杜 珍，陳志美，周道秋，黃潔萍

(海南省第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南 五指山 572299)

研究報(bào)告

siRNA沉默MACC1基因表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響

杜 珍，陳志美，周道秋，黃潔萍

(海南省第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南 五指山 572299)

目的探討siRNA沉默結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MACC1)表達(dá)對(duì)Hela宮頸癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響。方法通過(guò)脂質(zhì)體將siRNA MACC1及siRNA NC轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞中，RT-PCR及western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，western blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、cyclin E，基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、MMP9蛋白表達(dá)及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)磷酸化水平。結(jié)果與siRNA NC組比較，siRNA MACC1組中MACC1蛋白及mRNA表達(dá)量降低(P< 0.01)，細(xì)胞活力及侵襲能力下降(P< 0.01)，細(xì)胞周期阻滯在G1期，cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9及p-ERK表達(dá)量下調(diào)(P< 0.01)。結(jié)論siRNA MACC1能顯著的抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖與侵襲，可能與下調(diào)ERK磷酸化水平有關(guān)。

結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MACC1)；宮頸癌；增殖；侵襲

宮頸癌是一種常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，僅次于乳腺癌，近些年來(lái)由于宮頸癌細(xì)胞篩查技術(shù)的推廣使得宮頸癌的發(fā)病率及死亡率均有所下降，但是隨著高危型人乳頭狀病毒(HPV)持續(xù)感染的增加，導(dǎo)致了目前宮頸癌的發(fā)病年齡呈現(xiàn)了年輕化[1, 2]。同時(shí)宮頸癌的發(fā)病機(jī)制到目前為止還未詳細(xì)闡述，因此從分子水平上進(jìn)一步的探討宮頸癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)于宮頸癌的診斷，基因治療及預(yù)后將具有重大意義。Stein等學(xué)者在2009年結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)了結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1)，且后續(xù)研究表明MACC1在眾多的腫瘤組織中高表達(dá)，并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-6]。也有眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)MACC1在正常宮頸組織，中-重度宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，宮頸癌組織中逐漸高表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)MACC1在宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[7, 8]。但MACC1在宮頸癌細(xì)胞的增殖及侵襲中的作用還未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究將較為詳細(xì)的闡述此作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株

宮頸癌細(xì)胞Hela購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)TCHu187。

1.2主要試劑和儀器

兔抗人MACC1、cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9、ERK1/2、p-ERK1/2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗人GAPDH單克隆抗體，BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；siRNA MACC1及siRNA NC購(gòu)自上海吉瑪生物制藥公司；一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，trizol RNA提取試劑盒購(gòu)自大連寶生生物技術(shù)有限公司。DYCZ-25D型雙垂直電泳儀，DYCZ-25D型轉(zhuǎn)印電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；Biosciences FACSAria流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 siRNA的轉(zhuǎn)染

當(dāng)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到50%左右的時(shí)候，利用脂質(zhì)體將siRNA MACC1及siRNA NC轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，利用RT-PCR法及western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

將Hela細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，按“1.3.1”進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h，將96孔板翻過(guò)來(lái)?xiàng)壢ド锨逡海偻?6孔板中每個(gè)孔加入150 μL的二甲基亞砜，96孔板在微量振蕩器中震蕩約10 min，最后在酶標(biāo)儀中檢測(cè)OD值，波長(zhǎng)選擇為560 nm，OD值即是細(xì)胞活力。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

將Hela細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，按“1.3.1”進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每組分別收集1×105/mL個(gè)細(xì)胞，加入Rnase(終濃度為10 mg/mL)5 μL，小心吹打吹打混勻后，室溫下孵育1 h，再加入PI染液，繼續(xù)吹打混勻，并在室溫下避光孵育30 min，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)分析。

1.3.4 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將matrigel膠平鋪于Transwell小室微膜上以被使用。利用0.25%胰蛋白酶將按“1.3.1”進(jìn)行轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)了48 h的Hela細(xì)胞消化下來(lái)，離心收集細(xì)胞后，將細(xì)胞接種到Transwell的上室，下室不接種細(xì)胞，僅加入DMEM培養(yǎng)基，48 h后，將Transwell小室取出來(lái)，用4%的多聚甲醛固定5 min，PBS洗滌后，結(jié)晶紫再染色5 min，在倒置顯微鏡下觀察，并取5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值，即為細(xì)胞的侵襲數(shù)目。

1.3.5 RT-PCR檢測(cè)MACC1 mRNA的表達(dá)

采用trizol RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總的RNA，并用檢測(cè)總RNA的純度，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果OD260/OD280在1.8～2.1之間，說(shuō)明RNA純度的良好，可以接著采用一步法RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA，而逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。引物如下。MACC1上游引物：5’-AACCCCAAACCTAAAAAGACTC-3’，下游引物：5’-ACCCAGGACATCAGCTAAAACT-3’，GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物：5’-TGGACTCCACGACGTACT-3’。

1.3.6 Western blot檢測(cè)cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9及p-ERK的表達(dá)

在冰浴條件下把細(xì)胞刮下來(lái)，離心加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，大約30 min，并在4℃條件下離心，收集到的上清液即是總蛋白。接著采用BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。蛋白定容后，在微波爐上煮沸變性。制作濃縮膠和分離膠，并蒸餾水封閉。然后蛋白樣品上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗人cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9、ERK1/2，p-ERK1/2及GAPDH多克隆抗體，稀釋度為1∶100)孵育，4℃過(guò)夜；第二天在二抗溶液中室溫條件下孵育1～2 h。最后在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1siRNAMACC1對(duì)Hela細(xì)胞中MACC1表達(dá)的影響

如圖1所示，與siRNA NC組中MACC1蛋白(1.07±0.10)及mRNA(0.69±0.07)表達(dá)比較，siRNA MACC1組MACC1蛋白(0.29±0.03)及mRNA(0.12±0.01)表達(dá)下調(diào)，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.2siRNAMACC1對(duì)Hela細(xì)胞活力的影響

Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二者細(xì)胞活力分別為(0.73±0.07)、(0.38±0.03)，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.3siRNAMACC1對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響

如表1所示，Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后經(jīng)流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，siRNA MACC1能使細(xì)胞周期阻滯在G1期。

2.4siRNAMACC1對(duì)Hela細(xì)胞侵襲能力的影響

如圖2所示，Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后經(jīng)transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二者細(xì)胞侵襲數(shù)目分別為(159.65±15.94)、(38.59±3.86)，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.5siRNAMACC1對(duì)Hela細(xì)胞中cyclinD1及cyclinE表達(dá)的影響

如圖3所示，Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后經(jīng)western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與siRNA NC組中cyclin D1(0.54±0.05)及cyclin E(0.60±0.06)表達(dá)比較，siRNA MACC1組cyclin D1(0.15±0.01)及cyclin E(0.20±0.02)表達(dá)下調(diào)，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.6siRNAMACC1對(duì)Hela細(xì)胞中MMP2及MMP9表達(dá)的影響

如圖4所示，Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后經(jīng)western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與siRNA NC組中MMP2(1.19±0.12)及MMP9(1.03±0.10)表達(dá)比較，siRNA MACC1組MMP2(0.30±0.03)及MMP9(0.24±0.02)表達(dá)下調(diào)，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.7siRNAMACC1對(duì)Hela細(xì)胞中EKR磷酸化水平的影響

如圖5所示，Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后經(jīng)western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與siRNA NC組(1.38±0.12)比較，siRNA MACC1組(0.46±0.04)p-ERK1/2表達(dá)下調(diào) (P< 0.01)。

A:蛋白表達(dá)；B：mRNA表達(dá)。圖1 siRNA MACC1對(duì)Hela細(xì)胞中MACC1表達(dá)的影響(n=6)Note.A:Protein expression;B：mRNA expression.Fig.1 Effect of siRNA MACC1 on the expression of MACC1 in Hela cells

Tab.1Effect of siRNA MACC1 on Hela cell cycle

組別GroupsG1期G1phageS期SphageG2期G2phagesiRNANC4837±4901643±1643520±352siRNAMACC16254±629??1148±120??2598±260??

注：與siRNA NC比較，**P< 0.01。

Note.Compared with the siRNA NC group,**P< 0.01.

圖2 siRNA MACC1對(duì)Hela細(xì)胞侵襲能力的影響( ×200)Fig.2 Effect of siRNA MACC1 on the invasion ability of Hela cells

圖3 siRNA MACC1對(duì)Hela細(xì)胞中CyclinD1及CyclinE表達(dá)的影響Fig.3 Effect of siRNA MACC1 on the expression of cyclin D1 and cyclin E in Hela cells

圖4 siRNA MACC1對(duì)Hela細(xì)胞中MMP2及MMP9表達(dá)的影響Fig.4 Effect of siRNA MACC1 on the expression of MMP2 and MMP9 in Hela cells

圖5 siRNA MACC1對(duì)Hela細(xì)胞中p-ERK1/2表達(dá)的影響Fig.5 Effect of siRNA MACC1 on the expression of p-ERK1/2 in Hela cells

3 討論

2009年Stein等學(xué)者通過(guò)基因比對(duì)技術(shù)在結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)了一種與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，并命名為MACC1。MACC1位于人第7號(hào)染色體上，所編碼的蛋白質(zhì)由852個(gè)氨基酸組成。此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域包括ZU5，SH3及死亡結(jié)構(gòu)域等，能夠介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間相互作用，信號(hào)傳導(dǎo)，也能夠參與細(xì)胞凋亡，遷移，炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)[5, 6]。MACC1是HGF/c-Met信號(hào)通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠結(jié)合于c-Met啟動(dòng)子，激活此信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，也能夠促使c-Met自身發(fā)生磷酸化，進(jìn)而介導(dǎo)多種生物學(xué)反應(yīng)[5]。眾多研究已經(jīng)表明MACC1在宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種婦科腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5, 7, 8]。另外研究還表明siRNA MACC1能夠顯著的抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，與下調(diào)MMP2及MMP9表達(dá)有關(guān)[9]。但是目前MACC1在宮頸癌細(xì)胞的增殖及侵襲中的作用報(bào)道較少，并且相應(yīng)作用機(jī)制不清楚，因此本課題組將對(duì)此展開(kāi)研究。本研究首先利用脂質(zhì)體將siRNA MACC1及siRNA NC轉(zhuǎn)染到宮頸癌細(xì)胞Hela中，并利用western blot及RT-PCR證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。接著采用MTT法檢測(cè)siRNA MACC1對(duì)Hela細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明siRNA MACC1能顯著的降低Hela細(xì)胞活力，與Zhou等[9]研究一致。

腫瘤細(xì)胞增殖旺盛源于細(xì)胞周期的紊亂，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白異常表達(dá)，使細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)失去控制，導(dǎo)致細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成遠(yuǎn)大于分解，細(xì)胞有絲分裂加快，細(xì)胞不斷增值。其中G1期，G2期是細(xì)胞周期主要調(diào)控點(diǎn)，是眾多抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)[10, 11]。cyclin D1是與G1期密切相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白，在G1期合成并達(dá)到頂峰，能與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，促使下游核轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核與細(xì)胞增殖相關(guān)基因結(jié)合，并促使其轉(zhuǎn)錄，最終使得G1期向S期迅速轉(zhuǎn)換。cyclin E亦是與G1期相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白，能在cyclin D1降解后，與CDK2結(jié)合，促進(jìn)DNA繼續(xù)復(fù)制。另外腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致外科手術(shù)失敗的重要因素之一。其中細(xì)胞外基質(zhì)的降解能夠促使腫瘤細(xì)胞的快速遷移，介導(dǎo)這一個(gè)過(guò)程的是蛋白水解酶，其中最為主要的是MMPs。MMP2在降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的同時(shí)還能夠誘導(dǎo)新生血管的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移。MMP9是分子量最大的MMPs，幾乎能夠降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括Ⅳ膠原。而且有研究表明siRNA MACC1能夠通過(guò)下調(diào)cyclin D1，cyclin E表達(dá)，并使細(xì)胞周期阻滯在G1期，進(jìn)而遏制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖[12]。另外也有研究表明siRNA MACC1能夠抑制大腸癌細(xì)胞的遷移侵襲與下調(diào)MMP2，MMP9的表達(dá)有關(guān)[13]。因此探討siRNA MACC1對(duì)Hela細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及MMPs表達(dá)的影響將具有重要意義。所以本研究進(jìn)一步檢測(cè)了siRNA MACC1對(duì)Hela細(xì)胞周期，細(xì)胞侵襲能力，細(xì)胞周期蛋白及MMPs表達(dá)的影響，結(jié)果表明siRNA MACC1能使細(xì)胞周期阻滯在G1期，降低細(xì)胞侵襲能力，下調(diào)cyclin D1，cyclin E，MMP2及MMP9表達(dá)，最終抑制Hela細(xì)胞的增殖與侵襲。

細(xì)胞的凋亡，增殖，分化，細(xì)胞周期，細(xì)胞遷移及侵襲等等生物學(xué)過(guò)程受多種信號(hào)通路的調(diào)控，MAPK信號(hào)通路就是其中的一種[14]。MAPK家族包括ERK，JNK及p38 MAPK三個(gè)主要亞族。其中EKR是此信號(hào)通路的關(guān)節(jié)調(diào)控點(diǎn)，包括5個(gè)亞族(ERK1-5)，其中EKR1和ERK2研究得最為徹底，能通過(guò)自身磷酸化并將信號(hào)傳遞給下游基因進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生命過(guò)程。且有研究表明MACC1能夠通過(guò)MAPK信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[15]。提示MACC1可能也可以通過(guò)此信號(hào)通路影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。所以本研究接著利用western blot檢測(cè)siRNA MACC1對(duì)Hela細(xì)胞中ERK1/2磷酸化水平的影響，結(jié)果表明siRNA MACC1能顯著的下調(diào)p-ERK1/2表達(dá)，進(jìn)而遏制Hela細(xì)胞的增殖與侵襲。

綜上所述，siRNA MACC1能顯著降低Hela細(xì)胞活力，使細(xì)胞周期阻滯在G期，并降低細(xì)胞侵襲能力，是通過(guò)下調(diào)cyclin D1、cyclin E、MMP2及MMP9表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，可能與抑制ERK信號(hào)通路激活有關(guān)。

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EffectofsilencingMACC1geneonproliferationandinvasionofcervicalcancercells

DU Zhen， CHEN Zhi-mei， ZHOU Dao-qiu， HUANG Jie-ping

(Department of Obstetrics and Gynecology; the Second People’s Hospital of Hainan province，Wuzhishan 72299，China)

ObjectiveTo explore the effect of silencing metastasis-associated in colon cancer 1 (MACC1) gene on proliferation and invasion of cervical cancer Hela cells.MethodssiRNA MACC1 and siRNA NC were transfected into cervical cancer Hela cells with liposomes. The expression of MACC1 protein and mRNA was detected by western blot and RT-PCR. Cell viability and invasion ability were measured by MTT and transwell assay, respectively. The expression of cyclin D1, cyclin E matrix metalloproteinase 2 (MMP2), MMP9 and the level of extracellular regulated protein kinases (ERK) phosphorylation was detected by western blot.ResultsCompared with siRNA NC, the expression of MACC1 protein and mRNA was down-regulated, cell viability and invasion ability were reduced (P< 0.01), cell cycle was arrested at G1 phase (P< 0.01), the expression of cyclin D1, cyclin E, MMP2, MMP9 and p-ERK1/2 was down-regulated (P< 0.01).ConclusionssiRNA MACC1 can inhibit proliferation and invasion of cervical cancer Hela cells, which migiht be related to down-regulation of p-ERK.

Metastasis-associated in colon cancer 1(MACC1); Cervical cancer; Proliferation; Invasion

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0080-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.016

2017-04-14

杜珍(1966-)，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：婦科宮腔鏡。E-mail: 1137232558@qq.com