馬曉蕾 高那 劉政邑 張建中

100044北京大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科（馬曉蕾、張建中）；北京大學(xué)國際醫(yī)院（馬曉蕾、高那、劉政邑）

苯烯莫德對特應(yīng)性皮炎患者外周血單個核細(xì)胞白細(xì)胞介素4和10、γ干擾素、T細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子β水平的影響

馬曉蕾 高那 劉政邑 張建中

100044北京大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科（馬曉蕾、張建中）；北京大學(xué)國際醫(yī)院（馬曉蕾、高那、劉政邑）

目的探討特應(yīng)性皮炎（AD）患者外周血單個核細(xì)胞（PBMC）培養(yǎng)上清液分泌的白細(xì)胞介素4（IL?4）、γ干擾素（IFN?γ）、白細(xì)胞介素10（IL?10）和T細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子β（TGF?β）水平，及苯烯莫德對這些因子的調(diào)節(jié)作用。方法分離培養(yǎng)20例AD患者和20例健康對照的外周血單個核細(xì)胞，再將20例AD患者外周血單個核細(xì)胞等分為4組，分別給以磷酸緩沖鹽液（PBS），400 nmol/L苯烯莫德溶液，250 nmol/L地塞米松溶液，10 nmol/L他克莫司溶液共培養(yǎng)后，酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液分泌IL?4、IFN?γ、IL?10、TGF?β的水平。結(jié)果AD組和健康對照組外周血IL?4濃度分別為（83.4 ±12.2）pg/ml和（44.3 ± 5.7）pg/ml，兩組比較，P＜0.05；TGF?β濃度分別為（178.9 ± 17.40）pg/ml和（158.7±18.30）pg/ml，兩組比較，P＞0.05。AD組和健康對照組外周血IFN?γ濃度分別為（12.5±2.3）pg/ml和（25.4± 3.4）pg/ml，兩組比較，P＜0.05；IL?10濃度分別為（144.4± 4.1）pg/ml和（189.9± 6.5）pg/ml，兩組比較，P＜0.05。400 nmol/l苯烯莫德可降低AD患者外周血IL?4、IL?10、IFN?γ的含量，PBS對照組和苯烯莫德組IL?4濃度分別為（83.3 ± 12.2）pg/ml和（50.2 ± 10.1）pg/ml，兩組比較，P＜0.05；IL?10的濃度分別為（144.4±4.1）pg/ml和（124.7±17.5）pg/ml，兩組比較，P＞0.05；IFN?γ的濃度分別為（12.5±2.3）pg/ml和（9.56±5.1）pg/ml，兩組比較，P＞0.05。苯烯莫德組與地塞米松組，他克莫司組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。苯烯莫德組可升高PBS對照組AD患者外周血TGF?β含量，PBS對照組和BVM組TGF?β的濃度分別為（178.9±17.4）pg/ml和（203.6±15.3）pg/ml，兩組比較，P＞0.05。苯烯莫德組與地塞米松組，他克莫司組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論苯烯莫德可調(diào)節(jié)AD患者外周血PBMC IL?4、IFN?γ、IL?10和TGF?β的表達(dá)水平。

皮炎，特應(yīng)性；白細(xì)胞介素4；白細(xì)胞介素10；干擾素γ；淋巴毒素α；苯烯莫德

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD），是一種反復(fù)發(fā)作伴有劇烈瘙癢的慢性炎癥性皮膚病，兒童患病率為15%～30%，成人患病率為2%～10%［1］。關(guān)于特應(yīng)性皮炎的治療，2012年英國特應(yīng)性皮炎診療指南中提出：局部外用糖皮質(zhì)激素及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑是特應(yīng)性皮炎的一線療法。糖皮質(zhì)激素長期應(yīng)用會產(chǎn)生多毛，局部皮膚變薄，毛細(xì)血管擴(kuò)張等副作用，因此，研制非激素類的新型免疫調(diào)節(jié)劑成為熱點(diǎn)。苯烯莫德（benvitimod）為一種小分子化合物，在一項(xiàng)為期12周的多中心安慰劑對照的雙盲臨床實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，外用苯烯莫德乳膏對中重度特應(yīng)性皮炎有一定的治療作用［2］。我們前期研究結(jié)果表明：苯烯莫德溶液可抑制人外周血單個核細(xì)胞（PBMC）增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并可以負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞NF?κB通路［3］。為進(jìn)一步探討苯烯莫德對特應(yīng)性皮炎患者治療作用，我們檢測苯烯莫德溶液對特應(yīng)性皮炎外周血單個核細(xì)胞（PBMC）分泌細(xì)胞因子的影響。

對象與方法

1.對象：AD患者20例，年齡18～65歲，平均43.2歲，符合Williams關(guān)于AD診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。健康對照20例，年齡22～52歲，平均37.8歲，來源于召募的健康志愿者。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有可比性。經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書后，取外周血5 ml，經(jīng)密度梯度離心法獲得PBMC。

2.資料：苯烯莫德原料由北京文豐天濟(jì)藥業(yè)有限公司提供，將其用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成100 mmol/L的儲存液，保存于-20℃冰箱中。使用前用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋成2 mmol/L的工作液，再用此工作液加入PBS進(jìn)一步稀釋成400 nmol/L工作液。地塞米松購自美國Sigma公司，先用DMSO溶解配成濃度為100 mmol/L儲存液，保存于-20℃冰箱中，使用前用PBS逐步稀釋成終濃度為250 nmol/L的工作液。他克莫司購自美國Sigma公司，先用DMSO溶解配成濃度為100 mmol/L儲存液，保存于-20℃冰箱中，使用前用PBS逐步稀釋成終濃度為10 nmol/L的工作液，DMSO在以上工作液中的終濃度＜0.1%，其對細(xì)胞的影響可忽略不計(jì)。人白細(xì)胞介素（IL）10、IL?4、γ干擾素（IFN?γ）、和轉(zhuǎn)化因子β（TGB?β）ELISA檢測試劑盒購自美國eBioscience公司。

3.方法：單個核細(xì)胞分離：取20例患者及20例健康對照肝素抗凝血5 ml，加入淋巴細(xì)胞分離液，離心1 600×g，15 min，用滴管吸出單個核細(xì)胞，加入5 ml PBS混勻，離心4 800×g，5 min，棄上清液，用含10%的胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞密度為1×106/ml。

單個核細(xì)胞培養(yǎng)及分組加藥處理：上述單個核細(xì)胞以每孔1 ml，5×106/ml的密度接種于24孔板中，將20例AD患者的單個核細(xì)胞均分4孔（PBS對照組，苯烯莫德溶液組，地塞米松溶液組，他克莫司溶液組），在37℃、5%CO2環(huán)境下孵育24 h，取 900 μl，每孔分別加入濃度4 μmol/L苯烯莫德溶液，2.5 μmol/L地塞米松溶液，100 nmol/L他克莫司溶液，及PBS溶液100 μl，使苯烯莫德終濃度為400 nmol/L，地塞米松終濃度為250 nmol/L，他克莫司終濃度為10 nmol/L。37℃、5%CO2環(huán)境下繼續(xù)孵育24 h，離心收取細(xì)胞上清液。樣本收齊后進(jìn)行IL?4、IFN?γ、TGF?β、IL?10濃度的檢測。

上清液細(xì)胞因子的檢測：將標(biāo)準(zhǔn)品用1 ml標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液溶解，然后按需進(jìn)行稀釋，IL?4、IFN?γ、TGF?β、IL?10按照濃度梯度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將不同濃度的標(biāo)本100 μl分別加入相應(yīng)孔中，37℃孵育箱60 min，洗板5次，加入生物素化抗體100 μl，封板，37℃孵育箱60 min，洗板5次，加入酶結(jié)合物工作液100 μl，洗板，37 ℃孵育箱60 min，洗板5次，加入顯色液100 μl，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液，混勻在酶標(biāo)儀上讀數(shù)A450值，計(jì)算細(xì)胞因子濃度。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用±s表示。組間的比較用ANOVA和Student Newman Keuls Test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

AD患者外周血IL?4、TGF?β水平較健康對照組高，而IFN?γ、IL?10水平比健康對照組低。與健康對照組比較，IL?4、IFN?γ、IL?10差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TGF?β的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同PBS對照組相比，苯烯莫德可以抑制AD患者外周血PBMC中IL?4、IL?10、IFN?γ的產(chǎn)生，其中IL?4降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。苯烯莫德對AD患者外周血PBMC TGF?β的產(chǎn)生有一定促進(jìn)作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。通過比較，苯烯莫德對AD患者PBMC細(xì)胞因子的產(chǎn)生的影響與地塞米松組和他克莫司組相似。見表1，2。

表1 特應(yīng)性皮炎組與健康對照組白細(xì)胞介素4和10、干擾素γ、轉(zhuǎn)化生長因子β變化

表2 苯烯莫德、地塞米松、他克莫司對特應(yīng)性皮炎患者白細(xì)胞介素4和10、干擾素γ、轉(zhuǎn)化生長因子β的影響

討 論

我們的前期實(shí)驗(yàn)表明，苯烯莫德抑制人PBMC增殖的IC50為9.67 μmol/l，苯烯莫德可以誘導(dǎo)人PBMC的早期凋亡和晚期凋亡；當(dāng)苯烯莫德作用于活化的T細(xì)胞后，隨著時間的延長，NF?κB通路中活化因子p?NF?κB p65和p?IKK表達(dá)逐漸降低，而抑制性因子p?IκBα表達(dá)卻逐漸升高，提示苯烯莫德可以負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞NF?κB通路［3］。特應(yīng)性皮炎發(fā)病機(jī)制中輔助性T細(xì)胞的作用越來越明顯。大規(guī)模的二期臨床實(shí)驗(yàn)中顯示出濃度為0.5%的苯烯莫德乳膏對特應(yīng)性皮炎有良好的治療效果［2］，因此，我們將0.5%苯烯莫德乳膏換算成相同濃度的溶液，即400 nmol/L的苯烯莫德濃度，進(jìn)行本研究。

我們的研究結(jié)果顯示，AD患者外周血IL?4，TGF?β水平較健康對照組高，而IFN?γ，IL?10水平比健康對照組低。IL?4、IFN?γ、IL?10的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TGF?β的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。苯烯莫德作用于活動期AD的PBMC，可以抑制IL?4、IFN?γ的水平，與地塞米松和他克莫司相比，無明顯差別。提示，苯烯莫德可以扭轉(zhuǎn)Th1/Th2兩種CD4+T細(xì)胞平衡失衡，治療AD等Th1/Th2失衡的炎癥性疾病。除此，我們的結(jié)果還顯示AD患者外周血PBMC培養(yǎng)上清液中IL?10水平減少，而TGF?β水平增高，我們認(rèn)為IL?10的減少，造成了AD患者局部調(diào)節(jié)免疫的缺陷，促進(jìn)了AD的炎癥形成；增高的TGF?β抑制了IFN?γ的產(chǎn)生，從而使細(xì)胞因子出現(xiàn)Th2/Th1失衡。苯烯莫德可以下調(diào)IL?10的表達(dá)水平，上調(diào)TGF?β的表達(dá)。提示，苯烯莫德對Treg分泌的細(xì)胞因子也有一定的調(diào)節(jié)作用。

［1］Bieber T.Atopic dermatitis［J］.Ann Dermatol,2010,22（2）:125?137.DOI:10.5021/ad.2010.22.2.125.

［2］Bissonnette R,Poulin Y,Zhou Y,et al.Efficacy and safety of topical WBI?1001 in patients with mild to severe atopic dermatitis:results from a 12?week,multicentre,randomized,placebo?controlled double?blind trial［J］.Br J Dermatol,2012,166（4）:853?860.DOI:10.1111/j.1365?2133.2011.10775.x.

［3］馬曉蕾,溫廣東,趙琰,等.苯烯莫德對人外周血單個核細(xì)胞增殖、凋亡作用及對T細(xì)胞NF?κB的調(diào)節(jié)［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志,2014,28（8）:785?788.DOI:10.13735/j.cjdv.1001?7089.2014.0785.

［4］趙辨.中國臨床皮膚病學(xué)［M］.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2009:739?741.

Effects of benvitimod on levels of interleukin?4 and ?10,interferon?γ and transforming growth factor?β in patients with atopic dermatitis

Ma Xiaolei,Gao Na,Liu Zhengyi,Zhang Jianzhong
Department of Dermatology,Peking University People′s Hospital,Beijing 100044,China（Ma XL,Zhang JZ）;Peking University International Hospital,Beijing 102206,China（Ma XL,Gao N,Liu ZY）

Zhang Jianzhong,Email:rmzjz@126.com

ObjectiveTo detect levels of interleukin?4（IL?4）,IL?10,interferon?γ（INF?γ）and transforming growth factor?β（TGF?β）in the culture supernatant of peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）from patients with atopic dermatitis（AD）,and to evaluate regulatory effects of benvitimod on these cytokines.MethodsPBMCs were isolated from 20 AD patients and 20 healthy controls.Then,PBMCs from AD patients were equally divided into 4 groups to be cultured with phosphate?buffered saline（PBS group）,400 nmol/L benvitimod solution（benvitimod group）,250 nmol/L dexamethasone solution（dexamethasone group）and 10 nmol/L tacrolimus solution（tacrolimus group）,respectively.Enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to detect levels of IL?4,IL?10,INF?γ and TGF?β in the culture supernatant of PBMCs.ResultsCompared with healthy controls,patients with AD showed significantly higher level of IL?4（83.4 ± 12.2vs.44.3 ± 5.7 pg/ml,P＜ 0.05）,but lower levels of INF?γ（12.5±2.3vs.25.4±3.4 pg/ml,P＜0.05）and IL?10（144.4±4.1vs.189.9±6.5 pg/ml,P＜0.05）in peripheral blood.However,no significant difference in the level of TGF?β was observed between the patient group and control group（178.9±17.40vs.158.7±18.30 pg/ml,P＞0.05）.Compared with PBS,400 nmol/L benvitimod could decrease the expression of IL?4（50.2 ± 10.1vs.83.3 ± 12.2 pg/ml,P＜ 0.05）,IL?10（124.7±17.5vs.144.4±4.1 pg/ml,P＞0.05）and INF?γ（9.56±5.1vs.12.5±2.3 pg/ml,P＞0.05）,but increase the expression of TGF?β（203.6±15.3vs.178.9±17.4 pg/ml,P＞0.05）by PBMCs.In addition,no significant differences in the expression of IL?4,IL?10,INF?γ or TGF?β were observed between the benvitimod group and dexamethasone group or tacrolimus group（allP＞ 0.05）.ConclusionBenvitimod can regulate the expression of IL?4,IL?10,INF?γ and TGF?β by PBMCs in patients with AD.

Dermatitis,atopic;Interleukin?4;Interleukin?10;Interferon?gamma;Lymphotoxin?alpha;Benvitimod

張建中，Email：rmzjz@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.01.007

2016?05?19）

（本文編輯：吳曉初）