劉彩霞 杜蕾蕾 段志敏 曾榮 沈永年 胡素泉 劉維達(dá) 陳青 李岷

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所真菌科（劉彩霞、杜蕾蕾、段志敏、曾榮、沈永年、胡素泉、劉維達(dá)、李岷）；江蘇省血液中心研究室（陳青）

申克孢子絲菌酵母相對(duì)人THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞p38MAPK激活及白細(xì)胞介素6表達(dá)的影響

劉彩霞 杜蕾蕾 段志敏 曾榮 沈永年 胡素泉 劉維達(dá) 陳青 李岷

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所真菌科（劉彩霞、杜蕾蕾、段志敏、曾榮、沈永年、胡素泉、劉維達(dá)、李岷）；江蘇省血液中心研究室（陳青）

目的探討申克孢子絲菌酵母相對(duì)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（THP?1）巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）活化及白細(xì)胞介素6（IL?6）表達(dá)的影響。方法實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析申克孢子絲菌酵母相刺激THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞3、6 h后IL?6 mRNA表達(dá)水平變化，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)刺激24 h后IL?6分泌量；Western印跡法分析2×106CFU/ml申克孢子絲菌酵母相體外作用于THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞30 min和60 min后p38MAPK磷酸化水平的變化，同時(shí)檢測(cè)100 nmol/L地塞米松（p38MAPK抑制劑）預(yù)處理THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞30 min后p38MAPK磷酸化水平及IL?6 mRNA表達(dá)水平的變化。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行多因素方差分析、單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)。結(jié)果刺激THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞3 h后，酵母相組、凝膠多糖組、空白對(duì)照組IL?6 mRNA表達(dá)水平分別為56.81±7.36、26.69±1.22、0.97±0.05，刺激6 h后分別為378.03±16.67、276.24±39.13、1.02±0.04，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5 552.22，P＜0.001）。申克孢子絲菌酵母相刺激6 h后IL?6 mRNA表達(dá)高于刺激3 h后（q=16.74，P＜0.001），申克孢子絲菌酵母相與THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞共孵育24 h后，酵母相組、凝膠多糖組及空白組細(xì)胞上清液中IL?6濃度分別為（59.96± 18.16）、（91.01± 17.27）、（5.50± 2.30）pg/L，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.62，P＜0.01）；酵母相組高于空白對(duì)照組（P＜0.01）。地塞米松處理后，酵母相組IL?6 mRNA表達(dá)水平（4.46±1.03）低于未用地塞米松處理組（493.52±113.87，P＜0.001）。申克孢子絲菌酵母相作用THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞30、60 min后，磷酸化p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于空白對(duì)照組（P＜0.01）。地塞米松預(yù)處理THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞后，磷酸化p38MAPK水平低于未用地塞米松處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=10.81，P＜0.01）。結(jié)論人THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞體外與申克孢子絲菌酵母相作用后，通過激活p38MAPK信號(hào)通路促進(jìn)IL?6表達(dá)。

孢子絲菌屬；巨噬細(xì)胞；白細(xì)胞介素6；p38絲裂原活化蛋白激酶類

作為一種致病性雙相真菌，申克孢子絲菌（Sporothrix schenckii）室溫下呈菌絲相，在感染部位轉(zhuǎn)化為酵母相后可致病，引起皮膚黏膜、皮下組織及局部淋巴組織的感染，病重者可經(jīng)血行或淋巴管播散至骨骼和內(nèi)臟等，引起全身性系統(tǒng)感染，甚至危及生命［1］。宿主單核巨噬細(xì)胞能夠識(shí)別并吞噬、殺傷、清除入侵的申克孢子絲菌，在機(jī)體抵抗申克孢子絲菌感染中發(fā)揮重要作用［2］。本研究旨在探討申克孢子絲菌酵母相（簡稱酵母相）對(duì)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（THP?1）巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路激活與白細(xì)胞介素6（IL?6）表達(dá)的影響。

材料和方法

一、主要試驗(yàn)材料

THP?1細(xì)胞株來自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。申克孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC（F）D1a由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)醫(yī)學(xué)真菌中心提供。兔抗人p38MAPK、p38MAPK磷酸化蛋白（p?p38MAPK）和β肌動(dòng)蛋白抗體（美國Cell Signaling Technology公司），IL?6酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（PrimeScript RT Master Mix）（日本TaKaRa公司），熒光定量PCR試劑盒（iTaq Universal SYBR Green Supermix）（美國Bio?rad公司），佛波酯、凝膠多糖（美國Sigma公司），地塞米松（美國Invivogen公司）。

二、試驗(yàn)方法

1.酵母相誘導(dǎo)：申克孢子絲菌接種至沙堡弱固體培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7 d，活化3次后轉(zhuǎn)種于含2%葡萄糖的腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基37℃、5%CO2下培養(yǎng)，每14 d傳代，觀察菌落及革蘭染色后顯微鏡下形態(tài)，至完全轉(zhuǎn)化為酵母相后制備酵母相菌液，生理氯化鈉溶液沖洗2遍，計(jì)數(shù)后配制成2×109菌落形成單位（CFU）/ml的菌懸液待用。

2.THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)：THP?1細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。將細(xì)胞制備成2×105/ml細(xì)胞懸液，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔1 ml）及6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔2 ml），加入100 μg/L佛波酯刺激48 h誘導(dǎo)形成巨噬細(xì)胞待用。

3.酵母相對(duì)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞IL?6表達(dá)水平的影響：將THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞與2×106CFU/ml酵母相（酵母相組）、100 mg/L IL?6陽性刺激物凝膠多糖（凝膠多糖組）或培養(yǎng)基（空白對(duì)照組）共培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)3、6 h后檢測(cè)IL?6 mRNA的表達(dá)。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，酵母相刺激THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞后，ELISA檢測(cè)到上清液IL?6含量明顯升高，且刺激24 h后上清液IL?6含量達(dá)到最高。于共培養(yǎng)24 h時(shí)ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL?6的表達(dá)。

4.酵母相對(duì)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞p38MAPK通路的影響：酵母相及凝膠多糖分別與THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞共培養(yǎng)30、60 min后檢測(cè)p38MAPK蛋白及p?p38MAPK蛋白的表達(dá)水平。

5.地塞米松對(duì)酵母相刺激的THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞IL?6 mRNA表達(dá)及p38MAPK通路的影響：將酵母相、凝膠多糖分別與100 nmol/L地塞米松預(yù)處理30 min的THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞和未用地塞米松處理的THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞共培養(yǎng)30 min時(shí)檢測(cè)各組p?p38MAPK的表達(dá)水平，培養(yǎng)6 h時(shí)檢測(cè)各組IL?6 mRNA的表達(dá)水平。

6.實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)IL?6 mRNA的表達(dá)：TRIzol試劑盒抽提處理后THP?1總RNA，按反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用ABI 7300 PCR儀（美國ABI公司）對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，IL?6及β肌動(dòng)蛋白引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列：IL?6：正向引物5′?TTCGGCAAATG TAGCATG?3′，反向引物5′?AATGGGCAAATGTAGC ATC?3′；β肌動(dòng)蛋白：正向引物5′?TCTGGCACCACA CCTTCAT?3′，反向引物5′?AGGCATACAGGGACAG CAC?3′。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)40。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的變化水平，△Ct=目的基因-內(nèi)參照（β肌動(dòng)蛋白）；△△Ct=樣品△Ct-對(duì)照組△Ct。2-△△Ct值為實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)較對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)。

7.Western印跡法檢測(cè)p38MAPK蛋白及p?p38MAPK蛋白的表達(dá)：收集處理后的THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。用二喹啉甲酸定量法計(jì)算蛋白濃度，煮沸變性，SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。5%血清白蛋白（BSA）封閉2 h，兔抗人單克隆抗體4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體孵育2 h，化學(xué)發(fā)光底物顯色發(fā)光。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次取均值。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，進(jìn)行多因素方差分析、單因素方差分析，組間多重比較采用LSD、Dunnett及Bonferroni檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、酵母相對(duì)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞IL?6 mRNA及IL?6表達(dá)水平的影響

見表1。刺激3 h和6 h后，酵母相組、凝膠多糖組、空白對(duì)照組IL?6 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5 552.22，P＜ 0.001）。刺激6 h后IL?6 mRNA表達(dá)與刺激3 h后之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 994.31，P＜ 0.001）。酵母相刺激后6 h IL?6 mRNA表達(dá)高于刺激后3 h（t=16.74，P＜0.001）。

酵母相與THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞共孵育24 h后，酵母相組、凝膠多糖組及空白對(duì)照組的上清液中IL?6濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.62，P＜0.01）。酵母相組高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=4.59，P＜ 0.01）。

無論是否用地塞米松處理，酵母相組、凝膠多糖組及空白組之間IL-6 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19 893.26，P＜0.001）。地塞米松處理的3組IL?6 mRNA表達(dá)水平與未用地塞米松處理的3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=202.86，P＜0.001）；酵母相組地塞米松處理后IL?6 mRNA表達(dá)水平低于未用地塞米松處理組（q=10.42，P＜0.001）。見表2。

表1 申克孢子絲菌酵母相對(duì)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞IL?6 mRNA及分泌水平的影響（±s）

表1 申克孢子絲菌酵母相對(duì)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞IL?6 mRNA及分泌水平的影響（±s）

注：n=3。a：與共培養(yǎng)后3 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）

組別申克孢子絲菌組凝膠多糖組空白對(duì)照組IL?6 mRNA共培養(yǎng)3 h 56.81±7.36 26.69±1.22 0.97±0.05共培養(yǎng)6 h 378.03±16.67a 276.24±39.13a 1.02±0.04共培養(yǎng)24 h IL?6（pg/L）59.96±18.16 91.01±17.27 5.50±2.30

表2 地塞米松對(duì)申克孢子絲菌酵母相上調(diào)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞IL?6 mRNA水平的影響（±s）

表2 地塞米松對(duì)申克孢子絲菌酵母相上調(diào)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞IL?6 mRNA水平的影響（±s）

注：n=3。a：與空白對(duì)照組比較，P ＜ 0.01；b：與未用地塞米松阻斷組比較，P＜0.01；c：與未用地塞米松阻斷組比較，P＜0.05

組別酵母相組凝膠多糖組空白對(duì)照組未用地塞米松阻斷493.52±113.87a 274.12±15.44a 1.60±0.35地塞米松阻斷4.46±1.03b 11.44±3.32c 1.04±0.24

二、酵母相對(duì)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞p38MAPK通路的影響

見圖1。刺激30 min后，酵母相組p?p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量為2.31±0.31，p38MAPK蛋白為1.14±0.09；刺激60 min后分別為2.19±0.06和1.12± 0.10?？瞻讓?duì)照組（刺激0 min）p?p38MAPK蛋白、p38MAPK蛋白均為1.00。p?p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=380.186，P＜0.001），刺激30、60 min后酵母相組p?p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組（q=6.75、6.13，均P＜0.01）。p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.07，P=0.81）。

地塞米松處理后，酵母相組p?p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量為2.29±0.37，空白對(duì)照組為1.13±0.04；未用地塞米松處理時(shí)，酵母相組p?p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量為4.55±0.46，空白對(duì)照組為1.00±0.00，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=61.69，P＜0.001）。地塞米松處理后酵母相組p?p38MAPK蛋白表達(dá)低于未用地塞米松處理酵母相組（q=10.81，P＜0.01）。見圖2。

討 論

申克孢子絲菌在宿主體內(nèi)和37℃培養(yǎng)時(shí)為酵母相，且孢子絲菌病患者的組織病理切片和電鏡標(biāo)本中僅見酵母相［3］，故本研究選用酵母相為研究對(duì)象。THP?1細(xì)胞是一種人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞，經(jīng)PMA誘導(dǎo)可分化為成熟的巨噬細(xì)胞，常用于單核-巨噬細(xì)胞的功能研究，故本研究選用經(jīng)PMA誘導(dǎo)的THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞作為細(xì)胞模型。

圖1 申克孢子絲菌酵母相對(duì)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞p38MAPK通路的影響 與空白對(duì)照組比較，申克孢子絲菌酵母相刺激30、60 min時(shí)磷酸化p38MAPK蛋白水平明顯升高，而p38MAPK蛋白水平均無變化

圖2 地塞米松對(duì)申克孢子絲菌酵母相激活THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞p38MAPK通路的影響 地塞米松預(yù)處理后申克孢子絲菌酵母相誘導(dǎo)的磷酸化p38MAPK水平降低，p38MAPK蛋白水平無明顯改變

以往研究顯示，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞能快速識(shí)別、吞噬清除入侵機(jī)體的病原真菌并合成分泌IL?1β、IL?6、IL?12、IL?17、IL?22、腫瘤壞死因子（TNF?α）等多種細(xì)胞因子，在機(jī)體抵御申克孢子絲菌感染中發(fā)揮重要作用［4?11］。IL?6是一種多效性前炎癥因子，通過誘導(dǎo)急性時(shí)相反應(yīng)蛋白合成、增強(qiáng)吞噬細(xì)胞功能等發(fā)揮抗感染效應(yīng)。IL?6可由幾乎所有的基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞分泌，而TNF?α、IL?1β能促進(jìn)IL?6表達(dá)，表達(dá)過程受多種細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控［12］。IL?6可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖、分化和生長，IL?6缺失嚴(yán)重影響固有免疫及適應(yīng)性免疫的轉(zhuǎn)換［13］。

本研究發(fā)現(xiàn)，酵母相刺激THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞后，IL?6 mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)時(shí)間依賴效應(yīng)，刺激3 h后表達(dá)水平上升，6 h表達(dá)水平為3 h時(shí)的6.65倍。凝膠多糖是一種β?1，3-D-葡聚糖，被單核巨噬細(xì)胞表面受體C-型凝集素受體1（Dectin?1）識(shí)別后，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，合成分泌多種細(xì)胞因子［14］。我們選用凝膠多糖作為激活THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的陽性對(duì)照物，實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)IL?6 mRNA表達(dá)與酵母相有相似的時(shí)間依賴性效應(yīng)，刺激6 h后IL?6 mRNA水平比3 h時(shí)升高10.35倍。酵母相作用THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞24 h后，上清液中IL?6蛋白含量較空白對(duì)照組明顯升高，表明酵母相不僅在mRNA水平誘導(dǎo)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞上調(diào)IL?6轉(zhuǎn)錄，還在蛋白水平提高其分泌量。Sassá等［5］和de C Negrini等［10］用申克孢子絲菌脂類抗原刺激野生小鼠腹腔巨噬細(xì)胞或脾細(xì)胞，能誘發(fā)炎癥反應(yīng)，使IL?6、IL?1β等表達(dá)增加。

Romo?Lozano等［6］用酵母相刺激肥大細(xì)胞，通過激活ERK信號(hào)通路，誘導(dǎo)IL?6、TNF?α分泌，引發(fā)固有免疫反應(yīng)。樹突細(xì)胞受酵母相或外抗原100刺激后，IL?6、IL?12等表達(dá)增加［11］。角質(zhì)形成細(xì)胞與酵母相或分生孢子共孵育后，IL?6、IL?8等細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均明顯升高［15］。本研究結(jié)果與上述研究一致，提示IL?6在抗申克孢子絲菌感染中發(fā)揮重要作用。

真菌入侵機(jī)體后，細(xì)胞因子的產(chǎn)生依賴于固有免疫細(xì)胞通過模式識(shí)別受體識(shí)別真菌表面病原體相關(guān)分子模式，活化下游信號(hào)通路MAPK等［16］。MAPK主要包括ERK、p38MAPK及c?Jun氨基末端激酶（JNK）幾個(gè)亞族，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多功能調(diào)控。既往研究發(fā)現(xiàn)，THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞通過活化p38MAPK信號(hào)通路并分泌TNF?α等細(xì)胞因子，參與抗念珠菌感染的免疫反應(yīng)［17］。本研究中酵母相刺激THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞30 min和60 min后，p38MAPK磷酸化水平均升高，表明酵母相能夠激活p38MAPK信號(hào)通路。

研究證明，100 nmol/L地塞米松能阻斷p38MAPK信號(hào)通路并抑制IL?6等細(xì)胞因子的表達(dá)［18］。本研究中，100 nmol/L地塞米松預(yù)處理THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞后抑制了酵母相誘導(dǎo)的p38MAPK通路的磷酸化并使IL?6 mRNA表達(dá)明顯降低，進(jìn)一步證明100 nmol/L地塞米松可通過阻斷p38MAPK通路影響下游IL?6的表達(dá)。但地塞米松為非特異性阻斷劑，不能排除對(duì)實(shí)驗(yàn)的其他影響，為本研究的不足之處。

本研究結(jié)果表明，人THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞經(jīng)酵母相刺激后激活p38MAPK信號(hào)通路并分泌IL?6，參與抗申克孢子絲菌固有免疫反應(yīng)。

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Effects of the yeast form ofSporothrix schenckiion activation of p38MAPK and expression of interleukin?6 in human THP?1 macrophage?like cells

Liu Caixia,Du Leilei,Duan Zhimin,Zeng Rong,Shen Yongnian,Hu Suquan,Liu Weida,Chen Qing,Li Min

Department of Mycology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Liu CX,Du LL,Duan ZM,Zeng R,Shen YN,Hu SQ,Liu WD,Li M）;Research Laboratory,Jiangsu Province Blood Center,Nanjing 210042,China（Chen Q）

s:Li Min,Email:drlimin@sina.cn;Chen Qing,Email:qngchen@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate effects of the yeast form ofSporothrix schenckiion activation of p38 mitogen?activated protein kinase（p38MAPK）and expression of interleukin?6（IL?6）in macrophage?like THP?1 cells,which were differentiated from the human acute monocytic leukemia cell line THP?1.MethodsTHP?1 macrophage?like cells were divided into 3 groups to be treated with the yeast form ofSporothrix schenckiiat a concentration of 2 × 106colony?forming units（CFU）/ml（yeast form group）,100 mg/L curdlan（curdlan group） and RPMI 1640 medium （blank control group） respectively.Real?time fluorescence?based quantitative PCR was performed to measure the mRNA expression of IL?6 in THP?1 macrophage?like cells in the above 3 groups after 3?and 6?hour treatment separately,and enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）to detect the level of IL?6 in the culture supernatant of THP?1 macrophage?like cells after 24?hour treatment.Western blot analysis was conducted to determine the protein expression of p38MAPK and phosphorylated p38MAPK（p?p38MAPK）in the above 3 groups after 30?and 60?minute treatment separately.Other THP?1 macrophage?like cells were pretreated with 100 nmol/L dexamethasone（a p38MAPK inhibitor）for 30 minutes,and then were divided into 3 groups to be treated with the yeast form ofSporothrix schenckii,curdlan and RPMI 1640 medium respectively,and changes in the level of p?p38MAPK and mRNA expression of IL?6 were also detected.Statistical analysis was carried out with SPSS19.0 software by using one?way or multi?way analysis of variance and least significant difference（LSD）test.ResultsSignificant differences in the mRNA expression of IL?6 in THP?1 macrophage?like cells were observed among the yeast form group,curdlan group and blank control group（F=5 552.22,P＜0.001）after 3?hour treatment（56.81 ± 7.36,26.69 ± 1.22 and 0.97 ± 0.05,respectively）and 6?hour treatment（378.03± 16.67,276.24 ± 39.13 and 1.02 ± 0.04,respectively）.Additionally,the yeast form group showed significantly higher mRNA expression of IL?6 after 6?hour treatment than that after 3?hour treatment（q=16.74,P＜ 0.001）.After 24?hour treatment,the level of IL?6 in the culture supernatant of THP?1 macrophage?like cells also significantly differed among the yeast form group,curdlan group and blank control group（59.96±18.16 pg/L,91.01±17.27 pg/L,5.50±2.30 pg/L,respectively;F=26.62,P＜ 0.01）,and was significantly higher in the yeast form group than in the blank control group（P＜ 0.01）.After 30?and 60?minute treatment,the protein expression of p?p38MAPK was significantly higher in the yeast form group than in the blank control group（bothP＜ 0.01）.Moreover,the mRNA expression of IL?6（4.46±1.03vs.493.52±113.87,P＜0.001）and protein expression of p?p38MAPK（2.29±0.37vs.4.55±0.46,q=10.81,P＜ 0.01）were both significantly lower in the yeast form group with dexamethasone pretreatment than in that without dexamethasone pretreatment.ConclusionIn vitrotreatment with the yeast form ofSporothrix schenckiican enhance the expression of IL?6 in human THP?1 macrophage?like cells by activating the p38MAPK signaling pathway.

Sporothrix;Macrophages;Interleukin?6;p38 Mitogen?activated protein kinases

李岷，Emal：drlimin@sina.cn；陳青，Email：qngchen@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.08.004

國家自然科學(xué)基金（81502739）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20150068）；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院協(xié)和青年基金（3332016108）；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金（1002?01?18）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81502739）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20150068）;PUMC Youth Fund（3332016108）;PUMC Innovation Fund（1002?01?18）

2016?09?13）

（本文編輯：顏艷）