張 亮，姚元志，楊 珂，王 穎，曹 陽，汪朝霞，王志剛，李崇雁，王 冬*

(1.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院超聲科 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室 兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地 兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014；2.重慶醫(yī)科大學超聲分子影像研究所 重慶市超聲分子影像重點實驗室，重慶 400010；3.重慶市腫瘤醫(yī)院超聲科 重慶市腫瘤研究所 重慶市癌癥中心，重慶 400030；4.重慶醫(yī)科大學超聲醫(yī)學工程研究所，重慶 400016)

載黑色素脂質納泡的制備及體外多模態(tài)顯像實驗研究

張 亮1,2，姚元志3，楊 珂1,2，王 穎1,2，曹 陽2，汪朝霞1，王志剛2，李崇雁4，王 冬1,2*

(1.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院超聲科 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室 兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地 兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014；2.重慶醫(yī)科大學超聲分子影像研究所 重慶市超聲分子影像重點實驗室，重慶 400010；3.重慶市腫瘤醫(yī)院超聲科 重慶市腫瘤研究所 重慶市癌癥中心，重慶 400030；4.重慶醫(yī)科大學超聲醫(yī)學工程研究所，重慶 400016)

目的制備一種包載黑色素的多模態(tài)脂質納泡(MNBs)造影劑，觀察其體外超聲、光聲、MR顯影效果。方法采用三氯甲烷注入—冷凍干燥—全氟丙烷充氣法制備MNBs和普通脂質納泡(NBs)，檢測MNBs的一般特性(形態(tài)、粒徑、黑色素裝載量、穩(wěn)定性)，對不同濃度MNBs進行體外超聲、光聲、MR成像并進行定量對比分析。結果MNBs形態(tài)規(guī)則，粒徑分布均勻，透射電鏡顯示MNBs成功包裹黑色素顆粒。黑色素的載藥量為90.53 μg/mg。體外顯影實驗示隨MNBs和NBs濃度的增加，超聲造影效果明顯增強，MNBs和NBs的超聲造影表現(xiàn)無明顯差異，相對信號強度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；隨MNBs濃度的增加，光聲和MRI顯影效果增強，NBs無光聲和MRI顯影效果。結論成功制備出一種包載黑色素的多模態(tài)脂質納泡造影劑，可明顯增強超聲、光聲、MR顯影效果。

脂質納泡；黑色素；超聲檢查；光聲成像；磁共振成像

目前，由于單一模式的影像學成像不能全面地獲取病灶信息，為獲取更加全面、豐富、精準的影像信息，提高疾病的檢出率，多種影像成像方法的融合成為當前影像技術的發(fā)展趨勢之一[1]。黑色素是一種生物源性的多聚烴類化合物，可作為光聲成像和MR成像的理想靶標，與傳統(tǒng)多模態(tài)成像介質相比，黑色素具有良好的生物相容性和生物降解能力[2-5]。超聲、光聲、MR成像技術均是生物醫(yī)學領域的無創(chuàng)成像技術。本研究將具備增強光聲成像和MR成像功能的黑色素包裹在具有超聲造影功能的脂質納泡(NBs)中，構建一種具有超聲/光聲/MR多模態(tài)顯像功能的脂質納泡造影劑(MNBs)，評估其體外超聲、光聲、MRI效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備 二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇 2000(DSPE-mPEG2000)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、膽固醇、黑色素(Sigma公司)；全氟丙烷(C3F8，天津核工業(yè)理化工程研究所)；超聲破碎儀(VCX-130，Sonic公司)；XL2020聲振儀(Heat System Inc)；Malvern激光粒徑檢測儀(美國Zetasize公司)；UV-2500紫外-可見分光光度計(Shimadzu公司，日本)；正置光學顯微鏡(Olympus公司，日本)；冷凍干燥機；細胞計數(shù)板；Esaote Mylab90彩色超聲診斷儀；Vevo?LAZR光聲成像系統(tǒng)；DFY-Ⅱ型超聲圖像定量分析診斷儀(重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所)；布魯克7.0T小動物磁共振成像儀。

1.2 MNBs的制備 采用三氯甲烷注入—冷凍干燥—全氟丙烷充氣法制備MNBs，將10 mg DSPC、5 mg DSPE-mPEG2000、3 mg DPPG和3 mg膽固醇溶解于10 ml CHCl3中，超聲破碎儀聲振5 min，使脂質充分溶解于CHCl3。將2 mg黑色素粉末加入2 ml NaOH(pH=12.9)中至其完全溶解，然后裝入透析袋(分子量12 000 kD)，用HCl (0.01 mol/L)將其pH調至7.4，獲得黑色素溶液。將黑色素溶液預熱至65℃，在65℃恒溫磁珠攪拌下逐滴加入脂質CHCl3溶液，控制滴速為0.2 ml/min，隨著CHCl3的揮發(fā)，由于溶解在有機溶劑的磷脂特殊的自組裝特性，將黑色素溶液包裹，形成包載黑色素溶液的脂質體微球。然后聲振(100 W)2 min使脂質體微球變小，再用超濾離心管(MWCO=100 kDa)高速離心3次(10 000轉/分，20 min)去除未包載的黑色素溶液，收集脂質體，冷凍干燥后充入C3F8，即獲得MNBs凍干粉。在制備過程中，用等量的雙蒸水代替黑色素溶液，即可制得NBs凍干粉。

1.3 MNBs一般性質檢測 取少量MNBs溶解于雙蒸水，透射電鏡觀察其形態(tài)、分布，激光粒徑檢測儀檢測其粒徑大小和分布。采用電子天平稱取MNBs凍干粉的質量。用紫外-可見光分光光度法測定不同濃度的黑色素光吸收特性、測定MNBs中的黑色素含量。配置3 mg/ml的MNBs的溶液，于0、6、12、24 h測量其濃度(利用血球計數(shù)板計數(shù))、粒徑、分散性。

1.4 MNBs體外超聲顯像 將不同濃度MNBs、NBs的PBS溶液(1、2、3 mg/ml)和PBS加入自制的凝膠模型中，采用EC123高頻線陣探頭，于諧波模式下觀察體外超聲顯影情況，并采用DFY-Ⅱ型超聲圖像定量分析診斷儀分析各靶區(qū)相對信號強度，即造影劑聲強與PBS聲強之比。

1.5 MNBs體外光聲顯像 將2 mg/ml MNBs的PBS溶液加入自制的凝膠模型，光聲成像參數(shù)設定：Priority 98%，Brightness 50，Contrast 50，PA Gain 40 dB，2D Gain 18 dB，F(xiàn)requency 21 MHz。采用波長680～970 nm脈沖激光輻照，以5 nm波長幅度遞增，采集光聲信號，繪制MNBs的吸收光譜曲線。

將不同濃度MNBs的PBS溶液(1、2、3 mg/ml)注入凝膠空洞，700 nm波長的脈沖激光輻照，采集不同濃度下光聲圖像并記錄光聲信號值。

1.6 MNBs體外磁共振顯像 配制0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/ml MNBs的PBS溶液作為實驗組Ⅲ～Ⅶ，取10 mg/ml NBs和PBS作為對照組Ⅰ、Ⅱ。采用布魯克7.0T小動物MR成像儀行T1WI掃描和T1 mapping掃描。T1WI參數(shù)：TR 600 ms，TE 6 ms，層厚1 mm，F(xiàn)OV 40 mm×40 mm。T1 mapping掃描參數(shù)：TR 400、800、1 200、2 400、3 600、4 800 ms，TE 8.0 ms，層厚1 mm，F(xiàn)OV 40 mm×40 mm。沿各管內徑勾畫ROI，測得信號強度(signal intensity, SI)和T1值，計算1/T1。

圖1 MNBs造影劑光學顯微鏡圖(A)、透射電鏡圖(B)、粒徑分布圖(C)及黑色素紫外-可見光吸收光譜圖(D)

圖2 MNBs體外超聲顯像 A.不同濃度載黑色素脂質納泡和空白脂質納泡諧波顯像; B.MNBs和NBs溶液相對信號強度值

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。對各參數(shù)均行正態(tài)性檢驗，計量資料以±s表示，不同濃度MNBs時，光聲信號值、1/T1的比較采用單因素方差分析；MNBs濃度和1/T1進行Pearson相關分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MNBs一般性質 制備的MNBs外觀呈棕色粉末，在水溶液中為均勻的乳液。光學顯微鏡觀察納泡呈圓形，大小均一，分散性好(圖1A)。透射電鏡見MNBs形態(tài)規(guī)則，內見大小均一的高密度顆粒(圖1B)。激光粒徑檢測儀測其分散性好，平均粒徑(247.30±65.20)nm(圖1C)。紫外—可見光吸收光譜波長230～800 nm增大時，黑色素溶液的吸收值逐漸降低(圖1D)。將波長設定為430 nm，選擇吸光度在0.2～0.8范圍內的點繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.015 50X+0.006 027(R2=0.998 8)；根據(jù)標準曲線回歸方程計算黑色素的裝載量為90.53 μg/mg。0、6、12、24 h時，MNBs溶液的濃度和粒徑變化不大，各時間點分散性良好。

2.2 MNBs體外超聲顯像 體外超聲顯像示，MNBs和NBs溶液均呈高回聲(圖2A)，而PBS溶液呈無回聲；MNBs和NBs溶液回聲強度隨造影劑濃度的增加而提高，相同濃度的MNBs和NBs溶液的相對信號強度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，如圖2B。

2.3 MNBs體外光聲顯像 在680～970 nm激光發(fā)射波長下，MNBs造影劑均可表現(xiàn)出光聲信號，700 nm處有最大吸收峰，從700 nm開始，隨脈沖激光波長的增加，MNBs造影劑的光聲信號逐漸降低(圖3A)。700 nm激發(fā)波長下，隨MNBs造影劑溶液濃度的增加，其光聲信號也增強(圖3B、3C)。NBs造影劑無明顯光聲顯像效果(圖3C)。

2.4 MNBs體外磁共振顯像 體外磁共振顯像示，NBs和PBS在T1WI呈低信號，MNBs呈高信號(圖4A)，MNBs濃度和1/T1線性回歸方程為：Y=0.052 2X+0.348 3(R2=0.991，P<0.05；圖4B)，信號強度隨造影劑濃度的增加而增加(圖4C)。

圖3 MNBs體外光聲顯像 A.2 mg/ml MNBs在680～970 nm波長內光聲信號值變化; B.不同濃度的MNBs和NBs(3 mg/ml)造影劑光聲顯像; C.不同濃度的MNBs定量光聲信號強度

圖4 MNBs體外MR顯像 A.對照組(Ⅰ、Ⅱ)和實驗組(Ⅲ～Ⅶ)T1WI圖像; B.MNBs濃度與1/T1值的線性相關圖; C.對照組(Ⅰ、Ⅱ)、實驗組(Ⅲ～Ⅶ)的信號強度

3 討論

目前，分子影像在疾病的診斷和治療中發(fā)揮越來越重要的作用，為獲取豐富、準確的影像信息，筆者制備了一種包載黑色素的脂質納泡造影劑，同時具備超聲、光聲和MR造影效果。脂質納泡造影劑因粒徑小、穿透力強、穩(wěn)定性較高、血液循環(huán)時間長等優(yōu)點，作為超聲分子探針、藥物及基因載體等成為研究熱點[6-7]。多模態(tài)成像介質如金納米材料[8]，碳納米材料[9]和染料[10]是目前最常見的光聲成像造影劑，雖然臨床安全性已獲得FDA的認證，但其遠期安全性和體內清除仍有待進一步研究。黑色素廣泛存在于動物、植物及微生物，是一種多聚芳香烴類化合物，含較多的苯環(huán)結構，含很多自由基和不成對電子[11]，由于其高度的共軛效應，在廣闊的光譜區(qū)內均具有強烈的光吸收能力，也具有抗輻射、抗氧化、抗病毒、抗衰老及免疫功能，因此其成為各領域的研究熱點[12-14]。有研究[12]表明，黑色素可提高光聲成像的顯像效果，將黑色素包被于白蛋白內，發(fā)現(xiàn)可明顯增強光聲信號。Stritzker等[4]將黑色素基因插入溶瘤牛痘病毒株的基因組中，通過黑色素基因表達產(chǎn)生的黑色素作為診斷及治療的介質，在未添加任何底物的情況下即可進行深部組織光聲顯像及MR顯像。表明黑色素在MRI上具有特征性的短T1信號，可增強T1WI成像。具有超聲顯像功能的脂質納泡造影劑包裹黑色素顆粒形成的MNBs同時具備增強超聲顯影、光聲成像、MR成像的功能。

本實驗選擇具有良好生物安全性的磷脂作為殼材，C3F8氣體及生物源性的黑色素作為內核。磷脂是生物膜的重要組分，經(jīng)各種磷脂酶分解代謝，其代謝產(chǎn)物參與糖代謝、β氧化等[15]。人體大部分黑色素隨表皮角質層細胞的脫落外，也有部分黑色素受角朊細胞內溶酶體作用被降解，被吞噬細胞所吞噬降解，或在血液循環(huán)中分解經(jīng)腎排出[16]。少量C3F8氣體可經(jīng)肺排出。因此，MNBs具有高度的生物相容性和生物降解能力，安全性高。本實驗所制備的MNBs造影劑大小均一，粒徑較小，分散性良好；透射電鏡顯示脂質體成功包載了黑色素。將本實驗所制備的MNBs保存于密封的充滿全氟丙烷氣體的玻璃瓶，可長期保存。MNBs分散于水溶液24 h內其數(shù)目、粒徑無明顯改變，穩(wěn)定性好；體外超聲實驗顯示，MNBs和NBs均具有良好的超聲顯影效果，表明MNBs和NBs內成功包載了全氟丙烷氣體；MNBs和NBs的回聲強度無明顯差異，提示包載的黑色素對MNBs的超聲顯影無明顯影響；體外光聲顯影實驗結果顯示，MNBs在700～970 nm波長的激光作用下，隨著波長的增加，光聲信號逐漸減弱；在700 nm波長的激光作用下，隨MNBs濃度的增加，光聲信號也隨之增強,而NBs在激光作用下無光聲信號，表明光聲信號的產(chǎn)生源于黑色素而非脂質納泡和全氟丙烷；體外MRI結果顯示MNBs可顯著增強T1WI而NBs不能增強T1WI，表明T1WI信號的增強與黑色素密切相關。

本實驗的不足：未對黑色素的載入量進行優(yōu)化，黑色素載入量越高，光聲成像和MRI效果越好，但在MNBs體積一定的情況下，全氟丙烷氣體的含量越少，超聲造影效果越差。將在后續(xù)試驗中制備不同大小的載不同質量黑色素納泡，評估其多模態(tài)造影效果。

總之，本實驗成功制備了包載黑色素的多模態(tài)脂質納泡造影劑MNBs，其具備超聲造影、光聲成像和MRI顯像功能；該造影劑的成分為生物來源的黑色素和磷脂，生物相容性好，安全性高。

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消 息

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Preparationofmelanin-basedlipidnanobubblesforenhancingmultimodalimaginginvitro

ZHANGLiang1,2,YAOYuanzhi3,YANGKe1,2,WANGYing1,2,CAOYang2,WANGZhaoxia1,WANGZhigang2,LIChongyan4,WANGDong1,2*
(1.DepartmentofUltrasound,Children'sHospitalofChongqingMedicalUniversity,MinistryofEducationKeyLaboratoryofChildDevelopmentandDisorders,ChinaInternationalScienceandTechnologyCooperationBaseofChildDevelopment,ChongqingKeyLaboratoryofPediatrics,Chongqing400014,China; 2.InstituteofUltrasoundImaging,ChongqingMedicalUniversity，ChongqingKeyLaboratoryofUltrasoundMolecularImaging,Chongqing400010,China; 3.DepartmentofUltrasound,ChongqingCancerHospital,ChongqingCancerInstitute,ChongqingCancerCenter,Chongqing400030,China; 4.InstituteofUltrasonicEngineeringinMedicalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.)

ObjectiveTo prepare multi-modality melanin-based lipid nanobubbles (MNBs) contrast agents, and to investigate their manifestations of ultrasound (US), photoacoustic (PA) and MRI in vitro.MethodsMNBs and lipid nanobubbles (NBs) were prepared with the method of CHCl3-injection, freeze-drying and C3F8-inflation. The characteristics (shape, grain diameter, loading capacity of melanin and stability) of MNBs were obseved. US, PA and MRI were detected in vitro and the images were quantitatively analyzed.ResultsMNBs presented with homogenized size distribution, and transmission electron microscope (TEM) images demonstrated that the melanin particles were successfully entrapped into nanobubbles. Meanwhile, the loading capacity of melanin was 90.53 μg/mg. US signal increased in vitro with the rise of MNBs and NBs concentration. The ultrasonic manifestations of MNBs and NBs were the same, and the relative signal enhancement had no significant difference (P>0.05). With the increased concentration of MNBs, the PA and MRI signals were stronger, but NBs showed no evident enhancement.ConclusionMulti-modality MNBs contrast agents are prepared successfully, which can enhance US, PA and MR imaging.

Lipid nanobubbles; Melanin; Ultrasonography; Photoacoustic imaging; Magnetic resonance imaging

10.13929/j.1003-3289.201704096

R445

A

1003-3289(2017)10-1458-05

國家自然科學基金項目(81571688、81401503、81771845)、中國博士后特別資助項目(2015T80963)、重慶市博士后科研項目特別資助(Xm2014052、Xm2015089)。

張亮(1990—)，男，湖北麻城人，在讀碩士。研究方向：超聲分子顯像與治療研究。E-mail: zhangliangcq338@163.com

王冬，重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院超聲科 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室 兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地 兒科學重慶市重點實驗室，400014;重慶醫(yī)科大學超聲分子影像研究所 重慶市超聲分子影像重點實驗室，400010。E-mail: wang57554@163.com

2017-04-19

2017-08-31