于紅燕，楊占東，楊 琪，于 斐

(1.濱州市濱城區(qū)市立醫(yī)院，山東 濱州 256600； 2.空軍總醫(yī)院，北京 100142； 3.北京大學深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036)

研究報告

單染與復染在觀察SIRT1基因敲除小鼠骨
關節(jié)炎切片中的差異比較

于紅燕1，楊占東1，楊 琪2，于 斐3*

(1.濱州市濱城區(qū)市立醫(yī)院，山東 濱州 256600； 2.空軍總醫(yī)院，北京 100142； 3.北京大學深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036)

目的通過SIRT1基因敲除建立相關小鼠膝關節(jié)骨關節(jié)炎模型，在此基礎上觀察各種不同單獨染色或復合染色技術在觀察軟骨組織切片形態(tài)學中的差異。方法將小鼠膝關節(jié)組織標本分為2組：SIRT1-/-小鼠假手術組(n=6，A組)，SIRT1-/-小鼠骨關節(jié)炎模型組(n=6，B組)。通過前交叉韌帶橫斷加內側半月板切除術建立膝關節(jié)骨關節(jié)炎模型，行HE染色、番紅O-固綠染色、番紅O-阿利新藍染色、番紅O染色、固綠染色、阿利新藍染色，6種單獨染色或復合染色方式觀察膝關節(jié)軟骨組織形態(tài)學變化。結果番紅O-固綠染色、番紅O-阿利新藍染色在觀察軟骨細胞的細胞形態(tài)、軟骨分層結構的情況、II型膠原纖維的顯示、潮線及軟骨下骨的改變中，效果更好；而番紅O染色、阿利新藍染色在觀察軟骨組織缺失方面有一定的優(yōu)勢。結論在觀察SIRT1基因敲除小鼠膝關節(jié)骨關節(jié)炎軟骨組織切片中，與單獨染色相比，復合染色在獲得軟骨結構的各種信息方面優(yōu)勢更加明顯。

SIRT1基因；基因敲除；小鼠動物模型；骨關節(jié)炎；單獨染色；復合染色

骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種以關節(jié)軟骨的退變丟失為基礎的多因素慢性疾病，在50歲以上人群中的發(fā)病率極高，僅次于心血管疾病居第二位[1]，容易造成患者的生活質量降低，嚴重者可導致殘疾，給國家和家庭帶來了沉重的負擔。沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)，是一種與衰老密切相關的III型去乙酰化酶基因，在哺乳動物中研究深入，近年來研究證實，SIRT1基因可以通過PI3K/AKT[2]、NF-κB[3]等信號通路的作用與OA相關聯(lián)，并在OA發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。我們前期研究證實，當SIRT1基因條件性敲除后，OA發(fā)生更加明顯[4]，因此，在SIRT1基因條件性敲除的基礎上進行OA的觀察效果更加明顯。在OA的相關研究中，病理學檢查用處較大，而各種染色技術因其能夠直觀反應OA軟骨組織的形態(tài)學變化而經(jīng)常使用，不同染色技術在觀察OA關節(jié)軟骨切片中作用很大。

在以往OA相關的研究中，單獨染色或者幾種染料復合染色觀察OA軟骨組織的切片均有使用，但是觀察效果各不相同，很少有對單獨染色及復合染色的效果進行分析對比，研究單獨染色與復合染色的區(qū)別以及各自的染色規(guī)律。為了探求不同的單獨染色與復合染色在觀察OA軟骨組織切片中的相關作用，我們在軟骨組織SIRT1基因條件性敲除的小鼠基礎上，分析OA發(fā)生前后膝關節(jié)軟骨組織中各種單獨染色和復合染色對于膝關節(jié)軟骨組織的觀察效果，通過常規(guī)HE染色、番紅O-固綠染色、番紅O-阿利新藍染色、番紅O染色、固綠染色、阿利新藍染色6種單獨染色或復合染色方式探討OA關節(jié)軟骨組織形態(tài)學研究中的染色規(guī)律及應用中的優(yōu)缺點。

1 材料和方法

1.1實驗動物

SPF級B6;129-Sirt1tm1Ygu/J[5](SIRT1co/co)小鼠和FVB-Tg(Col2a1-cre/ERT) KA3Smac/J[6](Col2-CreERT2)小鼠，各3只雌性與3只雄性，12～13周齡，購買自美國杰克遜實驗室。實驗用小鼠飼養(yǎng)于北京大學/香港科技大學醫(yī)學中心深圳醫(yī)院實驗動物中心[SYXK(粵)2015-0106]SPF級屏障區(qū)域的PVC鼠籠內，持續(xù)過濾通氣，自由飲食，清潔飲水，每日保持12 h光照/黑暗循環(huán)。實驗流程和小鼠處理均遵循實驗動物管理規(guī)范，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2主要試劑與儀器

Fast green solution、safranin O solution購自Scytek公司；蘇木素購自廣州速聚生物有限公司；伊紅Y購自行知生物科技有限公司；阿利新藍購自北京雷根生物技術有限公司；中性樹膠購自國藥集團化學試劑有限公司。

光學顯微鏡、組織自動脫水機、組織自動包埋機、石蠟切片機(德國Leica公司)；高壓滅菌器(日本Hirayama公司)；超凈臺(蘇凈集團安泰公司)；鼠臺(河南省原陽縣振華教學儀器公司)；顯微器械(上海醫(yī)療器械有限公司手術器廠)；4℃冰箱(中國海爾公司)；體視顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.3實驗方法

1.3.1 軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠的繁育

將SIRT1co/co小鼠與Col2-CreERT2小鼠交配，獲得Col2-CreERT2；SIRT1co/co小鼠，15個月月齡Col2-CreERT2；SIRT1co/co小鼠，腹腔注射他莫昔芬(10 mg/mL，1 mg/(mL·g)，每日1次，連續(xù)注射5 d),即獲得SIRT1cKO小鼠(SIRT1-/-小鼠)，從而更好的模擬OA在人群中的發(fā)病規(guī)律。基因敲除及鑒定方法參照本實驗組前期研究[4]。

1.3.2 實驗分組及膝關節(jié)OA模型的建立

他莫昔芬注射完畢7 d后，SIRT1-/-小鼠行右側膝關節(jié)前交叉韌帶橫斷加內側半月板切除術建立OA模型，左側膝關節(jié)僅切開滑膜囊行假手術作為對照，手術后3個月建立膝關節(jié)OA模型。實驗樣本分為2組：SIRT1-/-小鼠假手術組(n=6，A組)：SIRT1基因敲除，膝關節(jié)進行假手術；SIRT1-/-小鼠骨關節(jié)炎模型組(n=6，B組)：SIRT1基因敲除，膝關節(jié)手術造成OA模型。具體方法參照本實驗組前期研究[4]。

1.3.3 染色

HE染色：取膝關節(jié)，固定，脫鈣，包埋，切片，蘇木素染核15 min，流水沖洗1 min，靜水放置5 min，0.5%伊紅染液3 min，流水沖洗。

番紅O-固綠染色：取膝關節(jié)，固定，脫鈣，包埋，切片，番紅O染液滴染20 min，自來水洗10 s，60℃預熱固綠滴染30 s，蒸餾水急洗一次，番紅O染液復合染色10 min，自來水沖洗10 s。

番紅O-阿利新藍染色：取膝關節(jié)，固定，脫鈣，包埋，切片，番紅O染液滴染20 min，流水沖洗，阿利新藍染色液采用改良Lison法配制[7]，阿利新藍染液24 h，流水沖洗。

番紅O染色：取膝關節(jié)，固定，脫鈣，包埋，切片，番紅O染液滴染20 min，流水沖洗。

固綠染色：取膝關節(jié)，固定，脫鈣，包埋，切片，60℃預熱固綠滴染30 s，流水沖洗。

阿利新藍染色：取膝關節(jié)，固定，脫鈣，包埋，切片，阿利新藍染色液采用改良Lison法配制，阿利新藍染液24 h，流水沖洗。

2 結果

2.1軟骨整體情況

A組小鼠軟骨組織表面光滑平整，軟骨各層結構清晰可以分辨，軟骨細胞數(shù)量較多，形態(tài)均一，散在分布，部分細胞可以看到細胞核，II型膠原分布較均勻，潮線平整光滑，位置適中，軟骨下骨形態(tài)清晰。B組小鼠軟骨組織表面凹凸不平，部分位置出現(xiàn)糜爛、缺損，甚至出現(xiàn)鈣化，軟骨各層結構分辨不清，比較單一，軟骨細胞數(shù)量減少，大小不等，成簇分布，II型膠原遭到破壞，潮線扭曲不規(guī)則，出現(xiàn)前移，甚至有部分潮線可以看到血管通過，軟骨下骨形態(tài)分辨不清(圖1、2)。

2.2軟骨細胞結構

A組小鼠軟骨組織切片中，軟骨細胞的數(shù)量較多，形狀多為圓形或類圓形，大小均一，在軟骨各層中分布均勻，細胞核清晰可見，著色均勻。B組小鼠軟骨組織切片中，軟骨細胞數(shù)量減少，在不同軟骨層中數(shù)量有差異，細胞形狀大小不一，分布紊亂甚至成簇分布，細胞核著色變淺。在軟骨細胞結構的觀察方面，復合染色分辨更加清晰，對于不同細胞結構著色有所差異，單獨染色只能通過同一顏色的深淺分辨細胞不同結構。HE染色可以看到軟骨細胞的細胞核為藍紫色，細胞質為粉紅色；番紅O-固綠染色的細胞核為藍綠色，細胞質淡紅色；番紅O-阿利新藍染色中細胞核為淡藍色，細胞質淡紅色；而在單獨番紅O染色、固綠染色、阿利新藍染色中，細胞核和細胞質均為單一的顏色，僅深淺不同(圖1、2)。

2.3軟骨分層

A組小鼠的大部分切片中，能夠分清軟骨表層、移行層、輻射層和鈣化層，其中幾種復合染色更容易觀察到軟骨的四層結構，在觀察效果上單獨染色要劣于復合染色，在不同單獨染色和復合染色中，各層面積有所不同。B組小鼠軟骨組織四層結構分辨不清，由于表面的破壞使得部分軟骨層缺失，但是在B組小鼠軟骨組織的切片中，阿利新藍染色、番紅O染色這兩種單獨染色方式與其他單獨染色方式相比，在觀察軟骨組織缺失上表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，缺少軟骨組織的地方兩種染料著色變淺，而在整體的觀察效果上，復合染色方式仍然優(yōu)于單獨染色方式。HE染色、番紅O-固綠染色、番紅O-阿利新藍染色這幾種復合染色中，可以看到以輻射層為中心向兩側分別產(chǎn)生顏色變化，而番紅O染色、固綠染色、阿利新藍染色這幾種單獨染色中顏色比較單一(圖1、2)。

2.4II型膠原纖維

II型膠原纖維是軟骨組織特異性的膠原纖維，能夠對軟骨進行定位，不同染色方式下II型膠原的著色不同。A組小鼠軟骨組織切片中，II型膠原可能僅由于小鼠年齡較大導致表達減少，整體破壞較輕，單獨染色中著色比較均勻，復合染色中可因顏色的差異進行分辨。B組小鼠軟骨組織切片中，II型膠原則因為OA的發(fā)生而破壞嚴重，單獨染色中著色變淺，復合染色中顏色單一。HE染色和番紅O染色中，該區(qū)域呈粉紅色；固綠染色、阿利新藍染色、番紅O-固綠染色和番紅O-阿利新藍染色中該區(qū)域呈藍綠色或淡藍色。但是由于染料數(shù)量的不同，與單獨染色相比，復合染色在分辨II型膠原中，由于顏色豐富效果更好(圖1、2)。

2.5潮線

潮線可以區(qū)分軟骨的深層和鈣化層，呈波浪狀。A組小鼠軟骨組織切片中，潮線完整光滑，位置適中，沒有血管通過。B組小鼠軟骨組織切片中，潮線扭曲不規(guī)則，出現(xiàn)中斷，發(fā)生前移，部分位置可以看到血管通過潮線。復合染色在觀察潮線的過程中優(yōu)勢更加明顯，能夠明顯看到潮線的形態(tài)以及周圍的各種結構組織，單獨染色僅能部分區(qū)分潮線形態(tài)，甚至無法分辨潮線(圖1、2)。

2.6軟骨下骨

A組小鼠軟骨組織切片中，軟骨下骨較厚，染色均勻，結構比較規(guī)律。B組小鼠軟骨組織切片中，軟骨下骨變薄，染色單一，結構紊亂。在觀察效果上仍然是復合染色優(yōu)于單獨染色(圖1、2)。

注：A為HE染色；B為番紅O-固綠染色；C為番紅O-阿利新藍染色；D為番紅O染色；E為固綠染色；F為阿利新藍染色。圖1 SIRT1-/-小鼠假手術組膝關節(jié)軟骨組織形態(tài)( ×400)Note.A is HE staining；B is Safranin O-fast green staining；C is Safranin O-alcian blue staining；D is Safranin O staining；E is fast green staining；F is Alcian Blue staining.Fig.1 Morphology of knee joint cartilage in the SIRT1-/-mice control group

注：A為HE染色；B為番紅O-固綠染色；C為番紅O-阿利新藍染色；D為番紅O染色；E為固綠染色；F為阿利新藍染色。圖2 SIRT1-/-小鼠骨關節(jié)炎模型組膝關節(jié)軟骨組織形態(tài)( ×400)Note.A is HE staining；B is Safranin O-fast green staining；C is Safranin O-alcian blue staining；D is Safranin O staining；E is fast green staining；F is Alcian Blue staining.Fig.2 Morphological changes of knee joint cartilage in the SIRT1-/- mouse OA model group

3 討論

OA是一種與衰老、肥胖、遺傳等因素密切相關的慢性退行性疾病，病理特點是嚴重的、局限性軟骨破壞，深達骨質，臨床上也出現(xiàn)相應的癥狀。SIRT1基因因與衰老關系密切而參與到OA的發(fā)生發(fā)展過程中，并且可以通過PI3K/AKT[2]、NF-κB[3]等信號通路的作用影響到OA的進程，當小鼠軟骨組織中SIRT1基因條件性敲除之后，可以加重OA的發(fā)生發(fā)展，從而更加有利于觀察OA軟骨組織的切片情況。因此，我們利用軟骨組織SIRT1基因特異性敲除的小鼠膝關節(jié)OA模型，觀察不同單獨染色及復合染色在觀察OA軟骨組織切片中的效果，為后續(xù)研究提供便利的條件。

蘇木素是一種堿性染料，從洋蘇木中提取，氧化后可生成蘇木精，可將酸性成分染成藍色。而伊紅是一種酸性染料，可將細胞漿、結締組織等染成紅色或粉紅色。蘇木素常與伊紅同時使用，作為病理學中常規(guī)的HE染色，用于與其他染色方式進行對照。阿利新藍是一種大分子共軛染料，該染料帶有陽離子，可與酸性基團相結合，從而形成不溶性復合物[8]。在軟骨組織中，阿利新藍可以與黏多糖結合，將軟骨細胞及軟骨基質染成淺藍色，從而對軟骨組織特異性著色。番紅O是一種堿性染料，可與蛋白多糖結合，而軟骨組織是一種嗜酸性的組織，與番紅O結合后軟骨基質及軟骨細胞特異性的紅染。固綠則為一種酸性染料，可與蛋白結合，并與嗜酸性的骨結合形成藍綠色[9]。不同染色方法因染料的不同而具有一定的特異性，從而使物質顯現(xiàn)出不同的效果，鑒于我們以往研究中發(fā)現(xiàn)，在軟骨組織中觀察比較多的幾個結構分別為軟骨細胞的細胞形態(tài)、軟骨分層結構的情況、II型膠原纖維的顯示、潮線及軟骨下骨的分辨作為對比重點，用于研究幾種單獨染色及復合染色的效果。

我們在研究中發(fā)現(xiàn)，SIRT1基因敲除后OA發(fā)生時，軟骨組織破壞嚴重，軟骨細胞數(shù)量減少，形態(tài)不一，分布紊亂，細胞結構難以觀察，軟骨層變薄，四層結構更難分辨，II型膠原破壞，染色面積減少，潮線扭曲不規(guī)則，發(fā)生前移，部分位置有血管通過，軟骨下骨變薄，結構不規(guī)律。復合染色在整體觀察效果上優(yōu)于單獨染色，在軟骨細胞結構、軟骨分層、II型膠原和軟骨下骨的觀察上，復合染色由于多種染料的存在，使不同結構或者部位著色不同，更容易區(qū)分辨別不同的結構及部位。例如在軟骨細胞的觀察中，HE染色可以看到軟骨細胞的細胞核為藍紫色，細胞質為粉紅色；番紅O-固綠染色的細胞核為藍綠色，細胞質淡紅色；番紅O-阿利新藍染色中細胞核為淡藍色，細胞質淡紅色；而在單獨番紅O染色、固綠染色、阿利新藍染色中，細胞核和細胞質均為單一的顏色。在軟骨分層的觀察中，復合染色可以看到以輻射層為中心向兩側分別產(chǎn)生顏色變化，單獨染色中顏色則比較單一。在潮線的觀察上，復合染色效果也優(yōu)于單獨染色，復合染色可在潮線處因顏色的交替呈現(xiàn)出明顯的界線，從而更好的反應潮線情況，單獨染色則沒有這個優(yōu)勢。然而，單獨染色也有其一定的好處，比如在觀察軟骨組織的缺失方面，阿利新藍染色和番紅O染色中，缺失軟骨處顏色變淺甚至消失，比其他單獨染色和復合染色更加明顯。另外，單獨染色所用試劑較少，與復合染色相比，價格低、操作簡單，而且染色成功的幾率更高。

綜上所述，不同的單獨染色及復合染色，在觀察SIRT1基因敲除小鼠膝關節(jié)骨關節(jié)炎軟骨組織切片時有不同特點，番紅O-固綠染色、番紅O-阿利新藍染色在觀察軟骨細胞的細胞形態(tài)、軟骨分層結構的情況、II型膠原纖維的顯示、潮線及軟骨下骨的改變中，效果更好；而番紅O染色、固綠染色在觀察軟骨組織缺失方面有一定的優(yōu)勢；固綠染色單獨使用效果不如前幾種染色好。在研究中，應該結合實驗室的研究條件、經(jīng)費、實驗周期長短等多種因素綜合選擇染色方法，以得到預期的效果。

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ObservationofthearticularcartilageofosteoarthritisinSIRT1geneknock-outmicethroughsinglestainingandcompoundstaining

YU Hong-yan1， YANG Zhan-dong1， YANG Qi2， YU Fei3*

(1.Binchengqu Shili Hospital,Binzhou 256600,China； 2.Air Force General Hospital,Beijing 100142； 3.Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518036)

ObjectiveTo establish osteoarthritis model of the knee joint in mice on the basis of knocking outSIRT1 gene and to observe the differences in the morphology of the cartilage tissue using single staining and compound staining.MethodsThe knee joint specimens were divided into two groups:SIRT1-/-control group (group A,n=6) andSIRT1-/-osteoarthritis model group (group B,n=6). The knee anterior cruciate ligament was traversed, and the ipsilateral medial meniscus was cut to establish an osteoarthritis model of knee joint. HE staining, safranin O-fast green staining, safranin O-alcian blue staining, safranin O staining, fast green staining, alcian blue staining were used to observe the morphological changes in the articular cartilage of the knee.ResultsSafranin O-fast green staining and safranin O-alcian blue staining showed better results in observation of the morphology of chondrocytes, the structure of cartilage layers, the presence of type II collagen, tide line and the changes of subchondral bone. While the safranin O staining and alcian blue staining had certain advantages in the observation of the defects of cartilage tissue.ConclusionsCompared with the single staining, the compound staining used in this study have obvious advantages in obtaining useful information of the cartilage structure in the observation of morphology of cartilage tissues inSIRT1 gene knock-out mice.

SIRT1 gene; Gene knockout; Mouse model; Osteoarthritis; Single staining; Compound staining

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0034-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.007

2017-02-07

廣東省自然科學基金-博士啟動項目(2016A030310070)；深圳市科創(chuàng)委資助項目(JCYJ20160428173412866)。

于紅燕(1965-)，女，副高，研究生。E-mail: 434674348@qq.com

于斐(1989-)，男，研究生。研究方向：骨關節(jié)炎、骨科生物材料。E-mail: oscarfyu@163.com