕rp2(29.8%)，其次是astA（21.7%）、iucD（14.5%）、afa8E（9.6%）、ehxA（7.2%）、saa（5.6%）和tsh（1.6%），其中毒力基因Irp2在A群的出現(xiàn)頻率要高于其他種群，而在A群中出現(xiàn)3種以上的毒力基因組合則少于其他種群。

奶牛乳房炎；大腸桿菌；系統(tǒng)進(jìn)化分群；耐藥性；毒力基因

乳房炎是造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最為嚴(yán)重的疾病之一[1]，它常常會(huì)引起牛奶產(chǎn)量和乳制品質(zhì)量的下降，甚至還會(huì)影響食品安全[2,3]。目前，引起奶牛乳房炎的主要病原菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌等，其中大腸桿菌性奶牛乳房炎在我國很多地區(qū)廣泛流行[4]。Clennont等根據(jù)大腸桿菌的進(jìn)化標(biāo)志基因?qū)⒋竽c桿菌分為A、B1、B2和D群，其中B2群和D群屬于腸道外大腸桿菌[5,6]，而A群則屬于共生性大腸桿菌，一般分布于宿主體內(nèi)，在某些條件下會(huì)導(dǎo)致奶牛乳房炎的發(fā)生[7]。

目前，在獸醫(yī)臨床上使用抗菌藥物是治療奶牛乳房炎的主要方法[8]。然而，隨著抗菌藥物的大量使用，大腸桿菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，給該病的有效防治帶來了極大的困難，同時(shí)超廣譜耐藥性大腸桿菌通過動(dòng)物性食品傳遞給人群的風(fēng)險(xiǎn)也在不斷增加，給衛(wèi)生安全也帶來了極大的威脅[9]。近年來，隨著新疆畜牧業(yè)的快速發(fā)展，奶牛養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，規(guī)模化牛場奶牛乳房炎的發(fā)病率不斷增加，成為制約奶業(yè)快速發(fā)展的瓶頸。為了解奶牛乳房炎大腸桿菌的耐藥特性和分子特征，本研究采集了新疆地區(qū)規(guī)模化奶牛場中國荷斯坦牛的乳房炎奶樣，對分離到的大腸桿菌進(jìn)行了種系進(jìn)化群分型和耐藥特性及毒力基因分析，以期為奶牛乳房炎治療的臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2015年10月～2016年9月，從新疆五家渠、石河子、塔城、阿克蘇等地區(qū)的規(guī)?；膛霾杉R床型乳房炎和隱性乳房炎的牛奶樣本1 068份。樣本采集方法：先使用75%酒精對乳頭進(jìn)行消毒，棄前三把奶，收集到滅菌離心管，放于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化使用的受體菌株E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

LB營養(yǎng)瓊脂、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、藥敏試驗(yàn)MH培養(yǎng)基均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；16種藥敏片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；PCR反應(yīng)試劑、pMD19-T載體、DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自諾維森（北京）生物科技有限公司。

1.3 大腸桿菌分離及鑒定

將50μL奶樣均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱37℃過夜培養(yǎng)。根據(jù)菌落培養(yǎng)特征，挑取大腸桿菌疑似菌落進(jìn)行純化和鑒定。將純化的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，接種于麥康凱固體培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基觀察菌落特征；初步鑒定為陽性者，然后按照參考文獻(xiàn)[10]建立的16S rRNA基因測序法，進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增和測序驗(yàn)證。引物合成和測序均由北京六合華大基因科技股份有限公司完成，引物序列見表1。純化和鑒定好的大腸桿菌菌株置于含有25%甘油的LB肉湯培養(yǎng)基中-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群

根據(jù)Clennont等[5]的報(bào)道合成3對引物，引物序列見表1。PCR采用25μL反應(yīng)體系：ddH2O 12μL，2×PCR Mix10 μL，模板2 μ L，上、下游引物各0.5μL，補(bǔ)水至25μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取10μL PCR產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳，并照相記錄結(jié)果。引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn)

對奶牛乳房炎大腸桿菌新疆分離株進(jìn)行16種常用藥物的藥敏試驗(yàn)，所選藥物見表1，按照CLSI推薦的K-B法進(jìn)行。根據(jù)CLSI (2012)的標(biāo)準(zhǔn)判定其耐藥性。

表1 本研究所用引物及目標(biāo)基因

1.6 毒力基因和耐藥基因的檢測

根據(jù)參考文獻(xiàn)[11,12]確定16種毒力基因和3種耐藥基因的引物序列（表1）。毒力基因PCR反應(yīng)體系為20μL：ddH2O 7μL，2×PCR Mix10μL，模板2μL，上、下游引物各0.5μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，x℃（不同毒力基因的退火溫度）退火30s，72℃延伸75s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。耐藥基因PCR反應(yīng)體系見1.4；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠純化，克隆于pMD19-T質(zhì)粒中，由北京六合華大基因科技股份有限公司測序，序列結(jié)果用NCBI-BLAST比對后確定毒力基因和耐藥基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離鑒定

從1 068份奶牛乳房炎樣品中共分離出124株大腸桿菌，分離率為11.6%。大腸桿菌在LB固體培養(yǎng)基呈白色、濕潤、閃光、不透明的圓形菌落；在麥康凱平板上長出紅色、圓形、扁平、表面光滑、濕潤不透明菌落；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成黑色或深紫色帶金屬光澤的菌落；細(xì)菌革蘭氏染色后鏡檢呈兩端鈍圓、紅色、粗短的小桿菌（圖1）；用引物擴(kuò)增16S rDNA 基因后，分離菌株擴(kuò)增產(chǎn)物均獲得202bp的目的片段（圖2），經(jīng)測序，與GenBank上的大腸桿菌16S rDNA序列同源性均為99%～100%。

圖1 細(xì)菌革蘭氏染色鏡檢(100×)

圖2 部分大腸桿菌16S rDNA PCR擴(kuò)增

2.2 大腸桿菌臨床分離株的系統(tǒng)進(jìn)化分群

對124株大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分群鑒定，判定標(biāo)準(zhǔn)為：A群（chuA-、yjaA-、TSPE4.C2-或chuA-、yjaA+、TSPE4.C2-），B1群（chuA、TSPE4.C2+），B2群（chuA+、yjaA+），D群（chuA+、yjaA-）。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳可觀察到chuA（279bp）、yiaA（211bp）和（或）TspE4.C2（152bp）的特異電泳條帶。根據(jù)PCR條帶確定奶牛乳房炎大腸桿菌菌株的系統(tǒng)進(jìn)化分群結(jié)果（圖3）。其中A群73株（58.8%)，B1群21株（16.1%），D群17株（13.7%），B2群14株（11.3%）。

表2 大腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖3 三重PCR進(jìn)行大腸桿菌分群擴(kuò)增

2.3 大腸桿菌臨床分離株抗生素耐藥表型

對124株大腸桿菌進(jìn)行臨床常用抗菌藥的敏感性檢測，結(jié)果95株大腸桿菌對多 菌素B耐藥，耐藥率最高，為76.6%，其次是氨芐西林，為75.8%。對氯霉素、氟苯尼考、頭孢他啶、恩諾沙星、諾氟沙星高度敏感，敏感率分別為91.9%、91.9%、88.7%、86.3%和79.0%（表2）。

2.4 大腸桿菌臨床分離株blaTEM、blaSHA和blaOXA-1基因的檢測

利用3重PCR對94株耐氨芐西林的菌株進(jìn)行耐藥基因的檢測，并對目的條帶進(jìn)行了回收并克隆到pMD19-T載體中，測序鑒定以驗(yàn)證耐藥基因。其中84株攜帶有blaTEM和blaOXA-1基因，占所有菌株的67.7%，有82株(66.1%) 攜帶了blaTEM基因，19株(15.3%)攜帶了blaOXA-1基因，有些菌株含有blaTEM和blaOXA-1兩個(gè)基因，所有耐氨芐西林菌株中沒有檢測到blaSHA基因（圖4）。

圖4 大腸桿菌分離株blaTEM、blaSHA和blaOXA-1基因的PCR擴(kuò)增

2.5 大腸桿菌臨床分離株多重耐藥性分析

圖5 大腸桿菌分離株對16種抗菌藥物的多重耐藥性

本次試驗(yàn)分離的124株大腸桿菌對所有抗菌藥物都敏感的菌株有3株，僅對一種藥物耐藥的有15株。多重耐藥株中以3～7耐藥株較多，最多的對15種抗菌藥物耐藥（圖5）。

2.6 大腸桿菌臨床分離株毒力基因的檢測

對124株大腸桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果共檢測出7種毒力基因，擴(kuò)增條帶與預(yù)期目的條帶大小相符（圖6），并對目的條帶進(jìn)行了回收并克隆到pMD19-T載體中，測序鑒定以驗(yàn)證毒力基因。結(jié)果，有69株表達(dá)毒力基因，其中以irp2(29.8%)基因檢出率最高，且在A群的出現(xiàn)頻率要高于其他種群，其次是astA（21.7%）、 iucD（14.5%）、afa8E（9.6%）、ehxA（7.2%）、saa（5.6%）和tsh（1.6%），而fl7A、papC、sfaD、eaeA、iss、cnf2、vat、stxl和stx2則沒有檢測到（表3）。

圖6 7種毒力基因PCR擴(kuò)增

表3 奶牛乳房炎源性大腸桿菌毒力因子分布狀況

表4 奶牛乳房炎源性大腸桿菌毒力基因分布和組合模式

毒力基因的分布具有多樣性，A群有36株含有毒力基因，有12種不同的毒力基因組合，其中多以1種或2種的毒力基因組合為主，且A群中的毒力基因分布更廣泛；B1群有12株含有毒力基因，出現(xiàn)了5種不同的毒力基因組合且有1株菌含有4種毒力基因；B2群有11株含有毒力基因，有4種不同的組合；D群有10株含有毒力基因，有4種不同的毒力組合（表4）。

3 討論

大腸桿菌是奶牛乳房炎的重要病原菌之一。國內(nèi)外研究認(rèn)為，奶牛乳房炎可由共生性大腸桿菌的繼發(fā)感染所導(dǎo)致。王登峰等對新疆奶牛乳腺炎樣品中的大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育組分析，發(fā)現(xiàn)造成奶牛乳房炎的大腸桿菌主要集中于A 群和B1群，沒有發(fā)現(xiàn)B2和D群[13]。Leena Suojala等對芬蘭南部奶牛乳房炎144株大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育組分析，結(jié)果顯示主要集中在A群（119；82.6%），其次為D群（16；11.1%）、B1群（7；4.9%）和B2群（2；1.4%）[14]。而在本研究中，奶牛乳房炎大腸桿菌分離菌株主要集中在A群（73；58.8%），其次是B1群（20；16.1%）、D群（17；13.7%）和B2群（14；11.3%），與前人研究結(jié)果存在差異，可能因地理分布差異所造成。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的致病性與系統(tǒng)發(fā)育群的類型不完全相關(guān)，在多數(shù)情況下因外源大腸桿菌感染并造成奶牛乳房炎的情況并不常見，通常是由共生性的大腸桿菌在一定條件下導(dǎo)致奶牛乳房炎發(fā)生。本試驗(yàn)中A群大腸桿菌與奶牛乳房炎的患病顯著相關(guān)，相比其他種群大腸桿菌，A群大腸桿菌對奶牛乳房炎可能有更強(qiáng)的致病性。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，奶牛乳房炎大腸桿菌新疆分離株對多 菌素B、氨芐西林具有一定的耐藥性，而對頭孢他啶、氯霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、恩諾沙星等藥物的耐藥率較低，且存在多重耐藥菌株，因此在臨床用藥中要盡量避免使用多 菌素B和氨芐西林。在對耐氨芐西林的耐藥基因檢測中共擴(kuò)增出了blaTEM、blaOXA-1 兩種耐藥基因，其中以blaTEM基因檢出率最高，占耐氨芐西林菌株的87.2%。底麗娜等已報(bào)道分離自新疆的牛源大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥情況，其中blaTEM基因的檢出率最高，占15.63%[15]，還有相關(guān)報(bào)道稱肉牛源大腸桿菌中blaTEM基因的流行率最高[16]。

大腸桿菌的致病性依賴于其表達(dá)的毒力因子[17]，毒力因子在其致乳房炎發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用[18]。大腸桿菌在建立感染過程中，首先要 附到宿主細(xì)胞，這種結(jié)合機(jī)制由細(xì)菌的 附素啟動(dòng)。在本研究中，afa8E基因（編碼AFA8非菌毛 附素）檢出率為9.6%；saa基因（編碼自凝集 附素）檢出率為5.6%，而f17A、papC、sfaD和eaeA基因（分別編碼F17菌毛、P菌毛、S菌毛和緊密連接素）則沒有檢測到。irp2基因作為耶爾森菌強(qiáng)毒力島HPI核心區(qū)基因，檢出率為29.8%，這與徐繼英等報(bào)道的基本一致[19]。astA基因（編碼腸聚集性耐熱毒素）檢出率為21.7%。tsh基因（編碼溫度敏感性血凝素）表達(dá)受溫度的調(diào)控[20]，僅檢測出2株。iucD基因（編碼氣桿菌素）的檢出率為14.5%，且在4個(gè)種系群中廣泛分布。產(chǎn)志賀毒素型大腸桿菌（STEC）的致病性主要通過其攜帶毒力基因的編碼產(chǎn)物來發(fā)揮作用，包括編碼志賀毒素的 stx 基因、位于LEE 毒力島上編碼 附素的eae基因和位于60Mu 致病性大質(zhì)粒上編碼溶血素（ehxA）基因等[21]。在本研究中并沒有檢測到志賀毒素1（Stx1）和志賀毒素2（Stx2）兩種毒力基因，但檢測到有8株攜帶溶血素（ehxA）基因。

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Phylogenetic Grouping, Antimicrobial Resistance and Virulence Factors of Escherichia coli Isolated from Bovine Mastitis in Xinjiang

YU Wei-wei1, QIAO Jun1, MENG Qing-ling1,2, PENG Ye-long5, ZHANG Jin-sheng3, WANG Hui-sheng4,CAI Xue-peng2, CHEN Chuang-fu1
(1. Department of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832003; 2.Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046; 3.Institute of Veterinary of Shawan County, Shawan 832100; 4.Ulanwusu Veterinary Station of Shawan, Shawan 832100; 5.The Center of Animal Disease Control and Diagnosis in Aksu Area, Aksu 843000)

The objectives of this study were to investigate phylogenetic group, drug resistance and virulence genes of Escherichia coli isolated from bovine mastitis in Xinjiang. The antimicrobial resistance of Escherichia coli to 16 drugs was determined by the methods of K-B and the phylogenetic group and virulence genes and drug resistance genes were detected by PCR. The results showed that totally 124 E. coli isolates recovered from 1068 bovine mastitis samples. The isolation rate was 11.6%. Based on the presence of the speci fi c genes chuA, yjaA and TspE4.C2, these isolates were found to belong to four different groups: group A(58.8%), group B1(16.1%), group B2(11.3%) and group D(13.7%). The drug sensitivity results showed that the resistance rate of polymyxin was the highest and it achieved 76.6%. Further-more, the resistance rates of ampicillin were about 75.8%. Multi drug resistant strains were resistant to 3～7, most of which were resistant to 15 kinds of antibiotics. The drug resistance phenotype was consistent with the genotype. The results of virulence genes detection showed that the detection rates of virulence genes irp2, astA, iucD, afa8E, ehxA, saa , tsh were 29.8%, 21.7%, 14.5%, 9.6%, 7.2%, 5.6% and 1.6%respectively. The irp2-coding gene was more often detected in group A than in other groups isolates. In contrast,three or more virulence genes were identi fi ed more often in other group isolates.

Bovine mastitis; Escherichia coli; Phylogenetic grouping; Drug resistance; Virulence gene

S858.23

A

1004-4264（2017）10-0030-06

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.10.008

2017-02-27

兵團(tuán)中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才計(jì)劃（2016BC001）；十三五國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃子課題（2016YFD0500900）；烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)局現(xiàn)代服務(wù)業(yè)促進(jìn)計(jì)劃（F141310002）。

于偉偉（1990-），男，山東即墨人，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究工作。

孟慶玲（1969-），女，江蘇徐州人，教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物寄生蟲學(xué)。