賀燕妮 趙穎 曾義斌 張彤 杜凌波 朱瑞政 汪五清

201199上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院皮膚科（賀燕妮、曾義斌、張彤、杜凌波、朱瑞政、汪五清）；復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科（趙穎）

·論著·

Th22及其細(xì)胞因子在斑禿患者外周血的表達(dá)和意義

賀燕妮 趙穎 曾義斌 張彤 杜凌波 朱瑞政 汪五清

201199上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院皮膚科（賀燕妮、曾義斌、張彤、杜凌波、朱瑞政、汪五清）；復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科（趙穎）

目的探討Th22及其細(xì)胞因子在斑禿患者外周血中的表達(dá)及其臨床意義，分析T淋巴細(xì)胞在斑禿發(fā)病機(jī)制中的作用。方法選取上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院2015年1月至2016年5月收治的38例斑禿患者作為研究對(duì)象，設(shè)為斑禿組；同時(shí)取同期健康體檢38例作為健康對(duì)照組，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th22細(xì)胞水平，用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)血清中IL?22、IL?17的水平。結(jié)果斑禿組外周血Th22、Th17、IL?17+IL?22+CD4+、IFN?γ+IL?22+CD4+T細(xì)胞表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組（P＜ 0.01）。斑禿組血清IL?22、IL?17水平均高于健康對(duì)照組（P＜0.05）；與輕型斑禿患者和穩(wěn)定期患者相比，重型斑禿和活動(dòng)期患者Th22、Th17、IL?17+IL?22+CD4+、IFN?γ+IL?22+CD4+T細(xì)胞及血清IL?22、IL?17的表達(dá)進(jìn)一步升高（P＜0.05）。結(jié)論Th22及其細(xì)胞因子可能參與斑禿的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后。

斑禿；細(xì)胞因子類；白細(xì)胞介素17；Th22；白細(xì)胞介素22

斑禿（alopecia areata）屬于累及毛發(fā)的非瘢痕性、突發(fā)性慢性炎癥疾病，任何年齡均可發(fā)病。本病容易復(fù)發(fā)，其發(fā)病可能與免疫功能異常、內(nèi)分泌障礙、神經(jīng)精神、遺傳因素等相關(guān)［1］。斑禿不僅加重了家庭負(fù)擔(dān)，還降低了患者自信心，尤其是年輕男女。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)［2］，斑禿的發(fā)病機(jī)制可能與皮損處毛囊周圍T淋巴細(xì)胞相關(guān)。為此，我們探討Th22及其細(xì)胞因子在斑禿患者外周血中的表達(dá)及意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、一般資料

2015年1月至2016年5月，上海閔行區(qū)中心醫(yī)院皮膚科收治的斑禿患者38例，均符合《楊國亮皮膚病學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，其中，男20例，女18例，年齡18～56歲（36.12±6.12）歲。病程1～18個(gè)月（4.78±5.62）個(gè)月。根據(jù)其皮損面積分為兩組：①輕型斑禿：26例，脫落面積＜頭皮面積30%，均表現(xiàn)為片狀禿發(fā)；②重型斑禿：禿發(fā)面積＞頭皮面積30%，表現(xiàn)為彌漫性禿發(fā)、全禿或普禿。12例（6例彌漫性禿發(fā)，3例全禿，3例普禿）。根據(jù)拉發(fā)試驗(yàn)確定斑禿組患者是否處于活動(dòng)期，本斑禿組患者中活動(dòng)期組22例，患者皮損表現(xiàn)為拉發(fā)試驗(yàn)陽性，穩(wěn)定期組16例，患者皮損表現(xiàn)為拉發(fā)試驗(yàn)陰性，1個(gè)月內(nèi)未出現(xiàn)新的禿發(fā)區(qū)。同時(shí)，取同期我院健康體檢的健康對(duì)照38例，其中男25例，女13例，年齡19～55歲（37.21±6.05）歲。兩組在性別、年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者2個(gè)月內(nèi)未接受糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物治療。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。本組觀察病例無假性禿發(fā)、先天性禿發(fā)、孕婦、嚴(yán)重心腎功能疾病、精神病者。

二、方法

1.儀器與試劑：流式細(xì)胞儀由蘇州陶邁森科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；上海博華生物科技有限公司提供人IL?22酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒、人IL?17 ELISA試劑盒；中國科學(xué)院生物工程研究所提供的淋巴細(xì)胞分離液等。

2.外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)：取新鮮肝素鈉抗凝外周血，離心去除血漿；充分混勻；吸取4 ml淋巴細(xì)胞分離液置于10 ml離心管內(nèi)；沿著離心管側(cè)壁緩慢注入全血，最大限度不讓血液進(jìn)入到淋巴細(xì)胞分離液中；離心30 min后，取出中間白膜層，將其轉(zhuǎn)移到新的離心管內(nèi)；加入PBS充分混勻，離心15 min洗滌后，加入培養(yǎng)液，混勻；吸取200 μl的細(xì)胞混懸液，裝入孵育板中，置于恒溫箱孵育4 h。

3.Th22的流式細(xì)胞儀檢測(cè)：4 h后取出孵育板，吸取細(xì)胞混懸液，裝入流式管內(nèi)；加入PBS吹打混勻，離心l5 min洗滌1遍；去除上清，加入破膜劑，加入1 μl的IL?22、IL?17的熒光標(biāo)記抗體，待混勻后，置于4℃冰箱內(nèi)保存，待以備用；24 h后，用美國BD公司生產(chǎn)的FACS Calibur型流式細(xì)胞儀對(duì)其檢測(cè)，用軟件Flowjo（v7.6.2）對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)加以分析。

4.細(xì)胞因子的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)：取足量酶標(biāo)包板，固定于框架上，設(shè)置3孔，即標(biāo)準(zhǔn)品孔（50 μl標(biāo)準(zhǔn)品）、待測(cè)樣本孔（加40 μl稀釋液 +10 μl待測(cè)樣本）、空白對(duì)照孔（不加任何物質(zhì)）；置于37℃恒溫箱保存30 min；取出酶標(biāo)包板，用吸水紙將其拍干，每一孔內(nèi)加入稀釋后的洗滌液，1 min后，甩去洗滌液；除了空白對(duì)照孔外，其余兩孔加入50 μl酶標(biāo)工作液；置于37℃恒溫箱保存30 min；再洗板；每一孔內(nèi)加入50 μl顯色劑A液、50 μl顯色劑B液，均勻混合，置于37℃恒溫箱15 min；取出酶標(biāo)包板，每孔內(nèi)加入50 μl終止液，15 min內(nèi)，用450 nm波長(zhǎng)對(duì)每一孔內(nèi)的吸光度值加以測(cè)量。

5.觀察指標(biāo)：觀察并記錄兩組Th22及其各細(xì)胞因子的表達(dá)水平。測(cè)定圓形禿發(fā)患者的直徑，測(cè)定橢圓形禿發(fā)患者的長(zhǎng)軸和短軸，計(jì)算禿發(fā)面積。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用PEMS3.1軟件處理數(shù)據(jù)，Th22及其各細(xì)胞因子的表達(dá)水平用（±s）表示，兩均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、IL?22+CD4+T細(xì)胞表達(dá)水平標(biāo)記

斑禿組與健康對(duì)照組在Th22、Th17的表達(dá)頻率上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；斑禿組與健康對(duì)照組在IL?17+IL?22+CD4+、IFN?γ+IL?22+CD4+T的表達(dá)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）。與輕型斑禿患者和穩(wěn)定期患者相比，重型斑禿和活動(dòng)期患者Th22、Th17、IL?17+IL?22+CD4+、IFN?γ+IL?22+CD4+T的表達(dá)進(jìn)一步升高（P＜ 0.001），見表1，圖1，2。

表1 斑禿患者和健康對(duì)照組IL?22+CD4+T細(xì)胞表達(dá)水平（%，±s）

表1 斑禿患者和健康對(duì)照組IL?22+CD4+T細(xì)胞表達(dá)水平（%，±s）

注：a：與對(duì)照組相比，P ＜ 0.05；b：與輕型斑禿相比，P ＜ 0.05

組別健康對(duì)照組斑禿組輕型斑禿重型斑禿穩(wěn)定期患者活動(dòng)期患者例數(shù)38 38 26 12 16 22 Th17 1.1±0.2 5.1±1.4 2.7±0.3a 9.1±1.8ab 3.3±0.6a 6.9±1.1ab Th22 1.8±0.3 5.7±1.2 3.9±1.1a 7.6±1.5ab 3.6±0.9a 7.8±1.0ab IL?17+IL?22+CD4+0.3±0.1 1.3±0.4 0.9±0.2a 1.8±0.6ab 1.0±0.7a 1.6±0.8ab IFN?γ+IL?22+CD4+2.8±0.7 10.4±2.1 6.7±0.8 14.2±2.3ab 7.2±0.9 13.6±2.2ab

圖1 斑禿組和健康對(duì)照組IL?17+IL?22+CD4+T細(xì)胞流式細(xì)胞圖

圖2 斑禿組和健康對(duì)照組IFN?γ+IL?22+CD4+T細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè) 分析Th17時(shí)用CD4+T細(xì)胞設(shè)門，IL?17+IL?22+CD4+T細(xì)胞為流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的Th17細(xì)胞；分析Th22時(shí)用CD4+T細(xì)胞設(shè)門，IFN?γ+IL?22+CD4+T細(xì)胞為流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的Th22細(xì)胞

表2 斑禿患者和健康對(duì)照組IL?22、IL?17的表達(dá)水平（±s）

表2 斑禿患者和健康對(duì)照組IL?22、IL?17的表達(dá)水平（±s）

注：a：與健康對(duì)照組相比，P ＜ 0.05；b：與輕型斑禿相比，P ＜ 0.05

組別健康對(duì)照組斑禿組輕型斑禿重型斑禿穩(wěn)定期患者活動(dòng)期患者例數(shù)38 38 26 12 16 22 IL?22（pg/ml）23.4±4.1 38.7±7.2a 30.5±5.2a 46.6±7.9ab 32.4±5.3a 44.5±8.1ab IL?17（pg/ml）38.2±4.1 63.2±7.1a 48.1±5.4a 78.2±8.1ab 53.1±6.1a 75.1±7.3ab

二、血清IL?22、IL?17的表達(dá)水平比較

如表2所示：斑禿組患者血清中IL?22水平高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；斑禿組患者血清中IL?17水平高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與輕型斑禿患者和穩(wěn)定期患者相比，重型斑禿和活動(dòng)期患者血清中IL?22和IL?17水平進(jìn)一步升高（P＜0.01）。

三、血清IL?22、IL?17、IL?22+CD4+T細(xì)胞百分比與禿發(fā)面積的相關(guān)性

經(jīng)一元線性回歸分析可知，斑禿組外周血中Th22與禿發(fā)面積呈正相關(guān)（r=0.621，P＜0.05）；Th17與禿發(fā)面積呈正相關(guān)（r=0.548，P＜0.05）；血清中IL?22與禿發(fā)面積呈正相關(guān)（r=0.469，P＜0.05）；血清中IL?22與禿發(fā)面積呈正相關(guān)（r=0.569，P＜ 0.05）；Th17、IL?17+IL?22+CD4+T細(xì)胞與禿發(fā)面積呈正相關(guān)（r=0.532，P＜0.05）、IFN?γ+IL?22+CD4+T細(xì)胞與禿發(fā)面積呈正相關(guān)（r=0.436，P＜ 0.05）。

討 論

Th22細(xì)胞于2000年由Renauld發(fā)現(xiàn)，是新型輔助性T細(xì)胞亞群，其效應(yīng)與其他CD4+效應(yīng)T細(xì)胞 亞 群相似［4］。Th22 細(xì)胞不僅可誘導(dǎo)其他細(xì)胞的分化，還參與T細(xì)胞亞群的極化過程，調(diào)節(jié)自身免疫性疾病的免疫應(yīng)答，參與皮膚病理狀態(tài)的發(fā)展。已有學(xué)者研究表明［5］，Th22細(xì)胞參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等疾病。一般情況下，Th22細(xì)胞與其他的細(xì)胞群可相互調(diào)控，使得機(jī)體處于平衡的狀態(tài)。若機(jī)體處于疾病的狀態(tài)下，Th22細(xì)胞則可產(chǎn)生其他的細(xì)胞因子，如，IL?13、IL?22、IL?26等，其中細(xì)胞因子IL?22是最主要的細(xì)胞功能因子，該細(xì)胞因子獨(dú)立于Thl、Th2、Thl7細(xì)胞亞群［6］。由于IL?22細(xì)胞功能因子包括 IL?22R1鏈、IL?22R2鏈，其中 IL?22R1鏈有著重要作用，對(duì)IL?22細(xì)胞的特異性有一定影響，而IL?22R2鏈則主要起到信號(hào)傳導(dǎo)的作用。人的皮膚、肺、腎內(nèi)都存在IL?22R1鏈，但人體內(nèi)各個(gè)組織都存在IL?22R2鏈［7］。因此，IL?22可調(diào)節(jié)特定組織細(xì)胞，尤其是上皮細(xì)胞功能，如：肝細(xì)胞、腺泡細(xì)胞、結(jié)腸上皮下肌成纖維細(xì)胞等，加以誘導(dǎo)進(jìn)而生成趨化因子、炎癥因子及S100家族蛋白等［8?9］。

有學(xué)者研究表明［10］：Th22細(xì)胞在多種皮膚疾病的發(fā)生、發(fā)展中有著重要作用，如銀屑病、紅斑狼瘡等，以上疾病患者中Th22細(xì)胞水平均高于健康者，且參與疾病的發(fā)展中，影響疾病嚴(yán)重程度。國外學(xué)者［11］對(duì)于斑禿患者的外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TGF?β1的研究較多，且取得顯著成效，但對(duì)于Th22與IL?22水平在斑禿患者中的表達(dá)研究很少。對(duì)此，我們?nèi)?8例斑禿患者與38例健康體檢者進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)斑禿Th22水平高于健康體檢者，且IL?22、IL?17水平也高于健康體檢者，與輕型斑禿患者和穩(wěn)定期患者相比，重型斑禿和活動(dòng)期患者Th22、Th17、IL?17+IL?22+CD4+、IFN?γ+IL?22+CD4+T細(xì)胞的表達(dá)血清中IL?22和IL?17水平進(jìn)一步升高，且斑禿組外周血中 Th22、Th17、IL?17+IL?22+CD4+、IFN?γ+IL?22+CD4+T細(xì)胞以及血清中IL?22和IL?17水平與禿發(fā)面積呈正相關(guān)，提示外周血中Th17、Th22及其細(xì)胞因子可能參與斑禿疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中。

綜上所述，斑禿患者外周血中Th22及其細(xì)胞因子的水平高于健康對(duì)照，是否可作為臨床診斷、治療及預(yù)后評(píng)價(jià)的參考依據(jù)尚待進(jìn)一步研究。

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《中華皮膚科雜志》第十一屆編輯委員會(huì)委員和通訊編輯委員名單

名譽(yù)總編輯：徐文嚴(yán)

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Frequency of Th22 cells and expression of their related cytokines in peripheral blood of patients with alopecia areata and their significanceHe Yanni,Zhao Ying,Zeng Yibin,Zhang Tong,Du Lingbo,

Zhu Ruizheng,Wang Wuqing
Department of Dermatology,Central Hospital of Minhang District,Shanghai 201199,China（He YN,Zeng YB,Zhang T,Du LB,Zhu RZ,Wang WQ）;Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China（Zhao Y）

Wang Wuqing,Email:wuqingw2006@sina.com

ObjectiveTo determine the frequency of Th22 cells and expression of their related cytokines in peripheral blood of patients with alopecia areata（AA）,to investigate their significance,and to explore the role of T lymphocytes in the occurrence of AA.MethodsA total of 38 patients with AA were enrolled from Central Hospital of Minhang District in Shanghai between January 2015 and May 2016,and served as the case group.At the same time,38 healthy people served as the control group.Peripheral blood samples were obtained from these patients and controls.Flow cytometry was performed to determine the percentage of Th22 cells,and enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）to measure serum levels of interleukin?22（IL?22）and IL?17.ResultsCompared with the control group,the case group showed significantly increased percentages of Th22 cells,Th17 cells,IL?17+IL?22+CD4+T cells and IFN?γ+IL?22+CD4+T cells（allP＜ 0.01）,as well as serum levels of IL?22 and IL?17（bothP＜ 0.05）.A significant increase was observed in percentages of Th22 cells,Th17 cells,IL?17+IL?22+CD4+T cells and IFN?γ+IL?22+CD4+T cells,as well as serum levels of IL?22 and IL?17,in patients with severe AA compared with those with mild AA,and in patients with active AA compared with those with stable AA（allP＜ 0.05）.ConclusionTh22 cells and their related cytokines may participate in the occurrence,development and prognosis of AA.

Alopecia areata;Cytokines;Interleukin?17;Th22;Interleukin?22

汪五清，Email：wuqingw2006@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.01.003

上海市閔行區(qū)自然科學(xué)研究課題（2015MHZ017）

Fund program:Natural Science Foundation of Minhang District of Shanghai Municipality（2015MHZ017）

2016?09?19）

（本文編輯：吳曉初）