石功德 周 靜 李 敏 虞 立 金偉鋒 李曉紅 張宇燕（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053）

基于R語言的益氣活血方藥中丹酚酸B提取工藝研究*

石功德 周 靜 李 敏 虞 立 金偉鋒 李曉紅 張宇燕△（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053）

目的應(yīng)用正交試驗法、R語言結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法優(yōu)化益氣活血方藥組方丹參中水溶性成分丹酚酸B的提取工藝。方法以丹酚酸B的提取率為指標，采用正交試驗設(shè)計方法進行提取考察。應(yīng)用R語言結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及遺傳算法對正交試驗數(shù)據(jù)進行目標尋優(yōu)，從而得到最佳提取工藝條件。結(jié)果丹酚酸B的最佳提取工藝條件為12倍體積的水，煎煮3次，每次1 h，提取液加乙醇使醇沉濃度達70%。網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值為110.52mg/g，驗證試驗平均值為116.174 mg/g，相對誤差為4.87%，具有良好的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測性。結(jié)論本實驗建立的丹酚酸B提取工藝的數(shù)學(xué)模型可用于丹酚酸B提取工藝的分析和預(yù)測，同時為實現(xiàn)中藥有效成分的目標尋優(yōu)提供新的參考。

R語言 丹酚酸B正交設(shè)計 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 提取工藝

益氣活血方藥是由黃芪、丹參、川芎等中藥組成，臨床用于治療缺血性中風(fēng)已取得較好的療效，其主要組成藥物丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，丹參具有擴張冠狀動脈，增加冠狀動脈血流量，防止心肌缺血和心肌梗死，加快微循環(huán)血流，促進毛細血管網(wǎng)開放，抑制心肌收縮，減少能量消耗，擴張血管，降低膽固醇、血脂，抑制凝血，激活纖溶，穩(wěn)定紅細胞膜，提高缺氧耐受力，增加肝臟血流量，保護肝損傷細胞，抗肝纖維化，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及消炎抗菌等作用[2-5]。其脂溶性成分具有抗菌、抗炎、抗氧化等藥理作用[6-7]。

丹參水溶性的酚酸成分主要有丹酚酸B，是研究較多的丹酚酸之一。丹酚酸B具有很強的抗氧化作用[8-10]，體內(nèi)外實驗證明，丹酚酸B能清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，其作用強度高于維生素C、維生素E、甘露醇，是目前已知的抗氧化作用最強的天然產(chǎn)物之一。藥理學(xué)研究表明，注射用丹參酚酸具有明顯的抗氧化、抑制血小板聚集及抑制血栓形成的作用，并能延長缺氧條件下動物的存活時間[11]。本實驗采用正交設(shè)計方法考察丹酚酸B的提取工藝，進而運用R語言并結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法對正交試驗所得數(shù)據(jù)進行分析處理，最后優(yōu)化得到丹酚酸B的最佳提取工藝，可為益氣活血方藥中藥新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)，也為含有丹參類藥材及丹酚酸B的中藥制劑工藝研究提供參考?，F(xiàn)報告如下。

1 試藥與儀器

密封式恒溫可調(diào)式電加熱器（FD-2型，嘉興市欣欣儀器設(shè)備有限公司）；低速離心機（SC-3610型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；電子天平（XS205型，梅特勒-托利多儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（UV-2800/2802/2802S，上海恒科儀器有限公司）。丹參：購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，經(jīng)檢驗為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。經(jīng)檢驗符合2015年版《中國藥典（一部）》丹參項下有關(guān)規(guī)定。丹酚酸B（批號：PA0418RA，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇，分析純，衢州巨氏試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品2.44mg，置25mL容量瓶中，加75%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成97.6μg/mL的丹酚酸B對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 將丹酚酸B提取濃縮液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用75%甲醇定容，搖勻。精密移取0.5 mL溶液至25 mL容量瓶中，75%甲醇定容，即為供試品溶液。

2.3 標準曲線的制備 精密吸取對照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5mL， 分別置10mL容量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻；286 nm處測定吸光度，以吸光度對質(zhì)量濃度進行線性回歸，得回歸方程y=56.276X-0.2240，R=0.9997，線性范圍4.88～43.92μg/mL。

2.4 精密度試驗 取丹酚酸B對照品，按上述含量測定方法檢測5次，測得吸收度。計算丹酚酸B吸收度的相對標準偏差RSD=0.34%，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 稱取丹酚酸B對照品，按上述含量測定法在0、2、4、6、8 h后檢測吸收度。計算丹酚酸B吸光度的相對標準偏差RSD為0.25%。

2.6 重復(fù)性試驗 稱取同一批樣品5份，按上述含量測定法進行測定，檢測丹酚酸B含量，計算丹酚酸B含量相對標準偏差RSD=1.35%，

2.7 加樣回收試驗 精密稱取6份已知含量的丹參粉末各0.3 g，按1∶1比例精密加入丹酚酸B對照品，按照供試品溶液制備方法制備樣品液，依次顯色后測定吸收度，計算加樣回收率為101.5%，RSD=1.34%。

2.8 丹參正交實驗及工藝優(yōu)化 稱取丹參藥材3 g，按照L9（34）正交試驗表進行實驗，以提取物中丹酚酸B含量為指標，考察影響水煎提取丹參的4個主要因素：加水量（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數(shù)（C）、醇沉濃度（D）（見表1），實驗結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果

2.9 R語言環(huán)境下BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模 本實驗在R語言下建立3層結(jié)構(gòu)（只有1個隱層）的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，輸入層節(jié)點數(shù)設(shè)置為4，分別是加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)及醇沉濃度，輸出節(jié)點數(shù)為1，即丹酚酸B的提取率。將正交試驗9組實驗數(shù)據(jù)分別采用留一法進行交叉驗證，相關(guān)參數(shù)分別設(shè)置為初始隨機權(quán)（rang）0.1，參數(shù)重量衰變（decay）5×10-5，最大迭代次數(shù)（maxit）500，其他參數(shù)設(shè)置為默認值。在此參數(shù)條件下對BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行留一法交叉訓(xùn)練，以平均擬合誤差和平均預(yù)測誤差作為選取隱層神經(jīng)元（size）的依據(jù)，結(jié)果如表3。由表3可知，隱層神經(jīng)元（size）為1時，平均擬合誤差、平均預(yù)測誤差均小于5%，具有統(tǒng)計學(xué)意義，而隱層神經(jīng)元為0、2、3時，不符合篩選條件。同時，隱層神經(jīng)元數(shù)增加到一定數(shù)目時，可能會產(chǎn)生過度擬合現(xiàn)象[4]。繼而在上述參數(shù)條件下，以正交試驗的9組數(shù)據(jù)為樣本，對不同個數(shù)的隱層神經(jīng)元（size）進行擬合誤差的訓(xùn)練，結(jié)果見表4。隨著隱層神經(jīng)元（size）個數(shù)的增加，擬合誤差呈先增大再降低的趨勢，由此可判斷為隱層神經(jīng)元 （size）1之后增加神經(jīng)元數(shù)將導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)模型擬合過度。因此，此次模型的隱層神經(jīng)元（size）設(shè)定為1，此時BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定可靠。

2.10 R語言環(huán)境中應(yīng)用遺傳算法進行目標優(yōu)化 遺傳算法是一種基于自然界優(yōu)勝劣汰的進化規(guī)律和基因遺傳學(xué)原理的優(yōu)化搜索方法。在“優(yōu)勝劣汰、適者生存”的生物進化論基礎(chǔ)上，遺傳算法將初始群體的全部個體進行編碼，按照一定的適配值函數(shù)及復(fù)制、交叉、突變等一系列遺傳操作對各個個體進行篩選，淘汰適應(yīng)度低的解，適應(yīng)度高的個體組成新的種群，重復(fù)此過程，直至滿足一定的極限條件。因此，遺傳算法可實現(xiàn)全局優(yōu)化搜索，且搜索能力較強，可避免繁瑣的數(shù)學(xué)公式推導(dǎo)和參數(shù)選擇。

表3 隱層神經(jīng)元（size）訓(xùn)練結(jié)果（%）

表4 隱層神經(jīng)元（size）測試訓(xùn)練結(jié)果

根據(jù)遺傳算法的基本思想，采用實數(shù)編碼方式，種群大小為1000，接近的最大代數(shù)為100，最大不可變代數(shù)為10，收斂公差為1×10-4，其他參數(shù)均設(shè)為默認值。運用R語言代碼進行編程，由遺傳算法得到的結(jié)果運行時間為1 s，運行到第12代時找到丹酚酸B的最佳提取條件為12倍體積的水，煎煮3次，每次1 h，提取液加乙醇使醇沉濃度達70%，此條件下得到的最優(yōu)提取率為110.52mg/g。

3 最佳工藝驗證

稱取15 g丹參5份，按照上述優(yōu)化后的條件，即12倍體積的水，煎煮3次，每次1 h，提取液加乙醇使醇沉濃度達70%，進行提取，按“標準曲線的制備”方法測定丹酚酸B的含量。結(jié)果見表5，丹酚酸B的平均提取含量116.174mg/g。實驗測量值和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值的相對誤差為4.87%，小于5%，說明優(yōu)化后實驗測量和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測較吻合，該數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定性良好，具有較好的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測性。

4 討 論

R語言是一種免費的為統(tǒng)計計算和圖形展現(xiàn)而設(shè)計的編程語言和統(tǒng)計環(huán)境，具有強大的數(shù)學(xué)統(tǒng)計分析和科學(xué)數(shù)據(jù)可視化功能，既可以提供各種數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析及圖形顯示工具，可通過編制相應(yīng)函數(shù)擴展現(xiàn)有的R語言的功能[12-13]，操作簡便，功能較為強大。但國內(nèi)醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)語言較陌生，且相應(yīng)出版物較少。在R環(huán)境中應(yīng)用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法對正交實驗數(shù)據(jù)進行目標尋優(yōu)及分析預(yù)測更是屈指可數(shù)[14-15]。

表5 最佳工藝驗證結(jié)果（mg/g）

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是通過反向傳播不斷地調(diào)整網(wǎng)絡(luò)權(quán)值和閾值的應(yīng)用最廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型之一[16-17]，為較好地處理復(fù)雜的非線性問題提供了選擇。它的學(xué)習(xí)規(guī)則是使用最速下降法，訓(xùn)練算法簡單明確、計算量小、并行性強，對于多維非線性系統(tǒng)參數(shù)優(yōu)化提供了選擇。正交設(shè)計僅僅考慮了幾個試驗點各因素對提取工藝的影響，未從整個試驗區(qū)間進行考慮，因此優(yōu)選出的參數(shù)往往是較優(yōu)而非最優(yōu)[9]。本次試驗將傳統(tǒng)的正交試驗數(shù)據(jù)與BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合將離散數(shù)據(jù)變?yōu)檫B續(xù)數(shù)據(jù)，通過網(wǎng)絡(luò)的仿真功能對試驗影響因素的變化進行仿真分析，模擬延伸正交試驗設(shè)計以外的實驗過程，反映各因素的變化規(guī)律，從而獲得多因素連續(xù)區(qū)域中的最優(yōu)提取組合。

本實驗采用正交設(shè)計對丹參中水溶性成分丹酚酸B提取工藝進行考察，進而運用R語言并結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法對正交試驗所得數(shù)據(jù)進行分析處理，最后優(yōu)化得到丹酚酸B的最佳提取工藝（12倍體積的水，煎煮3次，每次1 h，提取液加乙醇使醇沉濃度達70%），可為益氣活血方藥中藥新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)，也為含有丹參類藥材及丹酚酸B的中藥制劑工藝研究提供參考。

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Optimization Extraction Technique of Salvianolic Acid B in Yiqi Huoxue Decoction Based on R Language

SHI Gongde，ZHOU Jin，LIMin，et al.Zhejiang University of Chinese Medicine，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

Objective：To optimize the extraction technology of salvianolic acid B in Yiqi Huoxue Decoction with orthogonal experiment，R language，BP neural network and genetic algorithm.Methods：Taking the extraction rate of salvianolic acid B as the index，the orthogonal experimental design method was used to extract and investigate.R language，BP neural network and genetic algorithm were used to optimize the orthogonal experimental data，so as to obtain the optimum extraction process conditions.ResultsThe optimization of extraction technology was as follows：12 times of the volume of water were boiled for 3 times，each time for 1h，and the alcohol concentration reached 70%.The network predictive value was 110.52 mg/g；the experimental average value was 116.174 mg/g，and the relative error was 4.87%.So it had a good network prediction.ConclusionThis mathematical model can be used to analyze and predict the extraction technology of salvianolic acid B in Yiqi Huoxue Decoction，providing a new reference for screening optimization of Chinese medicine components.

R language；Salvianolic acid B；Orthogonal design；Neural network；Extraction

R289.5

A

1004-745X（2017）10-1700-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.10.003

浙江省自然科學(xué)基金項目（LR16H270001）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2017ZB024）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級科研基金項目（重點項目）（2017ZZ09）

△通信作者（電子郵箱：yannoo7376@sina.com）

2017-06-09）