羅單 張金娥 陳嶸祎 楊艷平 周英 樊翌明524001廣東湛江,廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科
小鼠念珠菌性陰道炎中維A酸相關(guān)孤兒受體、白細(xì)胞介素17表達(dá)
羅單 張金娥 陳嶸祎 楊艷平 周英 樊翌明524001廣東湛江,廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科
目的探討Th17/白細(xì)胞介素(IL)17軸在小鼠念珠菌性陰道炎發(fā)病中作用。方法120只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為雌激素感染組(Ei)、雌激素非感染組(En)、對(duì)照感染組(Ci)和對(duì)照非感染組(Cn)。Ei、En組在陰道接種前3 d于后腿皮下注射雌二醇0.05 mg,而Ci、Cn組皮下注射滅菌大豆油0.1 ml,以后隔日注射1次直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束;Ei、Ci組在接種日在陰道內(nèi)接種白念珠菌懸液10 μl(5×104個(gè)孢子),而En、Cn組陰道內(nèi)注入10 μl無(wú)菌磷酸鹽緩沖液。接種后3、7、14 d,每組于各時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)取10只小鼠處死,完整切取陰道組織作液氮冷凍或石蠟包埋,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT?PCR)、Western印跡和免疫熒光染色分別檢測(cè)陰道組織中維A酸相關(guān)孤兒受體(ROR)γt、RORα、IL?17 mRNA、蛋白表達(dá)及免疫熒光強(qiáng)度。結(jié)果激光共聚焦顯微鏡顯示,En、Cn組中RORγt、RORα和IL?17主要表達(dá)于陰道固有膜及血管中炎癥細(xì)胞,Ci組中主要表達(dá)于黏膜上皮及其表面附著的菌絲、固有膜及血管中炎癥細(xì)胞,Ei組中則廣泛分布于黏膜上皮、固有膜及血管中炎癥細(xì)胞、陰道腔和黏膜上皮中內(nèi)吞菌絲。qRT?PCR和免疫熒光檢查顯示,En、Ci和Ei組中RORγt、RORα、IL?17 mRNA表達(dá)及其免疫熒光強(qiáng)度在相同時(shí)間點(diǎn)均顯著高于Cn組(均P<0.05),且Ei組顯著高于En、Ci組(P< 0.05);除Cn組外,其余各組中RORγt、RORα、IL?17 mRNA表達(dá)及其免疫熒光強(qiáng)度均隨時(shí)間延長(zhǎng)有增加的趨勢(shì),其中RORγt、RORα mRNA和免疫熒光強(qiáng)度及IL?17 mRNA一般在14 d時(shí)最高,而IL?17免疫熒光強(qiáng)度在7 d時(shí)最高(P< 0.05)。Western印跡顯示,Ci、Ei組中RORγt和IL?17蛋白表達(dá)在相同時(shí)間點(diǎn)均明顯高于Cn、En組(RORγt:F組別=45.685,P< 0.001;IL?17:F組別=29.655,P< 0.01),其中Ei組表達(dá)水平最高(P< 0.05),而Cn、En組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05);Ci、Ei組中二者表達(dá)均在感染后7 d明顯上調(diào),14 d無(wú)顯著增加(RORγt:F時(shí)間=13.137,P< 0.001;IL?17:F時(shí)間=11.182,P< 0.001)。結(jié)論陰道念珠菌感染可上調(diào)RORγt、RORα、IL?17表達(dá),提示Th17/IL?17軸可能參與BALB/c小鼠念珠菌性陰道炎發(fā)生。
念珠菌病,外陰陰道;白色念珠菌;雌激素類;核受體亞家族1,F(xiàn)組,成員3;白細(xì)胞介素17;小鼠;維A酸相關(guān)孤兒受體
初始CD4+T細(xì)胞可分化為Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞。Th17細(xì)胞主要產(chǎn)生白細(xì)胞介素17(IL?17)、IL?17F、IL?21、IL?22等細(xì)胞因子[1]。維A酸相關(guān)孤兒受體(ROR)γt是調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化的主要轉(zhuǎn)錄因子,而RORα起協(xié)同作用[2]。Th17免疫應(yīng)答與念珠菌感染部位有關(guān),其在念珠菌性陰道炎(VC)發(fā)病中作用存在較大爭(zhēng)議。Th17/IL?17軸是抵御口咽、皮膚和系統(tǒng)性念珠菌感染的關(guān)鍵通路,但其在小鼠胃腸道念珠菌病中加重組織損傷[3]。在小鼠VC模型中,Yano等[4]認(rèn)為炎癥反應(yīng)與Th17免疫應(yīng)答無(wú)關(guān),而Pietrella等[5]發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞和IL?17具有保護(hù)作用。我們?cè)貌煌瑒┝浚恐?.15 mg或0.3 mg)雌激素皮下注射建立了小鼠VC模型,發(fā)現(xiàn)雌激素處理可增加陰道載菌量和感染、炎癥反應(yīng)程度[6]。本研究用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT?PCR)、Western印跡法和免疫熒光染色檢測(cè)陰道組織中RORγt、RORα、IL?17表達(dá),探討Th17/IL?17軸在小鼠VC模型中的作用。
1.動(dòng)物、菌株及主要試劑、儀器:8~10周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠、白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株(CGMCC 2.2411)分別購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心、中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。羊抗小鼠IL?17(sc?6077)、羊抗小鼠 RORα(sc?26380)、兔抗小鼠RORγt(sc?28559)、FITC?驢抗兔 IgG(sc?2090)、RB200?雞抗羊 IgG(sc?2860)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);大鼠抗小鼠RORγt(14?6981)抗體(美國(guó)eBioscience公司);兔抗小鼠IL?17(ab?79056)、兔抗小鼠β?actin(ab8227)、HRP標(biāo)記羊抗兔(ab6721)抗體(美國(guó)Abcam公司);HRP標(biāo)記山羊抗大鼠IgG(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Trizol(美國(guó)Invitrogen公司);SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司];T?PER動(dòng)物組織蛋白抽提試劑、BCA蛋白定量試劑盒、SuperSignal?化學(xué)發(fā)光底物(美國(guó)Thermo Scientific公司);TCS SP5Ⅱ激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司);LightCycler?480熒光定量PCR(瑞士Roche公司)。
2.小鼠分組及VC模型構(gòu)建:參照文獻(xiàn)[6],120只小鼠按照隨機(jī)分配表隨機(jī)分為雌激素感染組(Ei)、雌激素非感染組(En)、對(duì)照感染組(Ci)、對(duì)照非感染組(Cn),每組30只。Ei、En組在陰道接種前3 d于后腿皮下注射雌二醇0.05 mg,而Ci、Cn組皮下注射滅菌大豆油0.1 ml,以后隔日注射1次直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。Ei、Ci組在接種日取白念珠菌懸液10 μl(5×104個(gè)孢子)陰道內(nèi)灌注并倒置5 min,而En、Cn組陰道內(nèi)注入10 μl無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)。接種后3、7、14 d,每組于各時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)取10只小鼠斷頸處死,完整切取陰道組織,其中4只用液氮冷凍作qRT?PCR,3只液氮冷凍作Western印跡,3只石蠟包埋作免疫熒光染色。
1.qRT?PCR 檢測(cè)陰道組織中RORγt、RORα、IL?17 mRNA的表達(dá):小鼠陰道組織研磨成粉,用Trizol提取總RNA,用RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。RORα引物:正向5′?GCTTCTTCCCCTACTGTTCCTT?3′,反向 5′?TCACCTCTCTCTGCTTGTTCTG?3′,共87 bp;RORγt引物:正向5′?GAAAGCAGGAGCAATG GAAGT?3′,反向5′?GCTGAGGAAGTGGGAAAAGTC?3′,共166 bp;IL?17引物:正向5′?GTGTCAATGCGG AGGGAAAG?3′,反向 5′?GCATCTTCTCGACCCTGA AA?3′,共120 bp;β肌動(dòng)蛋白引物:正向5′?TCCGTA AAGACCTCTATGCCAACA?3′,反向5′?GCTAGGAG CCAGAGCAGTAATCTC?3′,共104 bp。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火/延伸34 s,40個(gè)循環(huán);每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)。β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照,用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。
2.免疫熒光雙標(biāo)染色檢測(cè)陰道組織中RORγt、RORα、IL?17免疫熒光強(qiáng)度:切片脫蠟至水,浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中微波修復(fù)抗原10 min;10%牛血清蛋白室溫封閉抗原20 min,滴加預(yù)混勻一抗50 μl,即兔抗鼠RORγt+ 羊抗鼠RORα/羊抗鼠IL?17(工作濃度均為1∶100),4℃過(guò)夜后,37 ℃濕盒內(nèi)孵育2 h,PBS洗3次;滴加預(yù)混勻FITC?驢抗兔IgG+RB200?雞抗羊IgG(工作濃度均為1∶200)50 μl,37℃濕盒內(nèi)避光孵育1 h,PBS洗3次;抗熒光淬滅封片液封片,激光共焦聚顯微鏡觀察,F(xiàn)ITC和RB200激發(fā)波長(zhǎng)分別為495 nm、570 nm。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野拍攝照片,計(jì)算每個(gè)標(biāo)本平均熒光值。
3.Western印跡檢測(cè)陰道組織中RORγt、IL?17蛋白的表達(dá):T?PER動(dòng)物組織蛋白抽提試劑提取陰道組織蛋白質(zhì),BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)總蛋白水平。SDS?PAGE電泳90 min,轉(zhuǎn)膜2 h。5%牛血清蛋白室溫封閉2 h,分別用RORγt(1∶500)、IL?17(1∶250)、β肌動(dòng)蛋白(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜;0.5‰ TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記抗兔IgG(1∶2 000)或抗鼠IgG(1∶2 000)室溫孵育1 h;0.5‰ TBST洗膜后用Super Signal?化學(xué)發(fā)光底物顯色3~5 min,X線膠片曝光后作顯影、定影處理。用Uniscan A686掃描膠片,Image J軟件分析目的條帶與β肌動(dòng)蛋白吸光度A值。每個(gè)樣本重復(fù)3次取均值。
用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,數(shù)據(jù)以±s表示。用Univariate方差分析,兩兩比較用SNK檢驗(yàn)。
激光共聚焦顯微鏡顯示(圖1),F(xiàn)ITC標(biāo)記RORγt發(fā)出綠色熒光,RB200標(biāo)記RORα或IL?17發(fā)紅色熒光,RORγt+RORα或IL?17雙標(biāo)染色顯示桔黃色熒光。En、Cn組中RORγt、RORα和IL?17主要表達(dá)于陰道固有膜及血管中炎癥細(xì)胞,Ci組中主要表達(dá)于黏膜上皮及其表面附著的菌絲、固有膜及血管中炎癥細(xì)胞,Ei組中則廣泛分布于黏膜上皮、固有膜及血管中炎癥細(xì)胞、陰道腔和黏膜上皮中內(nèi)吞菌絲。各組小鼠在接種白念珠菌或PBS后3、7、14 d,RORγt、RORα、IL?17、RORγt+RORα 和 RORγt+IL?17免疫熒光強(qiáng)度均隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng);而相同時(shí)間下,Cn、En、Ci和Ei組中RORγt、RORα、IL?17、RORγt+RORα和RORγt+IL?17免疫熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)。
qRT?PCR和免疫熒光檢查顯示(表1~ 3),En、Ci和Ei組中RORγt、RORα、IL?17 mRNA表達(dá)及其免疫熒光強(qiáng)度在相同時(shí)間點(diǎn)均明顯高于Cn組(P<0.05),且Ei組一般顯著高于En、Ci組(P< 0.05);除Cn組外,其余各組中RORγt、RORα、IL?17 mRNA表達(dá)及其免疫熒光強(qiáng)度均有隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加的趨勢(shì),其中RORγt、RORα mRNA和免疫熒光強(qiáng)度及IL?17 mRNA一般在14 d時(shí)最高,而IL?17免疫熒光強(qiáng)度在7 d時(shí)最高(P<0.05)。
Ci、Ei組中RORγt和IL?17蛋白表達(dá)在相同時(shí)間點(diǎn)均明顯高于Cn、En組(RORγt:F組別=45.685,P< 0.001;IL?17:F組別=29.655,P< 0.01),其中Ei組表達(dá)水平最高(P<0.05),而Cn、En組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。Ci、Ei組中RORγt和IL?17蛋白表達(dá)均在感染白念珠菌后7 d明顯上調(diào),14 d無(wú)增加(RORγt:F時(shí)間=13.137,P< 0.001;IL?17:F時(shí)間=11.182,P< 0.001)。
圖1 各組小鼠接種白念珠菌或PBS 14 d RORγt、IL?17、RORα免疫熒光結(jié)果 綠色熒光表示FITC標(biāo)記RORγt,紅色熒光表示RB200標(biāo)記IL?17或RORα,桔黃色熒光表示RORγt+IL?17或RORα雙標(biāo)染色;Hy:菌絲;ME:黏膜上皮,LP:固有膜;對(duì)照非感染組(Cn組,× 400):RORγt、RORα、IL?17表達(dá)及RORγt+RORα、RORγt+IL?17雙標(biāo)染色見(jiàn)于陰道固有膜和血管中炎癥細(xì)胞;雌激素非感染組(En組,× 400):RORγt、RORα、IL?17表達(dá)及RORγt+RORα、RORγt+IL?17雙標(biāo)染色也見(jiàn)于陰道固有膜和血管中炎癥細(xì)胞;對(duì)照感染組(Ci組,× 200):RORγt、IL?17和RORα表達(dá)在黏膜上皮、固有膜及血管中炎癥細(xì)胞,而RORγt+IL?17和RORγt+RORα雙標(biāo)染色僅見(jiàn)于炎癥細(xì)胞;雌激素感染組(Ei組,× 200):RORγt、RORα和IL?17廣泛表達(dá)在黏膜上皮及內(nèi)吞菌絲、固有膜及血管中炎癥細(xì)胞,而RORγt+RORα和RORγt+IL?17雙標(biāo)染色僅見(jiàn)于炎癥細(xì)胞;Cn、En、Ci、Ei組中RORγt、RORα、IL?17、RORγt+RORα、RORγt+IL?17免疫熒光強(qiáng)度均逐漸增強(qiáng)
表1 各組小鼠感染白念珠菌3、7、14 d后陰道組織中RORγt mRNA表達(dá)及其免疫熒光強(qiáng)度(±s)
表1 各組小鼠感染白念珠菌3、7、14 d后陰道組織中RORγt mRNA表達(dá)及其免疫熒光強(qiáng)度(±s)
注:n=3。Cn組:對(duì)照非感染組;En組:雌激素非感染組;Ci組:對(duì)照感染組;Ei組:雌激素感染組;F1:時(shí)間因素的效應(yīng)大??;F2:分組因素的效應(yīng)大小;SNK檢驗(yàn)顯示,a:與相同時(shí)間點(diǎn)Cn組相比,P<0.05;b:與相同時(shí)間點(diǎn)En組相比,P<0.05;c:與相同時(shí)間點(diǎn)Ci組相比,P<0.05;d:與同組別3d時(shí)相比,P<0.05;e:與同組別7d時(shí)相比,P<0.05
組別Cn組En組Ci組Ei組F1值P值mRNA表達(dá)(n=4)3 d 1.00 1.21±0.09a 1.36±0.15a 2.17±0.23abc 7 d 1.00 2.64±0.73ad 3.04±0.74ad 7.04±1.55abcd 128.062<0.001 14 d 1.00 3.49±0.47ade 3.74±0.47ade 33.40±5.41abcde F2值162.079 P值<0.001免疫熒光強(qiáng)度(n=3)3 d 2.09±0.29 3.69±0.56a 4.11±0.46ab 8.66±1.13abc 7 d 1.91±0.29 3.76±0.47a 5.32±0.56abd 11.63±0.53abcd 203.456<0.001 14 d 2.13±0.22 6.49±0.71ade 10.72±1.10abde 33.90±3.37abcde F2值338.63 P值<0.001
小鼠VC模型的建立和維持需要每周皮下注射雌激素0.01 ~ 0.5 mg維持假發(fā)情狀態(tài)[6?7]。我們?cè)缙谘芯浚?]發(fā)現(xiàn),感染組小鼠菌落計(jì)數(shù)在接種后3 d最高,7 d、14 d明顯減少,21 d基本消失,而陰道黏膜炎癥反應(yīng)在7 d時(shí)明顯,14 d、21 d加重。Fidel[7]的研究也指出,陰道接種白念珠菌后7~14 d可誘發(fā)明顯T細(xì)胞應(yīng)答。因此,我們后續(xù)研究選擇接種后3 d、7 d、14 d進(jìn)行觀察。
表2 各組小鼠感染白念珠菌3、7、14 d后陰道組織中RORα mRNA表達(dá)及其免疫熒光強(qiáng)度(±s)
表2 各組小鼠感染白念珠菌3、7、14 d后陰道組織中RORα mRNA表達(dá)及其免疫熒光強(qiáng)度(±s)
注:n=3。Cn組:對(duì)照非感染組;En組:雌激素非感染組;Ci組:對(duì)照感染組;Ei組:雌激素感染組;F1:時(shí)間因素的效應(yīng)大??;F2:分組因素的效應(yīng)大??;SNK檢驗(yàn)顯示,a:與相同時(shí)間點(diǎn)Cn組相比,P<0.05;b:與相同時(shí)間點(diǎn)En組相比,P<0.05;c:與相同時(shí)間點(diǎn)Ci組相比,P<0.05;d:與同組別3 d時(shí)相比,P< 0.05;e:與同組別7 d時(shí)相比,P< 0.05
組別F2值P值F2值P值Cn組En組Ci組Ei組F1值P值mRNA表達(dá)(n=4)3 d 1.00 1.24±0.23a 1.54±0.23a 2.37±0.60abc 7 d 1.00 2.11±0.37ad 2.43±0.40ad 7.10±1.01abcd 147.875<0.001 14 d 1.00 3.24±0.25ade 3.92±0.49ade 16.06±2.17abcde238.418<0.001免疫熒光強(qiáng)度(n=3)3 d 1.67±0.46 2.85±0.58a 4.00±0.67ab 5.92±0.19abc 7 d 1.84±0.41 4.19±0.82ad 4.67±0.40a 9.09±0.83abcd 108.969<0.001 14 d 1.89±0.43 4.52±0.44ad 7.81±0.73abde 16.48±1.43abcde 262.036<0.001
表3 各組小鼠感染白念珠菌3、7、14 d后陰道組織中IL?17 mRNA表達(dá)及其免疫熒光強(qiáng)度(±s)
表3 各組小鼠感染白念珠菌3、7、14 d后陰道組織中IL?17 mRNA表達(dá)及其免疫熒光強(qiáng)度(±s)
注:n=3。Cn組:對(duì)照非感染組;En組:雌激素非感染組;Ci組:對(duì)照感染組;Ei組:雌激素感染組;F1:時(shí)間因素的效應(yīng)大?。籉2:分組因素的效應(yīng)大??;SNK檢驗(yàn)顯示,a:與相同時(shí)間點(diǎn)Cn組相比,P<0.05;b:與相同時(shí)間點(diǎn)En組相比,P<0.05;c:與相同時(shí)間點(diǎn)Ci組相比,P<0.05;d:與同組別3 d時(shí)相比,P< 0.05;e:與同組別7 d時(shí)相比,P< 0.05
組別Cn組En組Ci組Ei組F1值P值mRNA表達(dá)(n=4)3 d 1.00 1.34±0.26a 1.50±0.27a 2.14±0.38abc P值<0.001 14 d 1.00 3.14±0.30ade 3.59±0.45ade 42.38±2.81abcde F2值877.902免疫熒光強(qiáng)度(n=3)3 d 1.72±0.54 3.48±0.68a 4.29±1.10a 10.48±1.68abc F2值77.137 7 d 1.93±0.43 4.78±0.56ad 5.08±0.96ad 13.02±1.05abcd 4.396<0.05 P值<0.001 14 d 2.18±0.17 6.50±1.24ad 8.53±0.98ad 8.09±2.81ab
圖2 Western印跡檢測(cè)各組RORγt和IL?17蛋白表達(dá) 1:對(duì)照非感染組;2:雌激素非感染組;3:對(duì)照感染組;4:雌激素感染組
小鼠VC模型中Th17免疫應(yīng)答報(bào)道不一,可能與小鼠遺傳背景、白念珠菌菌株、造模方法不同有關(guān)。Th17缺陷型及野生型C57BL/6小鼠VC模型陰道灌洗液中缺乏Th17相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)[4]。CD1小鼠VC模型陰道灌洗液中IL?17含量在感染后2 d升高,14 d達(dá)高峰,5周恢復(fù)基線水平[5]。本研究結(jié)果顯示,感染組中RORγt、RORα、IL?17表達(dá)明顯高于非感染組,其表達(dá)趨勢(shì)與炎癥反應(yīng)一致。鑒于IL?17通過(guò)募集中性粒細(xì)胞到達(dá)感染部位和上調(diào)黏膜表達(dá)β防御素、抗菌肽,介導(dǎo)宿主抗真菌免疫[3,9],提示Th17細(xì)胞和IL?17在BALB/c小鼠VC發(fā)生中起重要作用。
RORγt和RORα可協(xié)同誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化(以RORγt為主),還可分別促進(jìn)3型、2型固有淋巴樣細(xì)胞(ILC)發(fā)育,其中3型ILC產(chǎn)生IL?17A、IL?17F和IL?22,2型ILC分泌IL?5和IL?13[2]。我們發(fā)現(xiàn)各組中IL?17表達(dá)趨勢(shì)與RORγt、RORα基本一致;Ei組中RORγt水平在感染后14 d明顯高于RORα,而其他時(shí)間點(diǎn)二者表達(dá)相似。這些結(jié)果提示RORγt、RORα均可促進(jìn)VC小鼠陰道組織中Th17細(xì)胞、ILC分化和IL?17產(chǎn)生。
除Th17細(xì)胞外,恒定型自然殺傷T細(xì)胞(iNKT)、3型ILC、γδ T細(xì)胞、自然Th17細(xì)胞也可產(chǎn)生IL?17[2?3]。健康婦女陰道上皮組織中 T 淋巴細(xì)胞密度估計(jì)為240個(gè)/mm2,局部抗原刺激誘導(dǎo)的炎癥性細(xì)胞因子可能促使大多數(shù)T細(xì)胞遷移至陰道上皮。小鼠VC模型陰道灌洗液中IL?17主要由陰道CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生,而早期表達(dá)IL?17可能來(lái)源于中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞[5]。本研究顯示,感染組中IL?17免疫熒光廣泛分布于黏膜和炎癥細(xì)胞,提示黏膜上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞均可產(chǎn)生IL?17。此外,我們發(fā)現(xiàn)陰道腔內(nèi)菌絲和黏膜上皮中內(nèi)吞菌絲均有IL?17、ROR免疫熒光,驗(yàn)證了IL?17A可與腸道或陰道分離的白念珠菌結(jié)合[10]。盡管白念珠菌中Crh11p蛋白可能是IL?17A結(jié)合部位[10],但ROR的結(jié)合部位尚待進(jìn)一步研究。
本研究還發(fā)現(xiàn),En組中RORγt、RORα、IL?17 mRNA表達(dá)和免疫熒光強(qiáng)度均在處理后3 d高于Cn組。盡管雌激素是誘導(dǎo)和維持小鼠VC的前提[6?7],為何En組中也有ROR和IL?17表達(dá)上調(diào),其原因不明。一般而言,較低生理量雌激素促進(jìn)I型干擾素(IFN)和促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生,而較高或超生理量雌激素上調(diào)抗炎性細(xì)胞因子表達(dá)[11]。雌激素對(duì)陰道黏膜免疫的作用包括抑制上皮細(xì)胞提呈抗原、降低分泌物中免疫球蛋白水平、減少上皮細(xì)胞介導(dǎo)抗念珠菌活性[12]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示,雌二醇下調(diào)白念珠菌誘導(dǎo)脾細(xì)胞產(chǎn)生IL?17A[13]。在小鼠脾細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化模型中,我們發(fā)現(xiàn)雌二醇通過(guò)雌激素受體α募集雌激素受體活性阻遏物到RORγt啟動(dòng)子上雌激素反應(yīng)元件,從而抑制RORγt表達(dá)和Th17細(xì)胞分化[1]。相反,Khan等[14]對(duì)性腺切除術(shù)后C57BL/6小鼠植入含有17β雌二醇硅膠囊緩釋劑2個(gè)月,發(fā)現(xiàn)雌激素可上調(diào)脾細(xì)胞表達(dá)RORγt、IL?17。在小鼠VC模型中,單用雌激素處理1周引起小鼠陰道淋巴細(xì)胞逐漸增多,但與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性,此后2周內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)基本不變[15];單用雌激素處理2周時(shí)炎癥反應(yīng)明顯增加[6];單用雌激素可上調(diào)IL?1β、COX?2、NF?κB表達(dá)[16]。因此,鑒于非感染組中僅有炎癥細(xì)胞出現(xiàn)RORγt、RORα、IL?17免疫熒光,我們推測(cè)非感染組中ROR和IL?17高表達(dá)可能與雌激素誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。
綜上所述,本文結(jié)果顯示陰道念珠菌感染可上調(diào)RORγt、RORα、IL?17表達(dá),提示Th17/IL?17軸可能參與BALB/c小鼠VC發(fā)生,但需要應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)造模方法、基因敲除小鼠等試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。
志謝廣東醫(yī)科大學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室倪少凱副教授進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)指導(dǎo)
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Expression of retinoic acid?related orphan receptors and interleukin?17 in mice with vaginal candidiasis
Luo Dan,Zhang Jin′e,Chen Rongyi,Yang Yanping,Zhou Ying,Fan Yiming
Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,Guangdong,China
Fan Yiming,Email:ymfan1963@163.com
ObjectiveTo investigate the role of T helper 17 cells/interleukin?17(Th17/IL?17)axis in the occurrence of vaginal candidiasis in mice.MethodsA total of 120 female BALB/c mice were randomly and equally divided into Ei,En,Ci and Cn groups.Three days before vaginal inoculation,estrogen(Ei and En)groups and control(Ci and Cn)groups
subcutaneous injection of 0.05 mg estradiol and 0.1 ml sterilized soybean oil at the hind legs,respectively,and then the hormone treatment continued every other day until the end of experiment.Infected(Ei and Ci)groups and noninfected(En and Cn)groups were inoculated intravaginally with 10 μl(5 × 104conidia)ofCandida albicanssuspension and 10 μl of sterilized phosphate?buffered saline,respectively.Ten mice were randomly selected from each group and sacrificed on day 3,7 and 14 after inoculation.The intact vagina tissues were resected and then frozen in liquid nitrogen or embedded in paraffin.Real?time fluorescence?based quantitative PCR(qRT?PCR)and immunofluorescent staining were performed to measure mRNA expression and immunofluorescence intensities of retinoic acid?related orphan receptorγt(RORγt),RORα and IL?17,respectively.Western blot analysis was conducted to determine protein expression of RORγt and IL?17.ResultsLaser scanning confocal microscopy showed that RORγt,RORα and IL?17 immunofluorescence was mainly located at inflammatory cells of the lamina propria and blood vessels in En and Cn groups,at mucosal epithelium,adherent hyphae,and inflammatory cells of the lamina propria and blood vessels in Ci group,and at mucosal epithelium,vaginal canal and endocytosed hyphae,and inflammatory cells of the lamina propria and blood vessels in Ei group.qRT?PCR and immunofluorescent staining uncovered that mRNA expression and immunofluorescence intensities of RORγt,RORα and IL?17 were significantly higher in En,Ci and Ei groups than in Cn group at the same time points(allP< 0.05),as well as in the Ei group than in En and Ci groups(bothP< 0.05),and were increased gradually over time in En,Ci and Ei groups,but not in the Cn group.Additionally,mRNA expression and immunofluorescence intensities of RORγt and RORα and IL?17 generally peaked on day 14 after inoculation,while the immunofluorescence intensity of IL?17 peaked on day 7(P< 0.05).Western blot analysis revealed that protein expression of RORγt and IL?17 was significantly higher in the infected(Ei and Ci)groups than in the noninfected(En and Cn)groups at the same time points(RORγt:F=45.685,P< 0.001;IL?17:F=29.655,P< 0.01),and was highest in the Ei group(P< 0.05);however,no significant differences were observed between Cn and En groups(bothP>0.05).Moreover,RORγt and IL?17 protein expression in Ci and Ei groups was obviously up?regulated on day 7 after inoculation(RORγt:F=13.137,P< 0.001;IL?17:F=11.182,P< 0.001),but was not increased further on day 14.ConclusionVaginal candida infection can up?regulate the expression of RORγt,RORα and IL?17,suggesting that Th17/IL?17 axis may be involved in the occurrence of vaginal candidiasis in BALB/c mice.
Candidiasis,vulvovaginal;Candida albicans;Estrogens;Nuclear receptor subfamily 1,group F,member 3;Interleukin?17;Mice;Retinoic acid?related orphan receptors
樊翌明,Email:ymfan1963@163.com
10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.01.009
國(guó)家自然科學(xué)基金(81171512)
Fund program:National Natural Science Foundation of China(81171512)
2016?03?31)
(本文編輯:周良佳 顏艷)